引用本文： 黃世福, 蔡風, 程昭賢, 周榮平, 郝亮. 熊果酸對人骨肉瘤細胞 U2-OS 增殖及凋亡的影響研究. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(11): 1371-1376. doi: 10.7507/1002-1892.201704089 復制
骨肉瘤是一種好發于青少年的惡性骨腫瘤，發病率居原發性骨腫瘤首位[1]。目前骨肉瘤的主要治療方法是手術和新輔助化療，但 5 年生存率仍然維持在 60%～70%[2]。研究表明，中醫藥治療腫瘤具有減少放、化療副作用以及提高患者免疫功能的優勢[3]。熊果酸又名烏索酸，屬五環三萜類化合物，主要存在于茶樹、果樹、藥用植物、香草植物及泡桐等，易于獲得和提取[4]。熊果酸具有廣泛的生物學活性，能抗氧化、抗菌消炎、抗病毒、降血糖血脂、鎮靜、增強免疫力等[5]，還對多種致癌、促癌物有抵抗作用[6]。有研究發現濃度為 10 μmol/L 和 20 μmol/L 的熊果酸能明顯抑制結腸癌細胞株 HT-29 細胞的生長[7]，還對乳腺癌、白血病、前列腺癌、肝癌等腫瘤具有抗腫瘤作用[8-12]，但熊果酸對骨肉瘤細胞的作用目前還不明確。本研究旨在觀察熊果酸對骨肉瘤細胞 U2-OS 增殖及凋亡的影響，探討其作用機制，為熊果酸用于臨床治療骨肉瘤提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
熊果酸、DMSO 均購于西格瑪奧德里奇（中國）化工有限公司。將熊果酸溶解于 DMSO 中并于－20℃ 保存。實驗前，取熊果酸溶液稀釋于 DMEM 培養基，獲得實驗所需的不同終濃度熊果酸，控制培養基中載體溶劑 DMSO 濃度為 0.1%。
DMEM（GIBCO 公司，美國）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；細胞周期檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）；Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡雙染試劑盒（上海貝博生物科技有限公司）；RIPA 裂解液（北京普利萊基因技術有限公司）；逆轉錄試劑盒、實時熒光定量試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；兔抗人 cyclin D1、Caspase-3、GAPDH 多克隆抗體（Proteintech 公司，美國）；山羊抗兔 IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司）；Trizol 試劑、化學發光檢測試劑盒（北京天根生物科技有限公司）。酶標儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]。
1.2 細胞培養及分組
實驗用人骨肉瘤細胞株 U2-OS 購自中國科學院上海生命科學研究院。將細胞置于 37℃、5%CO2 培養箱中，用含 100 U/mL 青-鏈霉素、10%FBS 的 DMEM 培養并傳代。根據熊果酸處理濃度不同，將細胞分為 4 組，分別為 0、10、20、40 μmol/L 濃度組。取 U2-OS 細胞按 1×104個/孔接種至 96 孔板，根據分組采用含不同濃度熊果酸的培養基培養。
1.3 觀測指標
1.3.1 CCK-8 法檢測細胞活力
培養 0、24、48、72 h，各組取 3 孔細胞，按照 CCK-8 試劑盒說明書處理后，酶標儀檢測 450 nm 處吸光度（A）值。
1.3.2 流式細胞術檢測細胞周期
培養 48 h，各組取 3 孔細胞，PBS 洗滌 1 次，以離心半徑 5 cm、1 000 r/min 離心 5 min，重懸細胞使其為單細胞懸液，并調整細胞濃度為 1×106個/mL，70% 乙醇固定，4℃ 保存。染色前用 PBS 洗去固定液，加 100 μL RNase A 37℃ 水浴 30 min，再加入 400 μL PI 染色混勻，4℃ 避光 30 min，用流式細胞儀檢測，記錄激發波長 488 nm 處紅色熒光。
1.3.3 流式細胞術檢測細胞凋亡
培養 48 h，各組取 3 孔細胞，以離心半徑 5 cm、1 000 r/min 離心 5 min，棄培養基，用冷 PBS 洗滌細胞 2 次，然后用 400 μL Binding Buffer 重懸浮細胞，使其為單細胞懸液，并調整細胞濃度為 1×106個/mL；在細胞懸液中加入 5 μL Annexin V-FITC，混勻后于 4℃ 避光條件下孵育 15 min；加入 10 μL PI 混勻，于 4℃ 避光條件下孵育 5 min；用流式細胞儀采集數據，并用 Cell Quest 專用軟件分析，通過計數凋亡區細胞測算細胞凋亡率。
1.3.4 實時熒光定量 PCR 檢測 cyclin D1 及 Caspase-3 mRNA 表達
培養 48 h，各組取 3 孔細胞，Trizol 試劑提取細胞總 RNA，逆轉錄試劑盒將其反轉錄成 cDNA，反應條件：37℃、15 min，85℃、5 s，隨后以此 cDNA 為模板進行 RT-PCR。PCR 反應條件：95℃、30 s；95℃、5 s，60℃、30 s，40 個循環。以 GAPDH 作為參照，采用 2–ΔΔCt法計算各目的基因相對表達量。cyclin D1、Caspase-3、GAPDH 引物均由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表 1。
表1
基因引物序列及長度
Table1.
