引用本文： 張洋洋, 彭效祥, 宋偉, 孫艷麗, 王魯娟, 李倩, 趙榮蘭. 核定位信號肽偶聯核激酶底物短肽修飾殼聚糖介導微小 RNA-140 對兔關節軟骨細胞作用的研究. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(10): 1256-1261. doi: 10.7507/1002-1892.201705088 復制
關節軟骨損傷是臨床骨科常見疾病，因關節軟骨缺乏血管、神經及淋巴組織，自身修復能力有限，其損傷后的有效治療是骨科一大難題。近年來，采用局部轉基因方法治療關節軟骨損傷受到較多關注[1-6]。微小 RNA（microRNA，miRNA）參與調控軟骨細胞的分化，在軟骨的生長發育過程中起著關鍵作用[7-9]。其中，miR-140 是軟骨組織中特異性表達的 miRNA，參與調控軟骨發育及維持軟骨內穩態，同時也與骨關節炎的發生發展密切相關[10-11]，但 miR-140 在修復軟骨損傷中的作用尚未明確。
基因運輸載體的選擇與治療效果密切相關，非病毒基因轉移載體殼聚糖（chitosan，CS）因具有良好的生物相容性和可生物降解性受到較多關注，但因轉染效率相對較低，限制了作為基因運輸載體的使用。許多研究者嘗試通過改性 CS 增加其攜帶外源 DNA 進入細胞的能力，在一定程度上提高了轉染效率[12-13]。本課題組前期使用核定位信號肽偶聯核激酶底物短肽（nucleus localization signal linked nucleic kinase substrate short peptide，NNS）修飾 CS（NNSCS），體外實驗結果表明 NNSCS 能夠攜帶更多的質粒 DNA（plasmid DNA，pDNA）進入細胞核并高效表達[14]。本研究選擇使用 NNSCS 攜帶外源基因 miR-140 轉染正常兔關節軟骨細胞，檢測其對軟骨細胞的作用，以期為后期體內實驗及臨床應用提供相關實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
新生新西蘭大耳白兔 10 只，雌雄不限，體質量 70～80 g，購于濟南金豐實驗動物有限公司。重組質粒 GV268-miR-140（含長度為 210 bp 的人 pri-miR-140 序列）、NNS（基序為 PKKRKVREEAIKF-SEEQRFRR），均由本實驗室構建并保存[14]；質粒 GV268（上海吉凱基因化學技術有限公司）；DMEM/F12 培養基 （GIBCO 公司，美國）；FBS（HyClone 公司，美國）；Ⅱ型膠原酶（Sigma 公司，美國）；RNAiso Plus、miRNA 逆轉錄及 SYBR Green 熒光染料定量試劑盒（Takara 公司，日本）；MTT（北京索萊寶科技有限公司）；Annexin Ⅴ-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒（Invitrogen 公司，美國）。
Sox9：上游引物 5'-TGTAGAGGACGCATT-TGGTAAG-3'，下游引物 5'-TAAGACCGCAGC- AAACCAC-3'，擴增產物 157 bp；聚集蛋白聚糖（Aggrecan）：上游引物 5'-AGAACAGCGC-CATCATTGC-3'，下游引物 5'-CTCACGCCAGGG-AACTCATC-3'，擴增產物 171 bp；組蛋白去乙酰化酶 4（histone deacetylase 4，Hdac4）：上游引物 5'-GCTCGCCCAACAACAACAG-3'，下游引物 5'-GGATGGCGACGTGTAGAGAG-3'，擴增產物 152 bp；內參基因 β2-微球蛋白（β-2-microglobulin，B2m）：上游引物 5'-AACGTGGAACAGTCA-GACC-3'，下游引物 5'-AGTAATCTCGATCCCA-TTTC-3'，擴增產物 157 bp；miR-140：上游引物 5'-CGCGCCAGTGGTTTTACCCT -3'；以上引物均由北京奧科生物技術有限公司合成。miR-140 下游引物和內參基因 U6 引物均來自定量試劑盒。
