引用本文： 陳澤鵬, 章瑩, 林澤楓, 葉翔凌, 張永強, 夏遠軍, 夏虹, 尹慶水. 硫酸葡聚糖/重組人 BMP-2/殼聚糖復合微球聯合珊瑚羥基磷灰石人造骨修復大段骨缺損影像學評價. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(11): 1384-1389. doi: 10.7507/1002-1892.201703094 復制
骨缺損的治療是長期困擾臨床工作的難題，采用自體骨修復骨缺損是最常用方法，具有吸收快、特異性小、成骨效果好、不產生排斥反應等優點，但取骨過程會對患者造成一定程度創傷，并可能發生取骨處感染及皮膚瘢痕等問題，使其來源受限；同種及異種異體骨雖然來源廣泛，但存在價格昂貴、發生免疫排斥反應以及消毒滅菌不徹底導致的疾病傳染風險。人工骨因具有取材廣泛、可塑性強、生物相容性好、可降解性、可消毒滅菌、操作簡便等優點，而受到骨科醫師青睞。本課題組前期已成功制備了硫酸葡聚糖/重組人 BMP-2/殼聚糖（dextran sulfate/recombinant human BMP-2/chitosan，DS/rhBMP-2/CS）緩釋微球，經驗證其具有優良的生物安全性[1-2]。體外實驗結果顯示[3]，DS/rhBMP-2/CS 緩釋微球粒徑為（217±8）nm，符合納米級要求；包封率 85.6%±3%，載藥量（47.245±3.321）μg/mg；體外釋放 2 h 后出現突釋期，2 d 后釋放達高峰，之后緩慢下降，釋放周期約 28 d。異位成骨實驗中，將 DS/rhBMP-2/CS 緩釋微球植入 SD 大鼠肌袋內，結果表明，4～16 周植入 DSs/rhBMP-2/CS 的緩釋微球組較單純 rhBMP-2 組植入區周圍組織質地硬度高，成骨骨塊直徑更大，并可見骨膜和血管長入[4]。珊瑚羥基磷灰石（coral hydroxyapatite，CHA）作為無機植骨材料，其具有骨傳導性是公認的。單純 CS 培養的 BMSCs 形態呈球形，而羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）-CS 培養的細胞形態呈紡錘狀，因添加的 HA 加強了細胞黏附性[5]。但無機材料本身的脆性、可塑性差等原因，限制了其在骨組織工程中的應用。在上述研究基礎上，本研究將 DS/rhBMP-2/CS 緩釋微球結合 CHA 進行大段骨缺損的成骨研究，對成骨效果進行影像學評估。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、試劑、儀器
24 周齡雄性新西蘭大白兔 57 只，體質量 2.0～2.5 kg，購自廣州軍區廣州總醫院實驗動物中心。所有動物實驗流程均符合倫理道德要求，經中國人民解放軍廣州總醫院倫理委員會批準。
CS[相對分子質量為（50～190）×103，脫乙酰度 85%]，DS（相對分子質量 500×103，硫含量 40%～50%）（Sigma 公司，美國）；rhBMP-2（上海瑞邦生物材料有限公司）；CHA（大小 20 mm×5 mm×5 mm，平均孔徑 500 μm，孔隙率 65%，密度 0.9 g/mL，表面積 1.5 m2/g，抗壓強度 4.0 MPa；北京意華健科貿有限責任公司）；冰乙酸（相對分子質量 60.05；上海潤捷化學試劑有限公司）；ZnSO4（用二次蒸餾水配制成 1 mol/L 的儲備液）；甘露醇（天津大茂化學試劑廠）；EDTA 脫鈣液（武漢博士德生物工程有限公司）。所有化學試劑在使用前未進一步純化。
