引用本文： 梁航, 鄧享譽, 邵增務. 椎間盤內源性干細胞在椎間盤組織修復再生中的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(10): 1267-1272. doi: 10.7507/1002-1892.201703036 復制
下腰痛與椎間盤退變密切相關，超過 80% 的人群曾有不同程度下腰痛困擾，是威脅人類健康的重大問題[1]。研究表明，超過 40% 的下腰痛癥狀由椎間盤退變引起[2-4]。嚴重的椎間盤退行性疾病不僅使患者喪失勞動能力，影響生活質量，而且給社會帶來巨大經濟負擔[5]。但目前仍缺乏椎間盤退變的有效治療手段，以緩解疼痛為主的保守治療以及手術治療的長期效果并不令人滿意。近年來，隨著對疾病研究的深入，生物工程與再生醫學得到迅速發展，為椎間盤退行性疾病的治療提供了新的方向。其中，椎間盤內源性干細胞的發現及其在椎間盤組織修復再生中的作用得到廣泛關注，通過椎間盤內源性修復途徑誘導椎間盤組織再生的治療策略展現出巨大潛力。
內源性修復是指當組織受損或發生退變時，通過釋放細胞因子來募集組織特異性干細胞或祖細胞，在一定微環境下完成增殖和分化，從而進行組織自我修復與更新，是機體內許多組織或器官再生過程中的重要一環[6-7]。內源性修復過程中，干細胞主要通過脈管系統及骨髓輸送到有自我更新能力的組織器官中，參與其修復再生過程。而椎間盤是一種復雜而特殊的關節，由位于中央區域的髓核、外圍的纖維環以及上下側的軟骨終板共同組成，作為人體內最大的無脈管結構，細胞主要通過擴散作用汲取鄰近椎體血管內的氧氣及營養物質，因此來自血液及骨髓的外源性干細胞難以到達椎間盤組織中[8]。此外，椎間盤微環境與其他組織不同，表現為細胞量少、葡萄糖含量低、低氧、低 pH 值、缺乏營養物質等[9-11]。這些因素均會對干細胞的遷移、黏附以及分化造成不利影響。因此，相對于其他組織，椎間盤常被認為因缺乏足夠的組織特異性干/祖細胞而缺少自我修復能力，導致其退變發生率高[12]。隨著近年來對椎間盤內源性修復機制以及組織特異性干/祖細胞的深入研究，生物工程與再生療法在治療椎間盤退變方面展現出獨特的優勢與潛力，為椎間盤退行性疾病帶來全新的治療策略。以下就椎間盤內源性干細胞在椎間盤組織修復再生中的研究進展作一綜述。
1 椎間盤組織的再生潛能
來自血液及骨髓的干細胞，是大部分具有自我修復能力的器官進行組織更新與再生的主要細胞源[13]。由于椎間盤組織中無血管系統，從血液及骨髓等周邊組織募集干細胞進入受損或退變的椎間盤參與修復再生受到極大限制。因此，學者們近年來致力于椎間盤組織內源性修復再生的研究，發掘存在于椎間盤內的組織特異性干/祖細胞的潛能，并探索其是否參與椎間盤組織的內源性修復再生過程。
Henriksson 等[14]在兔椎間盤組織中，探測細胞增殖區域及椎間盤細胞對 5’-BrdU 的標記保留情況，隨后采用免疫組織化學染色對兔、大鼠、豬的正常椎間盤組織以及人退變椎間盤組織進行干細胞標記物檢測，發現在中央髓核區及外周纖維環區均存在持續而緩慢的細胞增殖情況，而各物種的椎間盤組織中均有 Notch1、Delta4、Stro-1 等干/祖細胞標記物的表達。該研究團隊還發現，早期有大量 5’-BrdU 標記陽性細胞存在于纖維環邊緣靠近韌帶及軟骨膜的區域，隨時間延長，標記保留細胞數量逐漸減少；而干/祖細胞標記物表達陽性的細胞也被檢測到分布于纖維環外周，鄰近軟骨終板，這與 5’-BrdU 所標記區域一致，因此將該區域定義為干細胞巢。
