引用本文： 劉洋, 盧濤, 周宙霖, 盧永波, 張艷云. HaCaT 表皮模型作為皮膚刺激性體外替代實驗的可行性研究. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(10): 1262-1266. doi: 10.7507/1002-1892.201705031 復制
檢測化學品及化妝品的皮膚刺激性是毒理學評價的重要組成部分，直接影響化學品及化妝品上市和應用[1]。皮膚刺激性評價常使用動物實驗，但動物實驗存在實驗周期長、成本高、動物間個體差異性較大等缺點。隨著各國有關動物福利法律的完善和實驗動物“3R”原則（減少、優化、替代）[2]的提出，歐盟自 2009 年 3 月起全面禁止采用動物實驗進行化妝品原料和成品的安全性評價，不允許其成員國進口經動物實驗的化妝品產品[1]。
采用體外替代方法逐漸成為化妝品安全性評價和化學品毒理學評判的重要手段[3]。國際上陸續出現了 EpiSkinTM[4-5]、EpiDermTM[6-8]、SkinEthicTM[9-10]和 LabCyte[11-12]4 種體外替代檢測模型，國內目前較成熟的是 EpiKutis?檢測模型[13]。但是這些模型使用大量人原代上皮角質形成細胞，這些原代細胞獲取較困難，培養周期較長，細胞穩定性難以保證，用于細胞培養的培養基價格昂貴，構建難度較大，導致成本較高。
人永生化上皮角質形成細胞系 HaCaT 具有無限增殖能力、獲取容易、培養簡單、穩定性好、用于其培養的培養基價格低廉等優點，并且與上皮角質形成細胞具有相似的生物學特征[14]。故我們嘗試采用 HaCaT 代替人原代角質形成細胞構建檢測模型，并采用經濟合作與發展組織（OECD）TG439（2013 版）實驗流程[15-16]及推薦的 20 種化學標準品開展皮膚刺激性測試，探索 HaCaT 表皮模型能否作為替代模型進行化學品體外皮膚刺激性測試。
1 材料與方法
1.1 主要材料、試劑及儀器
HaCaT 細胞（ATCC 細胞庫）。模型構建培養液（包括細胞培養液 TU、氣-液面前期培養液 TA1、氣-液面后期培養液 TA2；由廣東博溪生物科技有限公司提供）；角質形成細胞培養液（空軍軍醫大學組織工程中心）；MTT、Triton X-100（Sigma 公司，美國）。Transwell 小室（NUNC 公司，丹麥）；CO2 培養箱、低溫冰箱（Thermo 公司，美國）；正置顯微鏡（Olympus 公司，日本）；酶標儀（Biotek 公司，美國）；電子天平（賽多利斯公司，德國）。
1.2 表皮模型構建
取 HaCaT 細胞，37℃、5%CO2 及 95% 相對濕度細胞培養箱培養，至融合率約 60% 后，將細胞接種至 Transwell 小室的聚酯纖維膜上。具體操作：按照 2.5×106個/mL 密度在離心管中加入 TU 培養液，吹勻形成細胞懸液，用分液器按照每個 Transwell 小室 200 μL 細胞懸液進行構建接種，嚴禁產生氣泡。接種后轉入 37℃ 細胞培養箱中培養，24 h 后換液。用移液槍吸棄 Transwell 小室中的培養液，底面舊液盡量吸棄干凈，加入 TA1 培養液進行氣-液面培養，每天換液；4 d 后換用 TA2 培養液繼續氣-液面培養，每天換液，8 d 后表皮模型構建完成。
采用人原代上皮角質形成細胞構建表皮模型 EpiKutis?，具體步驟同上。
1.3 觀測指標
1.3.1 HE染色觀察 取 HaCaT 模型、EpiKutis?模型經中性緩沖甲醛溶液過夜固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切片厚度 3～5 μm，常規 HE 染色，光鏡觀察。