JB-2 型恒溫磁力攪拌器（上海雷磁儀器廠）；單道手動 100～1 000 μL DRAGON 移液器（上海賽伯樂儀器有限公司）；移液槍頭（Kirgen 公司，美國）；電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；KQ-250 DB 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；50 mL 一次性無菌離心管（JET BIOFIL 公司）；0.22 μm 和 0.45 μm 針頭過濾器（Pall 公司，美國）；20 mL 一次性注射器、1 cm 欖型聚四氟乙烯攪拌子、微量分析型超純水機（重慶艾科浦科技有限公司）；冷凍干燥器（Labconco 公司，美國）；超低溫冰箱（Haier 集團）；超凈工作臺、擺鋸、7.9 mm 鋸片（廈門大博穎精醫療器械有限公司）；Aloka Latheta LCT-200 Micro-CT 機（Hitachi 公司，日本）。
1.2 DS/rhBMP-2/CS/CHA 和 rhBMP-2/CHA 人工骨制備
取一定量 CS 溶于 0.175% 乙酸中，配成 1 mg/mL CS 溶液，用 0.45 μm 和 0.22 μm 針頭過濾器依次過濾。稱取適量 DS 溶于雙蒸水，配成 1 mg/mL DS 溶液，再用 0.45 μm 和 0.22 μm 濾膜依次過濾。無菌條件下，取 2.08 mL DS 溶液在 1 500 r/min 轉速下攪拌，加入 100 μg rhBMP-2，攪拌 20 min；加入 1.04 mL CS 溶液，攪拌 5 min；加入 0.1 mL ZnSO4，持續攪拌 30 min；加入 5% 甘露醇后持續攪拌均勻，將 CHA 投入溶液中充分浸泡后，轉入–80℃ 超低溫冰箱中預凍 24 h 后，轉移至冷凍干燥器凍干，制成 DS/rhBMP-2/CS/CHA（長度 20 mm）人工骨，備用。
另外于無菌條件下，將 1 mg rhBMP-2 與雙蒸水配成 0.1 mg/mL rhBMP-2 溶液；將 CHA 投入溶液中充分浸泡后，轉入–80℃ 超低溫冰箱中預凍 24 h，轉移至冷凍干燥器凍干，制成 rhBMP-2/CHA（長度 20 mm）人工骨，備用。
1.3 實驗分組及方法
取 54 只實驗動物按隨機數字表法隨機分為 3 組，每組 18 只，A 組為 CHA 組，B 組為 DS/rhBMP-2/CS/CHA 組，C 組為 rhBMP-2/CHA 組；另設 3 只動物作為空白對照組（D 組），以驗證臨界骨愈合長度。所有動物以 3% 戊巴比妥（1 mL/kg）耳緣靜脈注射麻醉，剔除右前肢毛發，側臥位，上止血帶；手術切口周圍注射少量利多卡因局部麻醉；于右前肢中段外側作一長約 3.0 cm 縱切口，鈍性分離淺深筋膜，避開血管，暴露中段橈骨，直視下截取長 20 mm 的橈骨，去除骨膜，沖洗術區。A、B、C 組骨缺損區分別植入 CHA、DS/rhBMP-2/CS/CHA、rhBMP-2/CHA 人工骨，D 組不植入材料。逐層縫合切口，去除止血帶，包扎。術后連續肌肉注射青霉素（8 萬 U/kg）3 d，觀察切口情況，術后 7 d 拆線，分籠獨立正常喂養。
1.4 觀測指標
1.4.1 X 線片觀察
術后 4、8、12 周 A、B、C 組各取 6 只動物，D 組于每個時間點各取 1 只動物。以 3% 戊巴比妥耳緣靜脈大劑量注射處死，截取右前肢移植段骨標本，行 X 線側位掃描，掃描參數：電壓 80 kV，電流 0.5 mA。采用 Lane-Sandhu X 線評分標準從新骨形成、骨連接及骨塑形三方面進行骨愈合評價。
1.4.2 Micro-CT 掃描及三維重建觀察
獲取的標本采用 Micro-CT 進行掃描，掃描參數：電壓 80 kV，電流 0.5 mA，層厚 48 μm，分辨率 48 μm，角度 180°。掃描后圖像使用 Mimics16.0 軟件通過自動劃分新生骨和材料灰度值后進行三維重建，并計算新生骨體積。
1.5 統計學分析