椎間盤干細胞巢的存在對于椎間盤組織修復再生有重大意義。對人體而言，特異性的干細胞巢存在于不同組織器官中，是其修復再生過程的主要參與者。在干細胞巢中，干細胞處于休眠狀態，增殖緩慢，可被 5’-BrdU 標記為標記保留細胞而被檢測出來；當干細胞從干細胞巢遷移出后，可到達特定部位完成增殖分化，參與組織修復再生[15]。因此，椎間盤干細胞巢能夠在人體椎間盤組織的修復再生過程中發揮重大作用。Henriksson 等[16]進一步研究顯示，在不同年齡兔的椎間盤組織中均發現了軟骨形成標記物 Sox-9、生長分化因子-5 和細胞遷移標記物 SNAI1、SLUG、整合素 β1 等與細胞增殖、遷移、分化相關的基因表達，這些標記物出現在干細胞巢區域以及外周纖維環和中央髓核區；而在前期對椎間盤組織的 5’-BrdU 標記保留細胞分布的研究中，同樣發現 5’-BrdU 標記保留細胞在最開始存在于上述干細胞巢區域，隨著時間推移，5’-BrdU 標記保留細胞出現在纖維環周圍區域及中央髓核區，進一步證實椎間盤干細胞從干細胞巢到中央髓核區及纖維環周圍完成了遷移活動。
這一系列研究都證實了椎間盤組織內組織特異性干細胞巢的存在，干/祖細胞可從干細胞巢募集與遷移至椎間盤組織，參與椎間盤內源性修復再生過程，這也為治療椎間盤退變、誘導椎間盤修復再生提供了新靶向。
2 椎間盤內源性干細胞遷移參與椎間盤組織修復
在許多椎間盤退變的動物模型以及一些早期臨床試驗中，MSCs 移植被證實能夠延緩或抑制椎間盤退變進程，改善椎間盤功能，維持椎間盤結構穩定[17-21]。移植的 MSCs 能夠在適宜的微環境中向椎間盤類細胞分化，提高髓核細胞的生存能力，幫助退變的椎間盤組織修復與再生[22]。同時移植的 MSCs 能夠釋放生物活性因子促進椎間盤細胞的新陳代謝，并抑制降解酶及炎性因子的表達，從而減少細胞外基質降解，增加細胞外基質合成，維持椎間盤的微環境[23]。盡管 MSCs 移植療法在研究中取得巨大成果，其在臨床應用時仍存在限制：自體 BMSCs 的獲取和移植均需通過有創途徑，可能引起移植細胞在移植靶點的回漏和骨贅形成等相關潛在并發癥風險；此外，對干細胞的體外培養和加工是一個復雜且耗費極大的過程，而干細胞移植后的存活率較低，對干細胞療法的運用也將產生極大限制[24-25]。
因此，如何募集椎間盤內源性干/祖細胞參與修復椎間盤退變，成為了研究新方向。對內源性干/祖細胞的動員是椎間盤內源性修復過程的重要環節，然而目前對椎間盤內源性干/祖細胞存在的數量及其再生能力所知有限，尤其是在疾病發展階段[26]。當細胞或組織受損或退變后，細胞會釋放多種信號分子促進組織修復與再生。一些細胞趨化因子能夠顯著動員周邊組織的干細胞巢，誘導干細胞介導的組織內源性修復[27]。而對于椎間盤組織，由于無脈管系統，來自血液或骨髓的干細胞需遷移很長一段距離才能進入纖維環或到達髓核組織，因此干細胞很難通過募集作用遷移到椎間盤組織內參與修復再生。近年來有研究表明，退變的椎間盤組織能夠通過釋放具有趨化作用的細胞因子對干細胞產生募集作用，IGF-1、TGF-β、基質細胞衍生因子-1（stromal cell derived factor 1，SDF-1）、趨化因子配體5（chemokine ligand 5，CCL-5）等均能夠促進 MSCs 的遷移[28-30]。