Primer sequence and length of targeted genes
1.3.5 Western blot 檢測 cyclin D1 及 Caspase-3 蛋白表達
培養 48 h，各組取 3 孔細胞，提取細胞總蛋白，10%SDS-PAGE 膠提取適量蛋白質分離，轉移至聚偏二氟乙烯膜，封閉液封閉 1 h；將膜浸入含 1∶1 000 兔抗人 cyclin D1、Caspase-3 或 GAPDH 抗體的一抗稀釋液中，4℃ 孵育過夜；將膜取出用 TBST 液漂洗 3 次，每次 10 min，按 1∶1 000 稀釋濃度加入羊抗兔 IgG（二抗），室溫孵育 1 h；然后用 TBST 液漂洗 3 次，每次 10 min；棄漂洗液，加入化學發光試劑顯影成像，Image Lab 軟件分析蛋白條帶灰度值。以與 GAPDH 條帶灰度值的比值作為目的蛋白 cyclin D1 及 Caspase-3 前體（pro-Caspase-3）、活化的 Caspase-3（activated Caspase-3）相對表達量。
1.4 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用 Tukey 法或 Dunnett-t 法；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 CCK-8 法檢測細胞活力
培養 0、24 h 時，各組 A 值比較差異無統計學意義（P>0.05）；48、72 h 時，隨濃度增加，A 值逐漸減小，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 1。
圖1
CCK-8 法檢測各組 U2-OS 細胞增殖情況
Figure1.
The proliferation of U2-OS cells were detected by CCK-8 assay
2.2 流式細胞術檢測細胞周期及凋亡
隨濃度增加，U2-OS 細胞的 G1 期增加、S 期及 G2/M 期減少，細胞凋亡率逐漸增加；各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 2、3 及表 2。
表2
各組細胞周期及細胞凋亡率比較（n=3，%，
）
Table2.
Comparison of cell cycle and apoptosis rate between groups (n=3, %,
)
圖2
流式細胞術檢測各組細胞周期
a. 0 μmol/L 組；b. 10 μmol/L 組；c. 20 μmol/L 組；d. 40 μmol/L 組
Figure2. The cell cycle of each group was detected by flow cytometrya. 0 μmol/L group; b. 10 μmol/L group; c. 20 μmol/L group; d. 40 μmol/L group
圖3
流式細胞術檢測各組細胞凋亡
a. 0 μmol/L 組；b. 10 μmol/L 組；c. 20 μmol/L 組；d. 40 μmol/L 組
Figure3. The cell apoptosis was detected by flow cytometrya. 0 μmol/L group; b. 10 μmol/L group; c. 20 μmol/L group; d. 40 μmol/L group
2.3 實時熒光定量 PCR 檢測 cyclin D1 及 Caspase-3 mRNA 表達
與 0 μmol/L 組相比，10、20、40 μmol/L 組 cyclin D1 mRNA 相對表達量明顯下調，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。各組間 Caspase-3 mRNA 相對表達量比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 4。
圖4
實時熒光定量 RT-PCR 檢測各組 cyclin D1 及 Caspase-3 mRNA 相對表達量
a. cyclin D1；b. Caspase-3
Figure4. The relative expressions of cyclin D1 and Caspase-3 mRNA were detected by real-time fluorescent quantitative PCRa. cyclin D1; b. Caspase-3
2.4 Western blot 檢測 cyclin D1 及 Caspase-3 蛋白表達
隨濃度增加，各組 cyclin D1、pro-Caspase-3 蛋白相對表達量下調，activated Caspase-3 蛋白相對表達量增加，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 5、表 3。
表3
各組 cyclin D1 及 Caspase-3 蛋白相對表達量比較（n=3，
）
Table3.