采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 術后觀察
所有實驗動物術后均未發現傷口化膿感染，飲食及活動正常；傷口拆線后愈合良好，未見術口崩開及移植物暴露等情況；術后生命體征均平穩，恢復良好。
2.2 X 線片觀察
術后 4 周，A 組材料與自體骨之間骨折線較清晰；B、C 組骨折線已模糊，同時兩斷端伴有新生軟骨組織影；D 組骨缺損明顯。術后 8 周，A～C 組材料影均較 4 周時有一定程度減低，其中 A 組材料骨折線已模糊；B 組骨缺損愈合結合良好，材料透射影接近自體骨；C 組材料透射影仍明顯，但材料與自體骨結合良好；D 組骨缺損未見愈合，斷端硬化。術后 12 周，A 組材料結合良好，材料影明顯，但骨缺損區基本對合；B 組骨缺損區透射影接近正常骨質，骨愈合良好，逐漸出現骨髓腔（骨中顯影較低的部分），同時隨著骨生長，材料降解明顯，僅殘留少許材料，外層皮質骨已形成；C 組骨缺損區愈合良好，材料顯影仍明顯，斷端有新生骨影；D 組未見骨愈合，斷端硬化。見圖 1。
圖1
術后各時間點各組 X 線片觀察
從左至右依次為 A、B、C、D 組 a. 術后 4 周；b. 術后 8 周；c. 術后 12 周
Figure1. X-ray film observation of groups at each time points after operationFrom left to right for groups A, B, C, and D respectively a. Postoperative at 4 weeks; b. Postoperative at 8 weeks; c. Postoperative at 12 weeks
術后各時間點 B 組 X 線片評分顯著高于 A、C 組，差異有統計學意義（P<0.05）；術后 8、12 周 C 組評分高于 A 組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 2。
圖2
術后各時間點各組 X 線片評分比較
Figure2.
Comparison of X-ray film scores of groups at each time points after operation
2.3 Micro-CT 掃描及三維重建觀察
Micro-CT 掃描及三維重建觀察示，白色表示正常骨質，淺黃色表示新生骨組織或新生軟骨、骨痂。結果顯示，術后各時間點 A 組骨缺損區新生骨組織少，成骨形態差；B 組新生骨組織多，骨缺損區骨塑形良好，12 周時逐漸接近正常骨形態；C 組骨缺損區新生骨組織較多，成骨形態一般。見圖 3。
圖3
術后各時間點各組 Micro-CT 掃描及三維重建觀察
從左至右依次為 A、B、C 組 a. 術后 4 周；b. 術后 8 周；c. 術后 12 周
Figure3. Micro-CT scan and three-dimensional reconstructive observation of groups at each time points after operationFrom left to right for groups A, B, and C respectively a. Postoperative at 4 weeks; b. Postoperative at 8 weeks; c. Postoperative at 12 weeks
術后各時間點 B 組新生骨體積均顯著高于 A、C 組，差異有統計學意義（P<0.05）；術后 8 周 C 組評分高于 A 組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
術后各時間點各組新生骨體積比較
Figure4.