普通 PCR 儀、iQ5 熒光定量 PCR 儀、酶標儀（Bio-Rad 公司，美國）；流式細胞儀（BD 公司，美國）；倒置顯微鏡（上海光學儀器廠）；CO2 培養箱（Thermo Fisher 公司，美國）；GeneQuant100 微量分光光度計（Biochrom 公司，英國）。
1.2 實驗方法
1.2.1 NNSCS/pDNA 納米復合物的制備 將重組質粒 GV268-miR-140 和空質粒 GV268 分別與 NNSCS 按照質量比 1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5 制備 NNSCS/pDNA 納米復合物。1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示當 pDNA 與 NNSCS 的質量比≤1∶2 時，NNSCS/pDNA 納米復合物在電泳時失去了向正極泳動的能力，表明 pDNA 所攜帶的負電荷被 NNSCS 完全屏蔽（圖 1）。篩選出最佳質量比為 1∶2。參照本課題組前期報道方法[14]，制備最佳質量比 NNSCS/GV268-miR-140 和 NNSCS/GV268 納米復合物用于后續研究。
圖1
NNSCS/pDNA 納米復合物瓊脂糖凝膠電泳
1：裸 pDNA 2～8：分別為質量比為 1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5 的 NNSCS/pDNA 納米復合物
Figure1. Agarose gel electrophoresis of the NNSCS/pDNA-complexes1: Free plasmid DNA 2-8: pDNA: NNSCS (W/W)=1∶0.5, 1∶1, 1∶1.5, 1∶2, 1∶2.5, 1∶3, 1∶3.5, respectively
1.2.2 NNSCS/pDNA 納米復合物轉染關節軟骨細胞 實驗分為 3 組，分別為正常細胞對照組（A 組）、NNSCS/GV268 空載體轉染組（B 組）、NNSCS/GV268-miR-140 轉染組（C 組）。按照本課題組前期報道方法[15]，無菌條件下，取 10 只兔膝關節軟骨，采用胰蛋白酶和膠原酶聯合消化法分離培養原代軟骨細胞；37℃、5%CO2 及飽和濕度下，置于含 10%FBS 的 DMEM/F12 培養基中培養，待細胞生長至 85%～90% 融合后傳代。取第 2 代關節軟骨細胞，分別以 1×106 個/孔和 5×104 個/孔密度接種至 6 孔板和 96 孔板。待培養孔板中的細胞接近 75% 融合時，于 B、C 組中分別加入對應的 NNSCS/pDNA 納米復合物。轉染 24 h 后，棄除孔內培養液，向各孔內加入含 10 ng/mL IL-1β、10%FBS 的 DMEM/F12 培養基，放入培養箱繼續培養，于不同時間點進行相關指標檢測。其中，6 孔板中細胞用于檢測軟骨細胞凋亡及 miR-140、Sox9、Aggrecan 和 Hdac4 基因表達，96 孔板中細胞用于軟骨細胞增殖檢測。
1.3 觀測指標
1.3.1 實時熒光定量 PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，RT-qPCR）檢測軟骨細胞 miR-140 表達水平 轉染 72 h 后，每組取 6 孔，棄去孔內培養液，Trizol 法提取細胞總 RNA，使用 miRNA 逆轉錄試劑盒逆轉錄獲得 cDNA。普通 PCR 分別擴增各組 miR-140 及其內參基因 U6，擴增條件：95℃、5 min；94℃、40 s，62℃、20 s，72℃、20 s，35 個循環；72℃、5 min。1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定 PCR 擴增產物并行 DNA 序列分析。隨后 RT-qPCR 分析 cDNA 樣本，反應體系 20 μL：cDNA 模板 1.0 μL、上、下游引物（10 pmol/μL）各 1.0 μL、SYBR Green Mix 10.0 μL、滅菌雙蒸水 7.0 μL。擴增條件：95℃、10 s；95℃、5 s，60℃、20 s，72℃、20 s，40 個循環。在每個循環延伸末檢測熒光信號，計算各 cDNA 樣本的 miR-140 及 U6 的 Ct 值，將 miR-140 Ct 值與相對應的 U6 Ct 值相減得到 ?Ct 進行標準化，用于校正各樣本之間 RNA 質量及逆轉錄效率的差異，采用公式 2–??Ct計算得到 miR-140 相對表達量。