1.3.2 表皮模型屏障功能檢測 采用快速滲透實驗方法，測定經 1%Triton X-100 處理后組織活性減小至 50% 所需的藥物暴露時間（ET50 值），用于評價表皮模型的屏障功能。各取 9 個 HaCaT 模型、EpiKutis?模型，進行 ET50 值檢測。首先，進行表面給藥，將模型轉移至 6 孔板中，每孔放置 1 個模型，每個模型表面給藥 80 μL。藥物作用時間分別為 0、2、4 h，藥物孵育結束后，PBS 沖洗 15 次，擦拭干凈后放入新的 6 孔板，加入 1 mg/mL MTT 溶液 300 μL，置于 37℃、5%CO2 及 95% 相對濕度細胞培養箱中 3 h。孵育結束后，沖洗殘留 MTT，放入 24 孔板，每孔加入 2 mL 異丙醇，震蕩 2 h，酶標儀在 570 nm 處測定模型吸光度（A）值，并將 0 h 的細胞 A 值定為 100%，依據 3 個時間點的 A 值曲線計算 ET50 值。
1.3.3 化學品皮膚刺激性檢測 分別基于 HaCaT 模型和 EpiKutis?模型測試 20 種化學標準品[2]的皮膚刺激性，每種測試化學品重復檢測 3 個，參考 OECD TG439（2013 版）測試方法[15-16]，具體步驟如下：① 液體化學品用移液器吸取 25 μL 滴加于組織表面，用無菌尼龍膜幫助化學品均勻鋪展；固體化學品先滴加 25 μL DPBS 潤濕組織表面，再加入 25 mg 固體粉末，均勻鋪展。陰性對照加 25 μL PBS、陽性對照加 25 μL 5%SDS。化學品接觸模型時間為 30 min。② 30 min 后用無菌 DPBS 沖洗小室壁，將組織表面清洗干凈，用無菌棉簽擦拭干凈。繼續于 37℃、5%CO2 細胞培養箱中孵育 42 h。取樣品進行 MTT 檢測，具體方法同 1.3.2。按照以下公式計算組織相對活力百分比，并判斷化學品是否具有刺激性。組織相對活力百分比=某化學標準品 A 值/陰性對照 A 值×100%。評判化學品刺激性的標準：組織相對活力百分比<50% 判斷為有刺激性，≥50% 判斷為無刺激性。將 HaCaT 模型和 EpiKutis?模型測試結果與聯合國-化學品分類及標記全球協調制度（UN GHS）體內測試結果分類和 OECD TG439（ 2013 版）[15]中采用的體外替代方法（validated reference method，VRM）體外測試結果分類進行比較。
2 結果
2.1 HE 染色觀察
鏡下觀察見，HaCaT 模型未分化完全，僅為 HaCaT 細胞疊加排列，未見棘層、顆粒層及角質層的分化。而 EpiKutis?模型是在緊密排列的柱狀基底層細胞基礎上，依次分化出明顯的棘層、顆粒層和角質層的復層化結構，與人表皮結構高度相似。見圖 1。
圖1
表皮模型 HE 染色觀察（×40）
a. HaCaT 模型；b. EpiKutis? 模型
Figure1. HE staining of epidermal models (×40)a. HaCaT model; b. EpiKutis? model
2.2 表皮模型屏障功能檢測
作用 0、2、4 h 后，HaCaT 模型活力值分別為 100.00%、0.61%、0.40%，ET50 值為 0.99 h；EpiKutis?模型活力值分別為 100.00%、56.50%、26.77%，ET50 值為 2.30 h。
2.3 化學品皮膚刺激性檢測
20 種化學標準品以及陰性對照、陽性對照組織相對活力百分比見表 1。根據 OECD TG439（2013版）的評判標準，HaCaT 模型中 1、2、4、5、6、7、8、9、10、15、16、17、18、19、20 號組織相對活力百分比均<50%，判定為刺激性化學品；3、11、12、13、14 號組織相對活力百分比均≥50%，判定為無刺激性化學品。EpiKutis?模型中 4、6、7、8、9、10、11、15、16、17、18、19、20 號組織相對活力百分比均<50%，判定為刺激性化學品；1、2、3、5、12、13、14 號組織相對活力百分比均≥50%，判定為無刺激性化學品。
表1
20 種化學標準品以及陰性對照、陽性對照組織相對活力百分比（%，
）
Table1.