Comparison of new bone volume of groups at each time points after operation
3 討論
CS 與 DS 結合形成的納米緩釋載體在腫瘤[6-7]、耳鼻喉、眼科[8-9]、基因檢測、抗菌[10]、抗病毒、疫苗接種[11]等醫學領域被廣泛應用。在基質細胞衍生因子 1α（stromal cell-derived factor 1α，SDF-1α）、VEGF、FGF-2、BMP-2、溶菌酶等一類蛋白分子中都含有肝素結合位點，而 DS-CS 載體具有的 DS 外殼正好是肝素的同類物，紅外光譜研究表明[12]，含肝素結合位點的蛋白質與 DS-CS 載體可有效且緊密地結合，結合率可達 95%～100%，而且 SDF-1α、VEGF 等蛋白與 DS-CS 的結合不會影響蛋白本身的活性，反而增強了蛋白分子自身的熱穩定性。每 100 納摩爾 DS 帶電單位中，當肝素蛋白負載達到 1.5 nmol 單體或 0.75 nmol 二聚體時，DS-CS 納米級載體的形態和 Zeta 電位不會受到影響。研究表明[3, 12-13]，采用離子交聯法制備的 DS/rhBMP-2/CS 復合微球包封率為 85.6%±3%，載藥率為（47.245±3.321）μg/mg，而普通 rhBMP-2/CS 復合微球載藥率只有（33.437±2.290）μg/mg，因為 CS 與生物蛋白之間的作用為靜電作用，無法進行大量且有效的結合。而 DS/rhBMP-2/CS 緩釋微球除了 DS 與 CS、CS 與 rhBMP-2 之間的靜電作用外，經過硫酸化的葡聚糖片段能夠和 rhBMP-2 形成肝素結合位點，結合作用強，提升了 CS 載藥的穩定性。
微球自身不具備骨傳導性，所以本實驗中引入了 CHA 作為 rhBMP-2 誘導成骨的生長支架。HA 已被證實是理想的載體，能夠搭載許多藥物及具備可持續釋放的能力，同時能有效促進組織的血管化，促進組織生長[14]；HA-CS 載體能夠延緩并控制 rhBMP-2 的釋放，增強成骨效應[15]。CHA 較普通的 HA 具備更好的生物相容性、無毒性及多孔性，作為無機植骨材料，其具有的骨傳導性是公認的；但因無機材料本身的脆性、可塑性差等原因，制約了其在骨組織工程中的應用。rhBMP-2 緩釋因子與 CHA 結合互為彌補，提供了良好的骨誘導性和傳導性[15]。
rhBMP-2 主要對未分化間充質細胞和骨系細胞起到募集和分化的作用[16]。骨形成早期，rhBMP-2 促使未分化間充質細胞向骨生成中心聚集分化為骨母細胞，rhBMP-2 還可通過增強或抑制細胞內的某些特異性蛋白的分泌，促使成纖維細胞分化為成骨細胞、成肌細胞分化為肥大的軟骨細胞，并促進基質鈣化。BMP-2 維持成骨細胞特有細胞表征，誘導成骨細胞標志物水平升高。骨形成后期，BMP-2 作為一種破骨細胞分化因子與其他分化因子直接或間接刺激破骨細胞分化，參與骨的重建[17-20]。
本研究結果均表明，B 組成骨效果最滿意，由于 DS-CS 微球的緩釋作用，rhBMP-2 在各時間點呈緩慢持續釋放。骨形成初期，rhBMP-2 的釋放量最多，到骨形成中后期，B 組中的 rhBMP-2 仍在釋放并作用，穩定地發揮誘導成骨效應。伴隨骨生長的過程，B 組的人工骨材料降解可以更加徹底。在同等劑量條件下（含 rhBMP-2 均為 100 μg），成骨早期 C 組 rhBMP-2 大量釋放，成骨效應明顯；后期由于 rhBMP-2 短暫的半衰期等因素，rhBMP-2 大量失活，失去有效和持續的成骨效應，但作用效果仍優于未添加 rhBMP-2 的 A 組；A 組因缺乏生長因子，在整個骨生長周期中成骨作用緩慢，材料降解最慢。