1.3.2 Annexin Ⅴ-FITC/PI 雙染色法檢測軟骨細胞凋亡 轉染 72 h 后，每組取 6 孔，用不含 EDTA 的胰蛋白酶消化并收集細胞，冷 PBS 漂洗后，100 μL 結合緩沖液重懸細胞，然后加入 5 μL Annexin Ⅴ 及 1 μL PI，室溫、避光反應 15 min，最后加入 400 μL 結合緩沖液，流式細胞儀檢測。
1.3.3 MTT 檢測軟骨細胞增殖 轉染 48 h 后，每組取 6 孔，每孔加入 15 μL MTT 溶液（5 mg/mL），同時設置不含細胞的空白調零孔。放入培養箱繼續孵育 4 h 后，棄除孔內培養液，各孔加入 150 μL DMSO 溶液，室溫振蕩 10 min 充分溶解結晶物，570 nm 波長測定吸光度（A）值，按照以下公式計算細胞增殖活力，公式為：（實驗組 A570–調零孔 A570）/（A 組 A570–調零孔 A570）×100%，其中實驗組表示 B 組或者 C 組。
1.3.4 RT-qPCR 檢測軟骨細胞內成軟骨相關基因表達 轉染 72 h 后，每組取 6 孔，棄去孔內培養液，Trizol 法提取細胞總 RNA，逆轉錄成 cDNA。RT-qPCR 分別擴增 Sox9、Aggrecan、Hdac4 及內參基因 B2m，同 1.3.1 方法操作。擴增各 cDNA 樣本后，將各基因 PCR 擴增 Ct 值與相對應內參基因 B2m 的 Ct 值相減得到 ?Ct 進行標準化[16]，以公式 2–??Ct計算得到各基因相對表達量。
1.4 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 軟骨細胞 miR-140 的表達檢測
RT-qPCR 檢測顯示，A、B、C 組 miR-140 基因相對表達量分別為（1.00±0.11）、（1.27±0.14）及（5.87±0.54）倍。其中，C 組 miR-140 表達水平較 A、B 組明顯上調，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A、B 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
2.2 Annexin Ⅴ-FITC/PI 雙染色法檢測軟骨細胞凋亡
流式細胞儀檢測示，C 組軟骨細胞凋亡率較 A、B 組明顯降低，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A、B 組間比較差異無統計學意義（P> 0.05）。見圖 2。
圖2
轉染 72 h 后 Annexin Ⅴ-FITC/PI 雙染色法檢測各組軟骨細胞凋亡
a. 從左至右分別為 A、B、C 組流式細胞圖；b. 各組細胞凋亡率比較
Figure2. Apoptosis in rabbit chondrocytes by Annexin Ⅴ-FITC/PI assay after transfected with NNSCS/pDNAcomplexes for 72 hoursa. From left to right for flow cytometry map in groups A, B, and C, respectively; b. Comparison of the apoptosis rate between groups
2.3 MTT 檢測軟骨細胞增殖
MTT 檢測示，A、B、C 組細胞增殖活力分別為 100.0%±5.6%、107.3%±5.3% 及 150.3%±10.3%。C 組軟骨細胞增殖活力較 A、B 組明顯提高，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A、B 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