Comparison of relative expressions of cyclin D1 and Cas-pase-3 proteins between groups (n=3,
)
圖5
Western blot 檢測各組 cyclin D1 及 Caspase-3 蛋白表達
1：0 μmol/L 組 2：10 μmol/L 組 3：20 μmol/L 組4：40 μmol/L 組 a. cyclin D1；b. Caspase-3
Figure5. The protein expressions of cyclin D1 and Caspase-3 were detected by Western blot1: 0 μmol/L group 2: 10 μmol/L group 3: 20 μmol/L group 4: 40 μmol/L group a. cyclin D1; b. Caspase-3
3 討論
近年來，熊果酸因具有抗腫瘤作用而日益受到關注。一項最新的一期藥代動力學研究已經獲得了熊果酸藥物作用劑量，并證實了重復使用熊果酸不會導致體內堆積[13]。然而，熊果酸具體的抗腫瘤作用機制仍不清楚，需要深入研究。
許多研究已經表明，熊果酸能夠抑制腫瘤細胞的增殖，并誘導其凋亡 [14-16]。我們實驗也發現，熊果酸能夠抑制骨肉瘤細胞 U2-OS 的增殖，使細胞周期阻滯在 G1 期，誘導細胞凋亡增加，而且熊果酸濃度越高，對骨肉瘤細胞增殖抑制作用越強，細胞凋亡率越高。值得注意的是，因為我們使用的熊果酸是中藥提純后的單體藥物，需要經過一定的反應時間才能發揮刺激細胞作用，進而引起細胞內發生改變。所以在培養前 24 h 內，未觀測到熊果酸對骨肉瘤細胞增殖的影響；但 48 h 后熊果酸處理組細胞增殖能力明顯下降，說明熊果酸能抑制骨肉瘤細胞的增殖。然而，我們只在體外實驗中發現了熊果酸對骨肉瘤細胞的增殖抑制和促進凋亡的作用，還缺少在體實驗證據，有待于進一步研究。
細胞無限增殖是腫瘤形成的十大特征之一，導致腫瘤細胞無限增殖的主要原因有兩個，一個是腫瘤細胞周期調節失控，另一個是腫瘤細胞正常的凋亡過程被抑制。本實驗中我們發現熊果酸能抑制 U2-OS 細胞增殖。為了解釋這個現象，我們檢測不同濃度處理組細胞周期蛋白 cyclin D1 和凋亡相關蛋白 Caspase-3 的表達，因為 cyclin D1 是調控細胞周期 G1期的關鍵蛋白，當 cyclin D1 表達下降時細胞將不容易通過 G1 期檢查點，從而導致細胞周期阻滯在 G1 期[16]；而 Caspase-3 能切斷與 DNA 修復、基因完整性監護有關的多聚 ADP 核糖聚合酶，從而觸發細胞凋亡[17]。熊果酸處理后的 U2-OS 細胞其 cyclin D1 表達量明顯下降，且濃度越高 cyclin D1 下降越明顯。這與流式檢測細胞周期結果一致，熊果酸使細胞中 cyclin D1 表達量下調，從而使細胞周期阻滯在 G1 期。而另一方面，熊果酸處理后雖然不能改變細胞 Caspase-3 mRNA 的表達，但是能使 activated Caspase-3 蛋白表達升高。而真正發揮剪切功能的正是 activated Caspase-3，從而導致細胞發生凋亡，這也與流式檢測細胞凋亡發現的結果一致。本實驗發現熊果酸是通過下調 cyclin D1 的表達以及激活 Caspase-3 使得骨肉瘤細胞增殖抑制、凋亡增加，從而發揮抑制骨肉瘤的作用。然而，熊果酸調控 cyclin D1 和 Caspase-3 具體機制還有待深入研究。
綜上述，本實驗驗證了熊果酸能夠使骨肉瘤細胞 U2-OS 的增殖受到抑制，同時證明了熊果酸是通過下調 cyclin D1 的表達使 U2-OS 細胞周期阻滯在 G1 期、促進 Caspase-3 的活化，進而使細胞凋亡增加。
骨肉瘤是一種好發于青少年的惡性骨腫瘤，發病率居原發性骨腫瘤首位[1]。目前骨肉瘤的主要治療方法是手術和新輔助化療，但 5 年生存率仍然維持在 60%～70%[2]。研究表明，中醫藥治療腫瘤具有減少放、化療副作用以及提高患者免疫功能的優勢[3]。熊果酸又名烏索酸，屬五環三萜類化合物，主要存在于茶樹、果樹、藥用植物、香草植物及泡桐等，易于獲得和提取[4]。熊果酸具有廣泛的生物學活性，能抗氧化、抗菌消炎、抗病毒、降血糖血脂、鎮靜、增強免疫力等[5]，還對多種致癌、促癌物有抵抗作用[6]。有研究發現濃度為 10 μmol/L 和 20 μmol/L 的熊果酸能明顯抑制結腸癌細胞株 HT-29 細胞的生長[7]，還對乳腺癌、白血病、前列腺癌、肝癌等腫瘤具有抗腫瘤作用[8-12]，但熊果酸對骨肉瘤細胞的作用目前還不明確。本研究旨在觀察熊果酸對骨肉瘤細胞 U2-OS 增殖及凋亡的影響，探討其作用機制，為熊果酸用于臨床治療骨肉瘤提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