B 組各時間點 X 線片評分及新生骨體積均優于 A、C 組。新生骨體積 Micro-CT 掃描分析結果是經系統自動劃分材料和新生骨的灰度值并計算得到，結果更客觀，且 Micro-CT 已被廣泛用于骨三維微結構及骨組織工程的定量測定。Micro-CT 掃描可更加清晰直觀地觀察組織內的新生骨情況，而 Lane-Sandhu X 線片評分結果具有一定主觀性，且 X 線片觀察以二維結果為主，不及 Micro-CT 對組織的三維評價特性[21]。所以，研究者更傾向于 Micro-CT 觀察結果。
空白對照組術后 4、8、12 周放射學上均未見到骨缺損區愈合，12 周時斷端出現硬化骨（死骨），結果表明 20 mm 的骨缺損長度未見明顯新生骨生長[22-23]。
綜上述，DS/rhBMP-2/CS/CHA 緩釋人工骨生物相容性好，成骨作用效果顯著，骨生長過程中材料降解更快且制備簡易，可為未來將骨組織工程應用于臨床治療骨缺損提供新思路。
骨缺損的治療是長期困擾臨床工作的難題，采用自體骨修復骨缺損是最常用方法，具有吸收快、特異性小、成骨效果好、不產生排斥反應等優點，但取骨過程會對患者造成一定程度創傷，并可能發生取骨處感染及皮膚瘢痕等問題，使其來源受限；同種及異種異體骨雖然來源廣泛，但存在價格昂貴、發生免疫排斥反應以及消毒滅菌不徹底導致的疾病傳染風險。人工骨因具有取材廣泛、可塑性強、生物相容性好、可降解性、可消毒滅菌、操作簡便等優點，而受到骨科醫師青睞。本課題組前期已成功制備了硫酸葡聚糖/重組人 BMP-2/殼聚糖（dextran sulfate/recombinant human BMP-2/chitosan，DS/rhBMP-2/CS）緩釋微球，經驗證其具有優良的生物安全性[1-2]。體外實驗結果顯示[3]，DS/rhBMP-2/CS 緩釋微球粒徑為（217±8）nm，符合納米級要求；包封率 85.6%±3%，載藥量（47.245±3.321）μg/mg；體外釋放 2 h 后出現突釋期，2 d 后釋放達高峰，之后緩慢下降，釋放周期約 28 d。異位成骨實驗中，將 DS/rhBMP-2/CS 緩釋微球植入 SD 大鼠肌袋內，結果表明，4～16 周植入 DSs/rhBMP-2/CS 的緩釋微球組較單純 rhBMP-2 組植入區周圍組織質地硬度高，成骨骨塊直徑更大，并可見骨膜和血管長入[4]。珊瑚羥基磷灰石（coral hydroxyapatite，CHA）作為無機植骨材料，其具有骨傳導性是公認的。單純 CS 培養的 BMSCs 形態呈球形，而羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）-CS 培養的細胞形態呈紡錘狀，因添加的 HA 加強了細胞黏附性[5]。但無機材料本身的脆性、可塑性差等原因，限制了其在骨組織工程中的應用。在上述研究基礎上，本研究將 DS/rhBMP-2/CS 緩釋微球結合 CHA 進行大段骨缺損的成骨研究，對成骨效果進行影像學評估。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、試劑、儀器
24 周齡雄性新西蘭大白兔 57 只，體質量 2.0～2.5 kg，購自廣州軍區廣州總醫院實驗動物中心。所有動物實驗流程均符合倫理道德要求，經中國人民解放軍廣州總醫院倫理委員會批準。
CS[相對分子質量為（50～190）×103，脫乙酰度 85%]，DS（相對分子質量 500×103，硫含量 40%～50%）（Sigma 公司，美國）；rhBMP-2（上海瑞邦生物材料有限公司）；CHA（大小 20 mm×5 mm×5 mm，平均孔徑 500 μm，孔隙率 65%，密度 0.9 g/mL，表面積 1.5 m2/g，抗壓強度 4.0 MPa；北京意華健科貿有限責任公司）；冰乙酸（相對分子質量 60.05；上海潤捷化學試劑有限公司）；ZnSO4（用二次蒸餾水配制成 1 mol/L 的儲備液）；甘露醇（天津大茂化學試劑廠）；EDTA 脫鈣液（武漢博士德生物工程有限公司）。所有化學試劑在使用前未進一步純化。