2.4 RT-qPCR 檢測 Sox9、Aggrecan 和 Hdac4 基因表達
與 A、B 組比較，C 組 Sox9、Aggrecan 基因相對表達量明顯上調、Hdac4 基因相對表達量明顯下調，比較差異有統計學意義（P<0.05）； A、B 組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 3。
圖3
轉染 72 h 后 RT-qPCR 檢測各基因相對表達量
a. Sox9; b. Aggrecan; c. Hdac4
Figure3. Gene expressions in each group by RT-qPCR detection after transfected with NNSCS/pDNA for 72 hoursa. Sox9; b. Aggrecan; c. Hdac4
3 討論
在眾多基因轉移載體中，CS 因其良好的生物相容性而成為備受關注的基因運輸載體，但目前相對較低的轉染效率限制了其在基因治療中的應用。本課題組一直致力于提高 CS 的轉染效率。NNS 序列包括 1 個 SV40 核定位信號肽和 1 個潛在可磷酸化的絲氨酸殘基，此短肽在哺乳動物細胞內能夠被選擇性磷酸化。核定位信號肽可促進 CS 攜帶外源基因進入細胞核，核激酶底物短肽被核內激酶有效磷酸化，促進外源基因在核內從 CS 中解離、釋放，提高 CS 轉染效率。前期研究采用體外培養的小鼠成肌細胞 C2C12，證實 NNSCS 能夠攜帶更多的外源基因進入細胞核，并高效表達[14]。因此，本研究選擇 NNSCS 作為基因運輸載體。RT-qPCR 檢測結果顯示，NNSCS/GV268-miR-140 轉染組軟骨細胞內外源 miR-140 可高效表達，表明 NNSCS/pDNA 納米復合物可以將外源基因有效轉入軟骨細胞內。
大量研究已證實，miR-140 在正常軟骨細胞中特異性高表達，在骨關節炎軟骨細胞內的表達量明顯降低[17-18]。miR-140 基因敲除小鼠出生后骨骼發育異常，出現關節軟骨內蛋白聚糖降低及纖維化等老年性骨關節炎樣變化[10]，這些結果均表明 miR-140 在軟骨細胞生長發育和維持正常功能中發揮重要作用。在骨關節炎軟骨細胞內，致炎因子 IL-1β 能夠促進分解代謝相關基因的表達[19]，抑制內源性 miR-140 表達[20]。研究顯示通過給予 IL-1β 干預，可誘導關節軟骨細胞退變[21]。本研究在 NNSCS/pDNA 轉染 24 h 后給予 IL-1β 干預，旨在檢測 miR-140 對軟骨細胞的作用。結果顯示，外源 miR-140 的表達可以明顯抑制 IL-1β 誘導的軟骨細胞凋亡，提高軟骨細胞的增殖活力。
Sox9 是參與軟骨細胞分化和軟骨形成的主要轉錄調控因子，在關節發育期的軟骨細胞內高表達，隨著年齡的增長，表達量逐漸降低[22]。人骨關節炎早期階段的軟骨細胞內，Sox9 的表達水平增加[23]。高表達的 Sox9 能夠促進關節軟骨主要細胞外基質 Aggrecan 和Ⅱ型膠原蛋白的合成，促進軟骨損傷的修復[24]。轉錄輔阻遏物 Hdac4 在骨關節炎軟骨組織內的表達水平明顯高于正常組織[25]。在人骨關節炎軟骨細胞內，通過抑制 Hdac4 可以明顯降低 IL-1β 及 IL-1 誘導的基質金屬蛋白酶-13 等分解代謝相關基因的表達[26]。Aggrecan 是軟骨細胞外基質中具有重要作用的蛋白聚糖分子，常被用作軟骨形成的標志分子之一[27]。軟骨損傷會導致 Aggrecan 降解增加[28]。因此，維持 Aggrecan 正常結構與含量是實現軟骨損傷修復的主要途徑之一。本研究結果表明，過表達 miR-140 的軟骨細胞內，Sox9 與 Aggrecan mRNA 相對表達量顯著增加，Hdac4 mRNA 相對表達量顯著降低，在抑制 IL-1β 誘導關節軟骨細胞退變中發揮重要作用。提示 miR-140 在損傷軟骨修復過程中發揮重要作用。