熊果酸、DMSO 均購于西格瑪奧德里奇（中國）化工有限公司。將熊果酸溶解于 DMSO 中并于－20℃ 保存。實驗前，取熊果酸溶液稀釋于 DMEM 培養基，獲得實驗所需的不同終濃度熊果酸，控制培養基中載體溶劑 DMSO 濃度為 0.1%。
DMEM（GIBCO 公司，美國）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；細胞周期檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）；Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡雙染試劑盒（上海貝博生物科技有限公司）；RIPA 裂解液（北京普利萊基因技術有限公司）；逆轉錄試劑盒、實時熒光定量試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；兔抗人 cyclin D1、Caspase-3、GAPDH 多克隆抗體（Proteintech 公司，美國）；山羊抗兔 IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司）；Trizol 試劑、化學發光檢測試劑盒（北京天根生物科技有限公司）。酶標儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]。
1.2 細胞培養及分組
實驗用人骨肉瘤細胞株 U2-OS 購自中國科學院上海生命科學研究院。將細胞置于 37℃、5%CO2 培養箱中，用含 100 U/mL 青-鏈霉素、10%FBS 的 DMEM 培養并傳代。根據熊果酸處理濃度不同，將細胞分為 4 組，分別為 0、10、20、40 μmol/L 濃度組。取 U2-OS 細胞按 1×104個/孔接種至 96 孔板，根據分組采用含不同濃度熊果酸的培養基培養。
1.3 觀測指標
1.3.1 CCK-8 法檢測細胞活力
培養 0、24、48、72 h，各組取 3 孔細胞，按照 CCK-8 試劑盒說明書處理后，酶標儀檢測 450 nm 處吸光度（A）值。
1.3.2 流式細胞術檢測細胞周期
培養 48 h，各組取 3 孔細胞，PBS 洗滌 1 次，以離心半徑 5 cm、1 000 r/min 離心 5 min，重懸細胞使其為單細胞懸液，并調整細胞濃度為 1×106個/mL，70% 乙醇固定，4℃ 保存。染色前用 PBS 洗去固定液，加 100 μL RNase A 37℃ 水浴 30 min，再加入 400 μL PI 染色混勻，4℃ 避光 30 min，用流式細胞儀檢測，記錄激發波長 488 nm 處紅色熒光。
1.3.3 流式細胞術檢測細胞凋亡
培養 48 h，各組取 3 孔細胞，以離心半徑 5 cm、1 000 r/min 離心 5 min，棄培養基，用冷 PBS 洗滌細胞 2 次，然后用 400 μL Binding Buffer 重懸浮細胞，使其為單細胞懸液，并調整細胞濃度為 1×106個/mL；在細胞懸液中加入 5 μL Annexin V-FITC，混勻后于 4℃ 避光條件下孵育 15 min；加入 10 μL PI 混勻，于 4℃ 避光條件下孵育 5 min；用流式細胞儀采集數據，并用 Cell Quest 專用軟件分析，通過計數凋亡區細胞測算細胞凋亡率。
1.3.4 實時熒光定量 PCR 檢測 cyclin D1 及 Caspase-3 mRNA 表達
培養 48 h，各組取 3 孔細胞，Trizol 試劑提取細胞總 RNA，逆轉錄試劑盒將其反轉錄成 cDNA，反應條件：37℃、15 min，85℃、5 s，隨后以此 cDNA 為模板進行 RT-PCR。PCR 反應條件：95℃、30 s；95℃、5 s，60℃、30 s，40 個循環。以 GAPDH 作為參照，采用 2–ΔΔCt法計算各目的基因相對表達量。cyclin D1、Caspase-3、GAPDH 引物均由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表 1。
表1
基因引物序列及長度
Table1.