JB-2 型恒溫磁力攪拌器（上海雷磁儀器廠）；單道手動 100～1 000 μL DRAGON 移液器（上海賽伯樂儀器有限公司）；移液槍頭（Kirgen 公司，美國）；電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；KQ-250 DB 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；50 mL 一次性無菌離心管（JET BIOFIL 公司）；0.22 μm 和 0.45 μm 針頭過濾器（Pall 公司，美國）；20 mL 一次性注射器、1 cm 欖型聚四氟乙烯攪拌子、微量分析型超純水機（重慶艾科浦科技有限公司）；冷凍干燥器（Labconco 公司，美國）；超低溫冰箱（Haier 集團）；超凈工作臺、擺鋸、7.9 mm 鋸片（廈門大博穎精醫療器械有限公司）；Aloka Latheta LCT-200 Micro-CT 機（Hitachi 公司，日本）。
1.2 DS/rhBMP-2/CS/CHA 和 rhBMP-2/CHA 人工骨制備
取一定量 CS 溶于 0.175% 乙酸中，配成 1 mg/mL CS 溶液，用 0.45 μm 和 0.22 μm 針頭過濾器依次過濾。稱取適量 DS 溶于雙蒸水，配成 1 mg/mL DS 溶液，再用 0.45 μm 和 0.22 μm 濾膜依次過濾。無菌條件下，取 2.08 mL DS 溶液在 1 500 r/min 轉速下攪拌，加入 100 μg rhBMP-2，攪拌 20 min；加入 1.04 mL CS 溶液，攪拌 5 min；加入 0.1 mL ZnSO4，持續攪拌 30 min；加入 5% 甘露醇后持續攪拌均勻，將 CHA 投入溶液中充分浸泡后，轉入–80℃ 超低溫冰箱中預凍 24 h 后，轉移至冷凍干燥器凍干，制成 DS/rhBMP-2/CS/CHA（長度 20 mm）人工骨，備用。
另外于無菌條件下，將 1 mg rhBMP-2 與雙蒸水配成 0.1 mg/mL rhBMP-2 溶液；將 CHA 投入溶液中充分浸泡后，轉入–80℃ 超低溫冰箱中預凍 24 h，轉移至冷凍干燥器凍干，制成 rhBMP-2/CHA（長度 20 mm）人工骨，備用。
1.3 實驗分組及方法
取 54 只實驗動物按隨機數字表法隨機分為 3 組，每組 18 只，A 組為 CHA 組，B 組為 DS/rhBMP-2/CS/CHA 組，C 組為 rhBMP-2/CHA 組；另設 3 只動物作為空白對照組（D 組），以驗證臨界骨愈合長度。所有動物以 3% 戊巴比妥（1 mL/kg）耳緣靜脈注射麻醉，剔除右前肢毛發，側臥位，上止血帶；手術切口周圍注射少量利多卡因局部麻醉；于右前肢中段外側作一長約 3.0 cm 縱切口，鈍性分離淺深筋膜，避開血管，暴露中段橈骨，直視下截取長 20 mm 的橈骨，去除骨膜，沖洗術區。A、B、C 組骨缺損區分別植入 CHA、DS/rhBMP-2/CS/CHA、rhBMP-2/CHA 人工骨，D 組不植入材料。逐層縫合切口，去除止血帶，包扎。術后連續肌肉注射青霉素（8 萬 U/kg）3 d，觀察切口情況，術后 7 d 拆線，分籠獨立正常喂養。
1.4 觀測指標
1.4.1 X 線片觀察
術后 4、8、12 周 A、B、C 組各取 6 只動物，D 組于每個時間點各取 1 只動物。以 3% 戊巴比妥耳緣靜脈大劑量注射處死，截取右前肢移植段骨標本，行 X 線側位掃描，掃描參數：電壓 80 kV，電流 0.5 mA。采用 Lane-Sandhu X 線評分標準從新骨形成、骨連接及骨塑形三方面進行骨愈合評價。
1.4.2 Micro-CT 掃描及三維重建觀察
獲取的標本采用 Micro-CT 進行掃描，掃描參數：電壓 80 kV，電流 0.5 mA，層厚 48 μm，分辨率 48 μm，角度 180°。掃描后圖像使用 Mimics16.0 軟件通過自動劃分新生骨和材料灰度值后進行三維重建，并計算新生骨體積。