綜上述，NNSCS 可攜帶外源基因 miR-140 進入體外培養的軟骨細胞并實現高效表達，高表達的 miR-140 可促進軟骨細胞的合成代謝，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，為進一步探究 miR-140 體內治療軟骨損傷奠定了良好的實驗基礎。
關節軟骨損傷是臨床骨科常見疾病，因關節軟骨缺乏血管、神經及淋巴組織，自身修復能力有限，其損傷后的有效治療是骨科一大難題。近年來，采用局部轉基因方法治療關節軟骨損傷受到較多關注[1-6]。微小 RNA（microRNA，miRNA）參與調控軟骨細胞的分化，在軟骨的生長發育過程中起著關鍵作用[7-9]。其中，miR-140 是軟骨組織中特異性表達的 miRNA，參與調控軟骨發育及維持軟骨內穩態，同時也與骨關節炎的發生發展密切相關[10-11]，但 miR-140 在修復軟骨損傷中的作用尚未明確。
基因運輸載體的選擇與治療效果密切相關，非病毒基因轉移載體殼聚糖（chitosan，CS）因具有良好的生物相容性和可生物降解性受到較多關注，但因轉染效率相對較低，限制了作為基因運輸載體的使用。許多研究者嘗試通過改性 CS 增加其攜帶外源 DNA 進入細胞的能力，在一定程度上提高了轉染效率[12-13]。本課題組前期使用核定位信號肽偶聯核激酶底物短肽（nucleus localization signal linked nucleic kinase substrate short peptide，NNS）修飾 CS（NNSCS），體外實驗結果表明 NNSCS 能夠攜帶更多的質粒 DNA（plasmid DNA，pDNA）進入細胞核并高效表達[14]。本研究選擇使用 NNSCS 攜帶外源基因 miR-140 轉染正常兔關節軟骨細胞，檢測其對軟骨細胞的作用，以期為后期體內實驗及臨床應用提供相關實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
新生新西蘭大耳白兔 10 只，雌雄不限，體質量 70～80 g，購于濟南金豐實驗動物有限公司。重組質粒 GV268-miR-140（含長度為 210 bp 的人 pri-miR-140 序列）、NNS（基序為 PKKRKVREEAIKF-SEEQRFRR），均由本實驗室構建并保存[14]；質粒 GV268（上海吉凱基因化學技術有限公司）；DMEM/F12 培養基 （GIBCO 公司，美國）；FBS（HyClone 公司，美國）；Ⅱ型膠原酶（Sigma 公司，美國）；RNAiso Plus、miRNA 逆轉錄及 SYBR Green 熒光染料定量試劑盒（Takara 公司，日本）；MTT（北京索萊寶科技有限公司）；Annexin Ⅴ-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒（Invitrogen 公司，美國）。
Sox9：上游引物 5'-TGTAGAGGACGCATT-TGGTAAG-3'，下游引物 5'-TAAGACCGCAGC- AAACCAC-3'，擴增產物 157 bp；聚集蛋白聚糖（Aggrecan）：上游引物 5'-AGAACAGCGC-CATCATTGC-3'，下游引物 5'-CTCACGCCAGGG-AACTCATC-3'，擴增產物 171 bp；組蛋白去乙酰化酶 4（histone deacetylase 4，Hdac4）：上游引物 5'-GCTCGCCCAACAACAACAG-3'，下游引物 5'-GGATGGCGACGTGTAGAGAG-3'，擴增產物 152 bp；內參基因 β2-微球蛋白（β-2-microglobulin，B2m）：上游引物 5'-AACGTGGAACAGTCA-GACC-3'，下游引物 5'-AGTAATCTCGATCCCA-TTTC-3'，擴增產物 157 bp；miR-140：上游引物 5'-CGCGCCAGTGGTTTTACCCT -3'；以上引物均由北京奧科生物技術有限公司合成。miR-140 下游引物和內參基因 U6 引物均來自定量試劑盒。
普通 PCR 儀、iQ5 熒光定量 PCR 儀、酶標儀（Bio-Rad 公司，美國）；流式細胞儀（BD 公司，美國）；倒置顯微鏡（上海光學儀器廠）；CO2 培養箱（Thermo Fisher 公司，美國）；GeneQuant100 微量分光光度計（Biochrom 公司，英國）。