在一項對體外退變椎間盤器官培養的研究中，Pereira 等[31]發現 SDF-1 能夠誘導 MSCs 穿過軟骨終板完成遷移。研究人員將熒光標記的 BMSCs 與 SDF-1 一同搭載于一種熱可逆水凝膠中，置于體外椎間盤組織軟骨終板表面并孵育 48 h，通過顯微鏡觀察到，用水凝膠搭載 SDF-1 的細胞組向椎間盤內部遷移的活動明顯強于單用水凝膠或 SDF-1 的細胞組；此外，研究還發現 BMSCs 的募集作用同時存在于纖維環及髓核組織，提示遷移活動在纖維環及髓核的細胞外基質中均有發生。此研究表明誘導 MSCs 向受損的椎間盤中央區募集是能夠實現的；同時，由特定的水凝膠和有效的趨化因子組成的趨化因子傳導系統，能夠加強 MSCs 的募集作用。此類組織特異性趨化因子是當椎間盤組織受損或退變時產生的，為了進一步了解椎間盤組織受損時細胞因子的釋放與干細胞募集的關系，研究者在體外誘導退變的椎間盤組織中進行了蛋白組學分析，發現誘導退變的條件下椎間盤組織分泌的 CCL-5 濃度高于生理條件下的分泌量[32]。
研究證實 CCL-5 的表達的確與椎間盤退變密切相關。Gruber 等[33]采用基因芯片技術分析正常與退變的椎間盤組織差異，證實退變椎間盤組織中 CCL-5 的表達量明顯上調；此外，免疫組織化學分析結果顯示除了部分髓核組織外，大部分 CCL-5 陽性區域集中在纖維環組織；后續實驗中，他們發現使用 IL-1β 和 TNF 刺激椎間盤組織可使 CCL-5 表達上調。Kepler 等[34]通過對比導致疼痛的退變腰椎間盤組織和正常腰椎間盤組織，同樣發現前者 CCL-5/RANTES（調節活化正常 T 細胞表達與分泌的趨化因子）表達量顯著高于后者，且與 IL-1β 的表達量關系密切。值得注意的是，Pattappa 等[32]在體外趨化性實驗中發現，在退變椎間盤組織中抑制 CCL-5 的功能將顯著減弱 MSCs 的化學趨向性活動，表明 CCL-5 對再生性干細胞的募集過程起關鍵性作用。此外，Li 等[35]對退變椎間盤分泌細胞因子的檢測中發現，除 CCL-5 表達增高外，CXCL-10、IL-6 和 IL-8 等趨化因子均存在高水平表達。Phillips 等[36]發現隨著椎間盤組織學退變程度的增加，趨化因子 CCL-2、CCL-7、CXCL-8 的表達量均有明顯增加，可通過其表達水平評估椎間盤退變程度，但是否對椎間盤干細胞的募集作用產生影響仍需進一步研究。
綜上，特異性炎性趨化因子或許是椎間盤退行性改變和椎間盤內源性修復再生的重要影響因素。目前，多項研究成果均已表明，椎間盤組織內存在內源性干/祖細胞的遷移募集活動，并能夠被趨化因子系統所誘導。然而機體內也存在干細胞遷移的抑制因素，Xiong 等[37]經過分離鑒定軟骨終板源干細胞后，發現巨噬細胞遷移抑制因子（MIF）及其受體 CD74 能夠抑制軟骨終板源干細胞的遷移活動。因此，未來研究中仍需進一步發掘最有效的化學驅動因子，排除遷移抑制因素的干擾作用。對內源性干細胞的動員及募集將成為研究椎間盤內源性修復機制的重要課題。
3 椎間盤干細胞的分離與鑒定
目前的研究成果證實了椎間盤內源性干/祖細胞的存在并參與椎間盤組織修復再生過程。而如何實現對椎間盤內源性干/祖細胞的分離、提純和鑒定，成為研究椎間盤組織修復再生的重要課題。現階段，研究者已能夠從髓核組織、纖維環及軟骨終板中分離培養出與 MSCs 細胞表型相似的細胞，這部分細胞在體外培養中表現出多向分化能力和自我更新潛能。