1.5 統計學分析
采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 術后觀察
所有實驗動物術后均未發現傷口化膿感染，飲食及活動正常；傷口拆線后愈合良好，未見術口崩開及移植物暴露等情況；術后生命體征均平穩，恢復良好。
2.2 X 線片觀察
術后 4 周，A 組材料與自體骨之間骨折線較清晰；B、C 組骨折線已模糊，同時兩斷端伴有新生軟骨組織影；D 組骨缺損明顯。術后 8 周，A～C 組材料影均較 4 周時有一定程度減低，其中 A 組材料骨折線已模糊；B 組骨缺損愈合結合良好，材料透射影接近自體骨；C 組材料透射影仍明顯，但材料與自體骨結合良好；D 組骨缺損未見愈合，斷端硬化。術后 12 周，A 組材料結合良好，材料影明顯，但骨缺損區基本對合；B 組骨缺損區透射影接近正常骨質，骨愈合良好，逐漸出現骨髓腔（骨中顯影較低的部分），同時隨著骨生長，材料降解明顯，僅殘留少許材料，外層皮質骨已形成；C 組骨缺損區愈合良好，材料顯影仍明顯，斷端有新生骨影；D 組未見骨愈合，斷端硬化。見圖 1。
圖1
術后各時間點各組 X 線片觀察
從左至右依次為 A、B、C、D 組 a. 術后 4 周；b. 術后 8 周；c. 術后 12 周
Figure1. X-ray film observation of groups at each time points after operationFrom left to right for groups A, B, C, and D respectively a. Postoperative at 4 weeks; b. Postoperative at 8 weeks; c. Postoperative at 12 weeks
術后各時間點 B 組 X 線片評分顯著高于 A、C 組，差異有統計學意義（P<0.05）；術后 8、12 周 C 組評分高于 A 組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 2。
圖2
術后各時間點各組 X 線片評分比較
Figure2.
Comparison of X-ray film scores of groups at each time points after operation
2.3 Micro-CT 掃描及三維重建觀察
Micro-CT 掃描及三維重建觀察示，白色表示正常骨質，淺黃色表示新生骨組織或新生軟骨、骨痂。結果顯示，術后各時間點 A 組骨缺損區新生骨組織少，成骨形態差；B 組新生骨組織多，骨缺損區骨塑形良好，12 周時逐漸接近正常骨形態；C 組骨缺損區新生骨組織較多，成骨形態一般。見圖 3。
圖3
術后各時間點各組 Micro-CT 掃描及三維重建觀察
從左至右依次為 A、B、C 組 a. 術后 4 周；b. 術后 8 周；c. 術后 12 周
Figure3. Micro-CT scan and three-dimensional reconstructive observation of groups at each time points after operationFrom left to right for groups A, B, and C respectively a. Postoperative at 4 weeks; b. Postoperative at 8 weeks; c. Postoperative at 12 weeks
術后各時間點 B 組新生骨體積均顯著高于 A、C 組，差異有統計學意義（P<0.05）；術后 8 周 C 組評分高于 A 組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
術后各時間點各組新生骨體積比較
Figure4.