The results of relative tissue activity of reference chemicals, positive control, and negative control (%,
)
據 UN GHS 體內測試結果分類，本研究選用的 20 種化學品中，刺激性和非刺激性化學品各 10 種。VRM 對 20 種化學品進行測試，其結果與 UN GHS 體內測試結果分類相比，刺激性化學品的正確判斷率（即靈敏度）為 90%，非刺激性的正確判斷率（即特異性）為 70%，對 20 種化學品的正確判斷率（準確率）為 80%。本研究中，HaCaT 模型的靈敏度為 100%，特異性為 50%，準確率為 75%；EpiKutis?模型靈敏度為 100%，特異性為 70%，準確率為 85%。見表 2。
表2
不同模型測試結果匯總
Table2.
Summary of test results of different models
3 討論
皮膚刺激性測試實驗要減少甚至停止動物實驗，迫切要求建立化妝品體外替代實驗方法。國內廣東博溪生物科技有限公司開發的 EpiKutis? 表皮模型與天然皮膚有著相似的結構和屏障功能，是目前國內第一款實現產業化的皮膚模型。參考 OECD TG439（2013 版）指南，利用該款模型進行了 20 種參考化學品的皮膚刺激性測試，結果表明，該模型的靈敏度、特異性和準確率均符合歐洲替代方法驗證中心（ECVAM）認可的判斷標準，可以作為化學品體外替代檢測的工具。
采用 HaCaT 代替人原代角質形成細胞作為種子細胞構建表皮模型，細胞來源簡單，培養液價格低廉，增殖擴增快，批次間穩定性好，技術門檻低，因此值得探索 HaCaT 表皮模型能否作為替代模型進行化學品體外皮膚刺激性測試。
本實驗按照氣-液面培養的方法采用 HaCaT 構建表皮模型，從 HE 染色結果看，HaCaT 細胞疊加排列，并未分化形成棘層、顆粒層，更未分化形成角質層。角質層結構的缺失必然會導致皮膚屏障功能低下。采用 1%Triton X-100 作用于模型后，其 ET50 值與 OECD TG439（2013 版）引用的表皮模型 EpiKutisTM SIT（EPI-200）、SkinEthicTM RHE 的 ET50 值 4.0 h 以及 EpiKutis? 模型的 ET50 值 2.3 h 相比，均偏低。此結果與無角質層結構的 HE 染色結果一致。
采用本研究構建的 HaCaT 模型對 20 種參考化學品進行皮膚刺激性測試，結果顯示，刺激類化學品 100% 正確判斷，而非刺激類化學品的誤判率高達 50%，由此表明模型的屏障功能較低。此外，OECD TG439（2013版）認可的皮膚刺激性測試結果規定檢測的靈敏度≥80%、特異性≥70%、準確率≥75%[17]，而 HaCaT 模型的靈敏度和準確率均在范圍內，但特異性僅為 50%，故不符合作為評價化學品皮膚刺激性替代方法的要求。
由于本研究中 HaCaT 模型與 EpiKutis? 模型的構建過程和實驗方法基本一致，就經濟成本及二者測試結果而言，EpiKutis? 模型更適宜作為化學品體外替代檢測的工具。用永生化表皮細胞制備表皮模型成本低，易推廣，可以作為皮膚刺激實驗的粗篩。雖然使用 HaCaT 細胞生產出成熟角化上皮組織的能力有限，但此重構模型通常還是被認為具有一定功能，可同時作為模型用于闡明角質形成細胞的生長和分化的分子調節機制，用于藥理毒理的研究[17]。