Primer sequence and length of targeted genes
1.3.5 Western blot 檢測 cyclin D1 及 Caspase-3 蛋白表達
培養 48 h，各組取 3 孔細胞，提取細胞總蛋白，10%SDS-PAGE 膠提取適量蛋白質分離，轉移至聚偏二氟乙烯膜，封閉液封閉 1 h；將膜浸入含 1∶1 000 兔抗人 cyclin D1、Caspase-3 或 GAPDH 抗體的一抗稀釋液中，4℃ 孵育過夜；將膜取出用 TBST 液漂洗 3 次，每次 10 min，按 1∶1 000 稀釋濃度加入羊抗兔 IgG（二抗），室溫孵育 1 h；然后用 TBST 液漂洗 3 次，每次 10 min；棄漂洗液，加入化學發光試劑顯影成像，Image Lab 軟件分析蛋白條帶灰度值。以與 GAPDH 條帶灰度值的比值作為目的蛋白 cyclin D1 及 Caspase-3 前體（pro-Caspase-3）、活化的 Caspase-3（activated Caspase-3）相對表達量。
1.4 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用 Tukey 法或 Dunnett-t 法；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 CCK-8 法檢測細胞活力
培養 0、24 h 時，各組 A 值比較差異無統計學意義（P>0.05）；48、72 h 時，隨濃度增加，A 值逐漸減小，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 1。
圖1
CCK-8 法檢測各組 U2-OS 細胞增殖情況
Figure1.
The proliferation of U2-OS cells were detected by CCK-8 assay
2.2 流式細胞術檢測細胞周期及凋亡
隨濃度增加，U2-OS 細胞的 G1 期增加、S 期及 G2/M 期減少，細胞凋亡率逐漸增加；各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 2、3 及表 2。
表2
各組細胞周期及細胞凋亡率比較（n=3，%，
）
Table2.
Comparison of cell cycle and apoptosis rate between groups (n=3, %,
)
圖2
流式細胞術檢測各組細胞周期
a. 0 μmol/L 組；b. 10 μmol/L 組；c. 20 μmol/L 組；d. 40 μmol/L 組
Figure2. The cell cycle of each group was detected by flow cytometrya. 0 μmol/L group; b. 10 μmol/L group; c. 20 μmol/L group; d. 40 μmol/L group
圖3
流式細胞術檢測各組細胞凋亡
a. 0 μmol/L 組；b. 10 μmol/L 組；c. 20 μmol/L 組；d. 40 μmol/L 組
Figure3. The cell apoptosis was detected by flow cytometrya. 0 μmol/L group; b. 10 μmol/L group; c. 20 μmol/L group; d. 40 μmol/L group
2.3 實時熒光定量 PCR 檢測 cyclin D1 及 Caspase-3 mRNA 表達
與 0 μmol/L 組相比，10、20、40 μmol/L 組 cyclin D1 mRNA 相對表達量明顯下調，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。各組間 Caspase-3 mRNA 相對表達量比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 4。
圖4
實時熒光定量 RT-PCR 檢測各組 cyclin D1 及 Caspase-3 mRNA 相對表達量
a. cyclin D1；b. Caspase-3
Figure4. The relative expressions of cyclin D1 and Caspase-3 mRNA were detected by real-time fluorescent quantitative PCRa. cyclin D1; b. Caspase-3
2.4 Western blot 檢測 cyclin D1 及 Caspase-3 蛋白表達
隨濃度增加，各組 cyclin D1、pro-Caspase-3 蛋白相對表達量下調，activated Caspase-3 蛋白相對表達量增加，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 5、表 3。
表3
各組 cyclin D1 及 Caspase-3 蛋白相對表達量比較（n=3，
）
Table3.