1.2 實驗方法
1.2.1 NNSCS/pDNA 納米復合物的制備 將重組質粒 GV268-miR-140 和空質粒 GV268 分別與 NNSCS 按照質量比 1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5 制備 NNSCS/pDNA 納米復合物。1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示當 pDNA 與 NNSCS 的質量比≤1∶2 時，NNSCS/pDNA 納米復合物在電泳時失去了向正極泳動的能力，表明 pDNA 所攜帶的負電荷被 NNSCS 完全屏蔽（圖 1）。篩選出最佳質量比為 1∶2。參照本課題組前期報道方法[14]，制備最佳質量比 NNSCS/GV268-miR-140 和 NNSCS/GV268 納米復合物用于后續研究。
圖1
NNSCS/pDNA 納米復合物瓊脂糖凝膠電泳
1：裸 pDNA 2～8：分別為質量比為 1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5 的 NNSCS/pDNA 納米復合物
Figure1. Agarose gel electrophoresis of the NNSCS/pDNA-complexes1: Free plasmid DNA 2-8: pDNA: NNSCS (W/W)=1∶0.5, 1∶1, 1∶1.5, 1∶2, 1∶2.5, 1∶3, 1∶3.5, respectively
1.2.2 NNSCS/pDNA 納米復合物轉染關節軟骨細胞 實驗分為 3 組，分別為正常細胞對照組（A 組）、NNSCS/GV268 空載體轉染組（B 組）、NNSCS/GV268-miR-140 轉染組（C 組）。按照本課題組前期報道方法[15]，無菌條件下，取 10 只兔膝關節軟骨，采用胰蛋白酶和膠原酶聯合消化法分離培養原代軟骨細胞；37℃、5%CO2 及飽和濕度下，置于含 10%FBS 的 DMEM/F12 培養基中培養，待細胞生長至 85%～90% 融合后傳代。取第 2 代關節軟骨細胞，分別以 1×106 個/孔和 5×104 個/孔密度接種至 6 孔板和 96 孔板。待培養孔板中的細胞接近 75% 融合時，于 B、C 組中分別加入對應的 NNSCS/pDNA 納米復合物。轉染 24 h 后，棄除孔內培養液，向各孔內加入含 10 ng/mL IL-1β、10%FBS 的 DMEM/F12 培養基，放入培養箱繼續培養，于不同時間點進行相關指標檢測。其中，6 孔板中細胞用于檢測軟骨細胞凋亡及 miR-140、Sox9、Aggrecan 和 Hdac4 基因表達，96 孔板中細胞用于軟骨細胞增殖檢測。
1.3 觀測指標
1.3.1 實時熒光定量 PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，RT-qPCR）檢測軟骨細胞 miR-140 表達水平 轉染 72 h 后，每組取 6 孔，棄去孔內培養液，Trizol 法提取細胞總 RNA，使用 miRNA 逆轉錄試劑盒逆轉錄獲得 cDNA。普通 PCR 分別擴增各組 miR-140 及其內參基因 U6，擴增條件：95℃、5 min；94℃、40 s，62℃、20 s，72℃、20 s，35 個循環；72℃、5 min。1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定 PCR 擴增產物并行 DNA 序列分析。隨后 RT-qPCR 分析 cDNA 樣本，反應體系 20 μL：cDNA 模板 1.0 μL、上、下游引物（10 pmol/μL）各 1.0 μL、SYBR Green Mix 10.0 μL、滅菌雙蒸水 7.0 μL。擴增條件：95℃、10 s；95℃、5 s，60℃、20 s，72℃、20 s，40 個循環。在每個循環延伸末檢測熒光信號，計算各 cDNA 樣本的 miR-140 及 U6 的 Ct 值，將 miR-140 Ct 值與相對應的 U6 Ct 值相減得到 ?Ct 進行標準化，用于校正各樣本之間 RNA 質量及逆轉錄效率的差異，采用公式 2–??Ct計算得到 miR-140 相對表達量。