檢測化學品及化妝品的皮膚刺激性是毒理學評價的重要組成部分，直接影響化學品及化妝品上市和應用[1]。皮膚刺激性評價常使用動物實驗，但動物實驗存在實驗周期長、成本高、動物間個體差異性較大等缺點。隨著各國有關動物福利法律的完善和實驗動物“3R”原則（減少、優化、替代）[2]的提出，歐盟自 2009 年 3 月起全面禁止采用動物實驗進行化妝品原料和成品的安全性評價，不允許其成員國進口經動物實驗的化妝品產品[1]。
采用體外替代方法逐漸成為化妝品安全性評價和化學品毒理學評判的重要手段[3]。國際上陸續出現了 EpiSkinTM[4-5]、EpiDermTM[6-8]、SkinEthicTM[9-10]和 LabCyte[11-12]4 種體外替代檢測模型，國內目前較成熟的是 EpiKutis?檢測模型[13]。但是這些模型使用大量人原代上皮角質形成細胞，這些原代細胞獲取較困難，培養周期較長，細胞穩定性難以保證，用于細胞培養的培養基價格昂貴，構建難度較大，導致成本較高。
人永生化上皮角質形成細胞系 HaCaT 具有無限增殖能力、獲取容易、培養簡單、穩定性好、用于其培養的培養基價格低廉等優點，并且與上皮角質形成細胞具有相似的生物學特征[14]。故我們嘗試采用 HaCaT 代替人原代角質形成細胞構建檢測模型，并采用經濟合作與發展組織（OECD）TG439（2013 版）實驗流程[15-16]及推薦的 20 種化學標準品開展皮膚刺激性測試，探索 HaCaT 表皮模型能否作為替代模型進行化學品體外皮膚刺激性測試。
1 材料與方法
1.1 主要材料、試劑及儀器
HaCaT 細胞（ATCC 細胞庫）。模型構建培養液（包括細胞培養液 TU、氣-液面前期培養液 TA1、氣-液面后期培養液 TA2；由廣東博溪生物科技有限公司提供）；角質形成細胞培養液（空軍軍醫大學組織工程中心）；MTT、Triton X-100（Sigma 公司，美國）。Transwell 小室（NUNC 公司，丹麥）；CO2 培養箱、低溫冰箱（Thermo 公司，美國）；正置顯微鏡（Olympus 公司，日本）；酶標儀（Biotek 公司，美國）；電子天平（賽多利斯公司，德國）。
1.2 表皮模型構建
取 HaCaT 細胞，37℃、5%CO2 及 95% 相對濕度細胞培養箱培養，至融合率約 60% 后，將細胞接種至 Transwell 小室的聚酯纖維膜上。具體操作：按照 2.5×106個/mL 密度在離心管中加入 TU 培養液，吹勻形成細胞懸液，用分液器按照每個 Transwell 小室 200 μL 細胞懸液進行構建接種，嚴禁產生氣泡。接種后轉入 37℃ 細胞培養箱中培養，24 h 后換液。用移液槍吸棄 Transwell 小室中的培養液，底面舊液盡量吸棄干凈，加入 TA1 培養液進行氣-液面培養，每天換液；4 d 后換用 TA2 培養液繼續氣-液面培養，每天換液，8 d 后表皮模型構建完成。
采用人原代上皮角質形成細胞構建表皮模型 EpiKutis?，具體步驟同上。
1.3 觀測指標
1.3.1 HE染色觀察 取 HaCaT 模型、EpiKutis?模型經中性緩沖甲醛溶液過夜固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切片厚度 3～5 μm，常規 HE 染色，光鏡觀察。
1.3.2 表皮模型屏障功能檢測 采用快速滲透實驗方法，測定經 1%Triton X-100 處理后組織活性減小至 50% 所需的藥物暴露時間（ET50 值），用于評價表皮模型的屏障功能。各取 9 個 HaCaT 模型、EpiKutis?模型，進行 ET50 值檢測。首先，進行表面給藥，將模型轉移至 6 孔板中，每孔放置 1 個模型，每個模型表面給藥 80 μL。藥物作用時間分別為 0、2、4 h，藥物孵育結束后，PBS 沖洗 15 次，擦拭干凈后放入新的 6 孔板，加入 1 mg/mL MTT 溶液 300 μL，置于 37℃、5%CO2 及 95% 相對濕度細胞培養箱中 3 h。孵育結束后，沖洗殘留 MTT，放入 24 孔板，每孔加入 2 mL 異丙醇，震蕩 2 h，酶標儀在 570 nm 處測定模型吸光度（A）值，并將 0 h 的細胞 A 值定為 100%，依據 3 個時間點的 A 值曲線計算 ET50 值。