Comparison of relative expressions of cyclin D1 and Cas-pase-3 proteins between groups (n=3,
)
圖5
Western blot 檢測各組 cyclin D1 及 Caspase-3 蛋白表達
1：0 μmol/L 組 2：10 μmol/L 組 3：20 μmol/L 組4：40 μmol/L 組 a. cyclin D1；b. Caspase-3
Figure5. The protein expressions of cyclin D1 and Caspase-3 were detected by Western blot1: 0 μmol/L group 2: 10 μmol/L group 3: 20 μmol/L group 4: 40 μmol/L group a. cyclin D1; b. Caspase-3
3 討論
近年來，熊果酸因具有抗腫瘤作用而日益受到關注。一項最新的一期藥代動力學研究已經獲得了熊果酸藥物作用劑量，并證實了重復使用熊果酸不會導致體內堆積[13]。然而，熊果酸具體的抗腫瘤作用機制仍不清楚，需要深入研究。
許多研究已經表明，熊果酸能夠抑制腫瘤細胞的增殖，并誘導其凋亡 [14-16]。我們實驗也發現，熊果酸能夠抑制骨肉瘤細胞 U2-OS 的增殖，使細胞周期阻滯在 G1 期，誘導細胞凋亡增加，而且熊果酸濃度越高，對骨肉瘤細胞增殖抑制作用越強，細胞凋亡率越高。值得注意的是，因為我們使用的熊果酸是中藥提純后的單體藥物，需要經過一定的反應時間才能發揮刺激細胞作用，進而引起細胞內發生改變。所以在培養前 24 h 內，未觀測到熊果酸對骨肉瘤細胞增殖的影響；但 48 h 后熊果酸處理組細胞增殖能力明顯下降，說明熊果酸能抑制骨肉瘤細胞的增殖。然而，我們只在體外實驗中發現了熊果酸對骨肉瘤細胞的增殖抑制和促進凋亡的作用，還缺少在體實驗證據，有待于進一步研究。
細胞無限增殖是腫瘤形成的十大特征之一，導致腫瘤細胞無限增殖的主要原因有兩個，一個是腫瘤細胞周期調節失控，另一個是腫瘤細胞正常的凋亡過程被抑制。本實驗中我們發現熊果酸能抑制 U2-OS 細胞增殖。為了解釋這個現象，我們檢測不同濃度處理組細胞周期蛋白 cyclin D1 和凋亡相關蛋白 Caspase-3 的表達，因為 cyclin D1 是調控細胞周期 G1期的關鍵蛋白，當 cyclin D1 表達下降時細胞將不容易通過 G1 期檢查點，從而導致細胞周期阻滯在 G1 期[16]；而 Caspase-3 能切斷與 DNA 修復、基因完整性監護有關的多聚 ADP 核糖聚合酶，從而觸發細胞凋亡[17]。熊果酸處理后的 U2-OS 細胞其 cyclin D1 表達量明顯下降，且濃度越高 cyclin D1 下降越明顯。這與流式檢測細胞周期結果一致，熊果酸使細胞中 cyclin D1 表達量下調，從而使細胞周期阻滯在 G1 期。而另一方面，熊果酸處理后雖然不能改變細胞 Caspase-3 mRNA 的表達，但是能使 activated Caspase-3 蛋白表達升高。而真正發揮剪切功能的正是 activated Caspase-3，從而導致細胞發生凋亡，這也與流式檢測細胞凋亡發現的結果一致。本實驗發現熊果酸是通過下調 cyclin D1 的表達以及激活 Caspase-3 使得骨肉瘤細胞增殖抑制、凋亡增加，從而發揮抑制骨肉瘤的作用。然而，熊果酸調控 cyclin D1 和 Caspase-3 具體機制還有待深入研究。
綜上述，本實驗驗證了熊果酸能夠使骨肉瘤細胞 U2-OS 的增殖受到抑制，同時證明了熊果酸是通過下調 cyclin D1 的表達使 U2-OS 細胞周期阻滯在 G1 期、促進 Caspase-3 的活化，進而使細胞凋亡增加。