Blanco 等[38]從人退變的椎間盤組織中分離出了髓核 MSCs，發現其形態、細胞表型及分化潛能等方面與 BMSCs 相似，而髓核 MSCs 成脂分化能力較弱。Erwin 等[39]從犬椎間盤髓核組織中分離得到椎間盤髓核祖細胞，占椎間盤細胞總數的 1%，這些細胞能夠表達干細胞表面標記物 Sox2、Pou5f1、Nanog、CD133、Nestin 以及 CD56，但與 MSCs 相比，Nanog 表達水平更高；體外培養中，此類椎間盤髓核祖細胞表現出多向分化能力，可分化為軟骨、脂類及神經性細胞；而體內實驗中也可分化為少突膠質細胞、神經元、星狀膠質細胞的特異性前體細胞。Feng 等[40]從纖維環中分離得到具有多向分化能力的纖維環 MSCs。Liu 等[41]分離得到軟骨終板 MSCs，與 BMSCs 相比具有更強的成骨與成軟骨能力。
研究者又針對不同的椎間盤干細胞作生物學行為的比較。Wang 等[21]分別從人椎間盤組織中分離出纖維環 MSCs、髓核 MSCs、軟骨終板 MSCs，并在兔椎間盤退變模型中與 BMSCs 比較修復再生能力。以上干細胞提取后分別在體外進行擴增，隨后搭載海藻酸鹽凝膠注入經髓核抽吸處理后的兔椎間盤中，6 個月后通過 MRI、X 線片及組織學分析發現，軟骨終板 MSCs 具有最強的修復再生能力，髓核 MSCs 和 BMSCs 能力稍弱，而纖維環 MSCs 效果最差。隨后，Wang 等[42]又將纖維環 MSCs、髓核 MSCs、軟骨終板 MSCs 與 BMSCs 進行生物學分析，發現其增殖能力相似，細胞表型也僅存細微差別，成骨能力由軟骨終板 MSCs、纖維環 MSCs、BMSCs、髓核 MSCs 依次減弱，成軟骨能力與之一致，而成脂能力由 BMSCs、髓核 MSCs、軟骨終板 MSCs、纖維環 MSCs 依次減弱。Liu 等[43]同樣比較了髓核 MSCs、軟骨終板 MSCs、纖維環 MSCs 3 種干細胞的生物學特性，發現軟骨終板 MSCs 具有最強的遷移能力，并且 CXCR4 的表達量最高。
而對于椎間盤干細胞的鑒定，Risbud 等[44]于 2007 年首先在人退變的椎間盤組織中發現了表達干細胞表型特征（包括 CD105、CD166、CD63、CD49a、CD90、CD73、p75 以及 CD133/1）的髓核及纖維環細胞，并且這些細胞能夠向成骨、成軟骨、成脂方向分化；此后，Henriksson 等[16]發現在兔、大鼠、人等椎間盤組織中存在增殖能力強的細胞，表達 Notch1、Delta4、Jagged1、CKIT 和 STRO-1 等干細胞表面標記物。目前已有越來越多研究證實了椎間盤內源性干/祖細胞的存在，但始終缺乏組織特異性細胞表面標記物來鑒別。
值得關注的是，近幾年 Sakai 等[45]在該領域研究中取得突破性進展，他們首次提出了椎間盤內源性干/祖細胞的組織特異性表面標記物 Tie2 和 GD2，他們還發現隨著年齡增大及椎間盤退變程度加重，表達椎間盤干細胞表面標記物 Tie2 的細胞數量逐漸減少。他們從椎間盤組織中得到的 Tie2+GD2+ 細胞具有多向分化能力，并能夠產生蛋白聚糖和Ⅱ型膠原酶，被認為是椎間盤內源性干/祖細胞；Tie2+GD2– 細胞是 Tie2+GD2+ 細胞的前體細胞，CD24 是其下游的細胞表面標記物，這些表面標記物（Tie2、GD2、CD24）隨著椎間盤內源性干/祖細胞的分化而呈現出不可逆的改變。