1.3.3 化學品皮膚刺激性檢測 分別基于 HaCaT 模型和 EpiKutis?模型測試 20 種化學標準品[2]的皮膚刺激性，每種測試化學品重復檢測 3 個，參考 OECD TG439（2013 版）測試方法[15-16]，具體步驟如下：① 液體化學品用移液器吸取 25 μL 滴加于組織表面，用無菌尼龍膜幫助化學品均勻鋪展；固體化學品先滴加 25 μL DPBS 潤濕組織表面，再加入 25 mg 固體粉末，均勻鋪展。陰性對照加 25 μL PBS、陽性對照加 25 μL 5%SDS。化學品接觸模型時間為 30 min。② 30 min 后用無菌 DPBS 沖洗小室壁，將組織表面清洗干凈，用無菌棉簽擦拭干凈。繼續于 37℃、5%CO2 細胞培養箱中孵育 42 h。取樣品進行 MTT 檢測，具體方法同 1.3.2。按照以下公式計算組織相對活力百分比，并判斷化學品是否具有刺激性。組織相對活力百分比=某化學標準品 A 值/陰性對照 A 值×100%。評判化學品刺激性的標準：組織相對活力百分比<50% 判斷為有刺激性，≥50% 判斷為無刺激性。將 HaCaT 模型和 EpiKutis?模型測試結果與聯合國-化學品分類及標記全球協調制度（UN GHS）體內測試結果分類和 OECD TG439（ 2013 版）[15]中采用的體外替代方法（validated reference method，VRM）體外測試結果分類進行比較。
2 結果
2.1 HE 染色觀察
鏡下觀察見，HaCaT 模型未分化完全，僅為 HaCaT 細胞疊加排列，未見棘層、顆粒層及角質層的分化。而 EpiKutis?模型是在緊密排列的柱狀基底層細胞基礎上，依次分化出明顯的棘層、顆粒層和角質層的復層化結構，與人表皮結構高度相似。見圖 1。
圖1
表皮模型 HE 染色觀察（×40）
a. HaCaT 模型；b. EpiKutis? 模型
Figure1. HE staining of epidermal models (×40)a. HaCaT model; b. EpiKutis? model
2.2 表皮模型屏障功能檢測
作用 0、2、4 h 后，HaCaT 模型活力值分別為 100.00%、0.61%、0.40%，ET50 值為 0.99 h；EpiKutis?模型活力值分別為 100.00%、56.50%、26.77%，ET50 值為 2.30 h。
2.3 化學品皮膚刺激性檢測
20 種化學標準品以及陰性對照、陽性對照組織相對活力百分比見表 1。根據 OECD TG439（2013版）的評判標準，HaCaT 模型中 1、2、4、5、6、7、8、9、10、15、16、17、18、19、20 號組織相對活力百分比均<50%，判定為刺激性化學品；3、11、12、13、14 號組織相對活力百分比均≥50%，判定為無刺激性化學品。EpiKutis?模型中 4、6、7、8、9、10、11、15、16、17、18、19、20 號組織相對活力百分比均<50%，判定為刺激性化學品；1、2、3、5、12、13、14 號組織相對活力百分比均≥50%，判定為無刺激性化學品。
表1
20 種化學標準品以及陰性對照、陽性對照組織相對活力百分比（%，
）
Table1.