1.3.2 Annexin Ⅴ-FITC/PI 雙染色法檢測軟骨細胞凋亡 轉染 72 h 后，每組取 6 孔，用不含 EDTA 的胰蛋白酶消化并收集細胞，冷 PBS 漂洗后，100 μL 結合緩沖液重懸細胞，然后加入 5 μL Annexin Ⅴ 及 1 μL PI，室溫、避光反應 15 min，最后加入 400 μL 結合緩沖液，流式細胞儀檢測。
1.3.3 MTT 檢測軟骨細胞增殖 轉染 48 h 后，每組取 6 孔，每孔加入 15 μL MTT 溶液（5 mg/mL），同時設置不含細胞的空白調零孔。放入培養箱繼續孵育 4 h 后，棄除孔內培養液，各孔加入 150 μL DMSO 溶液，室溫振蕩 10 min 充分溶解結晶物，570 nm 波長測定吸光度（A）值，按照以下公式計算細胞增殖活力，公式為：（實驗組 A570–調零孔 A570）/（A 組 A570–調零孔 A570）×100%，其中實驗組表示 B 組或者 C 組。
1.3.4 RT-qPCR 檢測軟骨細胞內成軟骨相關基因表達 轉染 72 h 后，每組取 6 孔，棄去孔內培養液，Trizol 法提取細胞總 RNA，逆轉錄成 cDNA。RT-qPCR 分別擴增 Sox9、Aggrecan、Hdac4 及內參基因 B2m，同 1.3.1 方法操作。擴增各 cDNA 樣本后，將各基因 PCR 擴增 Ct 值與相對應內參基因 B2m 的 Ct 值相減得到 ?Ct 進行標準化[16]，以公式 2–??Ct計算得到各基因相對表達量。
1.4 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 軟骨細胞 miR-140 的表達檢測
RT-qPCR 檢測顯示，A、B、C 組 miR-140 基因相對表達量分別為（1.00±0.11）、（1.27±0.14）及（5.87±0.54）倍。其中，C 組 miR-140 表達水平較 A、B 組明顯上調，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A、B 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
2.2 Annexin Ⅴ-FITC/PI 雙染色法檢測軟骨細胞凋亡
流式細胞儀檢測示，C 組軟骨細胞凋亡率較 A、B 組明顯降低，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A、B 組間比較差異無統計學意義（P> 0.05）。見圖 2。
圖2
轉染 72 h 后 Annexin Ⅴ-FITC/PI 雙染色法檢測各組軟骨細胞凋亡
a. 從左至右分別為 A、B、C 組流式細胞圖；b. 各組細胞凋亡率比較
Figure2. Apoptosis in rabbit chondrocytes by Annexin Ⅴ-FITC/PI assay after transfected with NNSCS/pDNAcomplexes for 72 hoursa. From left to right for flow cytometry map in groups A, B, and C, respectively; b. Comparison of the apoptosis rate between groups
2.3 MTT 檢測軟骨細胞增殖
MTT 檢測示，A、B、C 組細胞增殖活力分別為 100.0%±5.6%、107.3%±5.3% 及 150.3%±10.3%。C 組軟骨細胞增殖活力較 A、B 組明顯提高，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A、B 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
2.4 RT-qPCR 檢測 Sox9、Aggrecan 和 Hdac4 基因表達