Comparison of new bone volume of groups at each time points after operation
3 討論
CS 與 DS 結合形成的納米緩釋載體在腫瘤[6-7]、耳鼻喉、眼科[8-9]、基因檢測、抗菌[10]、抗病毒、疫苗接種[11]等醫學領域被廣泛應用。在基質細胞衍生因子 1α（stromal cell-derived factor 1α，SDF-1α）、VEGF、FGF-2、BMP-2、溶菌酶等一類蛋白分子中都含有肝素結合位點，而 DS-CS 載體具有的 DS 外殼正好是肝素的同類物，紅外光譜研究表明[12]，含肝素結合位點的蛋白質與 DS-CS 載體可有效且緊密地結合，結合率可達 95%～100%，而且 SDF-1α、VEGF 等蛋白與 DS-CS 的結合不會影響蛋白本身的活性，反而增強了蛋白分子自身的熱穩定性。每 100 納摩爾 DS 帶電單位中，當肝素蛋白負載達到 1.5 nmol 單體或 0.75 nmol 二聚體時，DS-CS 納米級載體的形態和 Zeta 電位不會受到影響。研究表明[3, 12-13]，采用離子交聯法制備的 DS/rhBMP-2/CS 復合微球包封率為 85.6%±3%，載藥率為（47.245±3.321）μg/mg，而普通 rhBMP-2/CS 復合微球載藥率只有（33.437±2.290）μg/mg，因為 CS 與生物蛋白之間的作用為靜電作用，無法進行大量且有效的結合。而 DS/rhBMP-2/CS 緩釋微球除了 DS 與 CS、CS 與 rhBMP-2 之間的靜電作用外，經過硫酸化的葡聚糖片段能夠和 rhBMP-2 形成肝素結合位點，結合作用強，提升了 CS 載藥的穩定性。
微球自身不具備骨傳導性，所以本實驗中引入了 CHA 作為 rhBMP-2 誘導成骨的生長支架。HA 已被證實是理想的載體，能夠搭載許多藥物及具備可持續釋放的能力，同時能有效促進組織的血管化，促進組織生長[14]；HA-CS 載體能夠延緩并控制 rhBMP-2 的釋放，增強成骨效應[15]。CHA 較普通的 HA 具備更好的生物相容性、無毒性及多孔性，作為無機植骨材料，其具有的骨傳導性是公認的；但因無機材料本身的脆性、可塑性差等原因，制約了其在骨組織工程中的應用。rhBMP-2 緩釋因子與 CHA 結合互為彌補，提供了良好的骨誘導性和傳導性[15]。
rhBMP-2 主要對未分化間充質細胞和骨系細胞起到募集和分化的作用[16]。骨形成早期，rhBMP-2 促使未分化間充質細胞向骨生成中心聚集分化為骨母細胞，rhBMP-2 還可通過增強或抑制細胞內的某些特異性蛋白的分泌，促使成纖維細胞分化為成骨細胞、成肌細胞分化為肥大的軟骨細胞，并促進基質鈣化。BMP-2 維持成骨細胞特有細胞表征，誘導成骨細胞標志物水平升高。骨形成后期，BMP-2 作為一種破骨細胞分化因子與其他分化因子直接或間接刺激破骨細胞分化，參與骨的重建[17-20]。
本研究結果均表明，B 組成骨效果最滿意，由于 DS-CS 微球的緩釋作用，rhBMP-2 在各時間點呈緩慢持續釋放。骨形成初期，rhBMP-2 的釋放量最多，到骨形成中后期，B 組中的 rhBMP-2 仍在釋放并作用，穩定地發揮誘導成骨效應。伴隨骨生長的過程，B 組的人工骨材料降解可以更加徹底。在同等劑量條件下（含 rhBMP-2 均為 100 μg），成骨早期 C 組 rhBMP-2 大量釋放，成骨效應明顯；后期由于 rhBMP-2 短暫的半衰期等因素，rhBMP-2 大量失活，失去有效和持續的成骨效應，但作用效果仍優于未添加 rhBMP-2 的 A 組；A 組因缺乏生長因子，在整個骨生長周期中成骨作用緩慢，材料降解最慢。
B 組各時間點 X 線片評分及新生骨體積均優于 A、C 組。新生骨體積 Micro-CT 掃描分析結果是經系統自動劃分材料和新生骨的灰度值并計算得到，結果更客觀，且 Micro-CT 已被廣泛用于骨三維微結構及骨組織工程的定量測定。Micro-CT 掃描可更加清晰直觀地觀察組織內的新生骨情況，而 Lane-Sandhu X 線片評分結果具有一定主觀性，且 X 線片觀察以二維結果為主，不及 Micro-CT 對組織的三維評價特性[21]。所以，研究者更傾向于 Micro-CT 觀察結果。
空白對照組術后 4、8、12 周放射學上均未見到骨缺損區愈合，12 周時斷端出現硬化骨（死骨），結果表明 20 mm 的骨缺損長度未見明顯新生骨生長[22-23]。
綜上述，DS/rhBMP-2/CS/CHA 緩釋人工骨生物相容性好，成骨作用效果顯著，骨生長過程中材料降解更快且制備簡易，可為未來將骨組織工程應用于臨床治療骨缺損提供新思路。