The results of relative tissue activity of reference chemicals, positive control, and negative control (%,
)
據 UN GHS 體內測試結果分類，本研究選用的 20 種化學品中，刺激性和非刺激性化學品各 10 種。VRM 對 20 種化學品進行測試，其結果與 UN GHS 體內測試結果分類相比，刺激性化學品的正確判斷率（即靈敏度）為 90%，非刺激性的正確判斷率（即特異性）為 70%，對 20 種化學品的正確判斷率（準確率）為 80%。本研究中，HaCaT 模型的靈敏度為 100%，特異性為 50%，準確率為 75%；EpiKutis?模型靈敏度為 100%，特異性為 70%，準確率為 85%。見表 2。
表2
不同模型測試結果匯總
Table2.
Summary of test results of different models
3 討論
皮膚刺激性測試實驗要減少甚至停止動物實驗，迫切要求建立化妝品體外替代實驗方法。國內廣東博溪生物科技有限公司開發的 EpiKutis? 表皮模型與天然皮膚有著相似的結構和屏障功能，是目前國內第一款實現產業化的皮膚模型。參考 OECD TG439（2013 版）指南，利用該款模型進行了 20 種參考化學品的皮膚刺激性測試，結果表明，該模型的靈敏度、特異性和準確率均符合歐洲替代方法驗證中心（ECVAM）認可的判斷標準，可以作為化學品體外替代檢測的工具。
采用 HaCaT 代替人原代角質形成細胞作為種子細胞構建表皮模型，細胞來源簡單，培養液價格低廉，增殖擴增快，批次間穩定性好，技術門檻低，因此值得探索 HaCaT 表皮模型能否作為替代模型進行化學品體外皮膚刺激性測試。
本實驗按照氣-液面培養的方法采用 HaCaT 構建表皮模型，從 HE 染色結果看，HaCaT 細胞疊加排列，并未分化形成棘層、顆粒層，更未分化形成角質層。角質層結構的缺失必然會導致皮膚屏障功能低下。采用 1%Triton X-100 作用于模型后，其 ET50 值與 OECD TG439（2013 版）引用的表皮模型 EpiKutisTM SIT（EPI-200）、SkinEthicTM RHE 的 ET50 值 4.0 h 以及 EpiKutis? 模型的 ET50 值 2.3 h 相比，均偏低。此結果與無角質層結構的 HE 染色結果一致。
采用本研究構建的 HaCaT 模型對 20 種參考化學品進行皮膚刺激性測試，結果顯示，刺激類化學品 100% 正確判斷，而非刺激類化學品的誤判率高達 50%，由此表明模型的屏障功能較低。此外，OECD TG439（2013版）認可的皮膚刺激性測試結果規定檢測的靈敏度≥80%、特異性≥70%、準確率≥75%[17]，而 HaCaT 模型的靈敏度和準確率均在范圍內，但特異性僅為 50%，故不符合作為評價化學品皮膚刺激性替代方法的要求。
由于本研究中 HaCaT 模型與 EpiKutis? 模型的構建過程和實驗方法基本一致，就經濟成本及二者測試結果而言，EpiKutis? 模型更適宜作為化學品體外替代檢測的工具。用永生化表皮細胞制備表皮模型成本低，易推廣，可以作為皮膚刺激實驗的粗篩。雖然使用 HaCaT 細胞生產出成熟角化上皮組織的能力有限，但此重構模型通常還是被認為具有一定功能，可同時作為模型用于闡明角質形成細胞的生長和分化的分子調節機制，用于藥理毒理的研究[17]。