與 A、B 組比較，C 組 Sox9、Aggrecan 基因相對表達量明顯上調、Hdac4 基因相對表達量明顯下調，比較差異有統計學意義（P<0.05）； A、B 組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 3。
圖3
轉染 72 h 后 RT-qPCR 檢測各基因相對表達量
a. Sox9; b. Aggrecan; c. Hdac4
Figure3. Gene expressions in each group by RT-qPCR detection after transfected with NNSCS/pDNA for 72 hoursa. Sox9; b. Aggrecan; c. Hdac4
3 討論
在眾多基因轉移載體中，CS 因其良好的生物相容性而成為備受關注的基因運輸載體，但目前相對較低的轉染效率限制了其在基因治療中的應用。本課題組一直致力于提高 CS 的轉染效率。NNS 序列包括 1 個 SV40 核定位信號肽和 1 個潛在可磷酸化的絲氨酸殘基，此短肽在哺乳動物細胞內能夠被選擇性磷酸化。核定位信號肽可促進 CS 攜帶外源基因進入細胞核，核激酶底物短肽被核內激酶有效磷酸化，促進外源基因在核內從 CS 中解離、釋放，提高 CS 轉染效率。前期研究采用體外培養的小鼠成肌細胞 C2C12，證實 NNSCS 能夠攜帶更多的外源基因進入細胞核，并高效表達[14]。因此，本研究選擇 NNSCS 作為基因運輸載體。RT-qPCR 檢測結果顯示，NNSCS/GV268-miR-140 轉染組軟骨細胞內外源 miR-140 可高效表達，表明 NNSCS/pDNA 納米復合物可以將外源基因有效轉入軟骨細胞內。
大量研究已證實，miR-140 在正常軟骨細胞中特異性高表達，在骨關節炎軟骨細胞內的表達量明顯降低[17-18]。miR-140 基因敲除小鼠出生后骨骼發育異常，出現關節軟骨內蛋白聚糖降低及纖維化等老年性骨關節炎樣變化[10]，這些結果均表明 miR-140 在軟骨細胞生長發育和維持正常功能中發揮重要作用。在骨關節炎軟骨細胞內，致炎因子 IL-1β 能夠促進分解代謝相關基因的表達[19]，抑制內源性 miR-140 表達[20]。研究顯示通過給予 IL-1β 干預，可誘導關節軟骨細胞退變[21]。本研究在 NNSCS/pDNA 轉染 24 h 后給予 IL-1β 干預，旨在檢測 miR-140 對軟骨細胞的作用。結果顯示，外源 miR-140 的表達可以明顯抑制 IL-1β 誘導的軟骨細胞凋亡，提高軟骨細胞的增殖活力。
Sox9 是參與軟骨細胞分化和軟骨形成的主要轉錄調控因子，在關節發育期的軟骨細胞內高表達，隨著年齡的增長，表達量逐漸降低[22]。人骨關節炎早期階段的軟骨細胞內，Sox9 的表達水平增加[23]。高表達的 Sox9 能夠促進關節軟骨主要細胞外基質 Aggrecan 和Ⅱ型膠原蛋白的合成，促進軟骨損傷的修復[24]。轉錄輔阻遏物 Hdac4 在骨關節炎軟骨組織內的表達水平明顯高于正常組織[25]。在人骨關節炎軟骨細胞內，通過抑制 Hdac4 可以明顯降低 IL-1β 及 IL-1 誘導的基質金屬蛋白酶-13 等分解代謝相關基因的表達[26]。Aggrecan 是軟骨細胞外基質中具有重要作用的蛋白聚糖分子，常被用作軟骨形成的標志分子之一[27]。軟骨損傷會導致 Aggrecan 降解增加[28]。因此，維持 Aggrecan 正常結構與含量是實現軟骨損傷修復的主要途徑之一。本研究結果表明，過表達 miR-140 的軟骨細胞內，Sox9 與 Aggrecan mRNA 相對表達量顯著增加，Hdac4 mRNA 相對表達量顯著降低，在抑制 IL-1β 誘導關節軟骨細胞退變中發揮重要作用。提示 miR-140 在損傷軟骨修復過程中發揮重要作用。
綜上述，NNSCS 可攜帶外源基因 miR-140 進入體外培養的軟骨細胞并實現高效表達，高表達的 miR-140 可促進軟骨細胞的合成代謝，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，為進一步探究 miR-140 體內治療軟骨損傷奠定了良好的實驗基礎。