盡管 Tie2 的表達意義仍需進一步研究，但其作為年齡相關性椎間盤退變的敏感標記物，可通過其表達量的變化評估椎間盤內源性干細胞的數量及其功能，從而評估椎間盤退變程度，也可為椎間盤內源性干/祖細胞的內源性治療提供基礎。該研究還發現，在體外人椎間盤內源性干/祖細胞培養中，Tie2/ANG-1 信號通路對椎間盤內源性干/祖細胞起調控作用，因此 Tie2/ANG-1 信號通路可作為細胞治療或基因治療的靶點，為椎間盤內源性修復再生療法提供新思路。然而，隨著年齡增長以及椎間盤退變程度的加重，Tie2+ 細胞數量逐漸減少，表明椎間盤內源性干/祖細胞的缺乏，這也將成為內源性修復再生療法的主要問題。
此外，Yasen 等[46]研究發現，兔髓核及纖維環細胞表達增殖標記物和干細胞標記物 PCNA、C-kit、CD166、Notch1 和 Jagged1，并且隨著年齡增長，以上標記物表達逐漸減少。Brisby 等[47]研究發現，人退變椎間盤組織中存在的內源性干/祖細胞表達多向分化潛能的表面標記物 POU5F1 和 Notch-1，以及 MSCs 表面標記物 CD105、CD90 和 STRO-1。進一步研究顯示，當退變的椎間盤細胞與 MSCs 共培養時，以上表面標記物表達量升高；而與正常椎間盤細胞共存時，又可促進蛋白聚糖的產生。Guan 等[48]成功從髓核細胞中分離出干/祖細胞，鑒定其具有干細胞表面標記物及多向分化潛能，當使用 TGF-β1 干預時，其細胞表面標記物 CD24 表達量顯著增高，表明此椎間盤內源性干/祖細胞向成熟椎間盤細胞分化。
綜上，越來越多研究證實了椎間盤內源性干/祖細胞的存在，椎間盤中不同類型的干細胞也被成功分離與鑒定，對椎間盤內源性干/祖細胞的生物學特性研究取得了重大研究成果，其修復再生能力也在動物實驗模型中得到充分認定。然而目前對椎間盤內源性干/祖細胞的研究僅停留在體外細胞實驗和動物模型階段，如何將其轉化至臨床運用階段仍需進一步研究。
4 椎間盤干細胞用于內源性修復再生的展望
目前，椎間盤內靠近軟骨終板區域的干細胞巢已得到多項研究確認，干細胞巢的存在對椎間盤組織修復再生的研究將產生深遠意義。椎間盤組織特異性干/祖細胞也在近年被成功分離與鑒定，并對 3 種類型椎間盤干細胞（髓核 MSCs、軟骨終板 MSCs、纖維環 MSCs）的生物學特性進行了深入比較與分析。同時，椎間盤干細胞具有多向分化的細胞表型，可向多個方向增殖分化。另一方面，隨著生物與再生醫學中分子療法的深入研究，具有趨化作用的細胞因子在體外組織培養干/祖細胞的募集活動中發揮出重要作用，如何在體內實現對椎間盤內源性干細胞的募集將是椎間盤內源性修復再生領域的重大課題。
目前，我們面臨的主要問題是如何將體外實驗及動物模型實驗的成果轉化到臨床應用中。因此，椎間盤組織內源性修復再生的生理過程仍需進一步研究，以便采取更安全有效的方法模仿生理性修復過程治療椎間盤退變。此外，生物工程與再生療法的最佳治療時期是椎間盤退變早期，此時椎間盤尚存在一定修復再生能力，且未發生結構性病變。所以，針對早期椎間盤退變的無創性診斷方法也將是今后重要研究方向[49]。對于椎間盤源性下腰痛的患者以及行椎間盤手術的患者，同樣可使用生物治療策略促進椎間盤組織修復再生，并防止相鄰節段的椎間盤組織發生退變。我們可以預見，隨著對椎間盤退行性疾病發病機制的進一步揭示，以及對椎間盤內源性干/祖細胞的深入研究，椎間盤內源性修復再生療法在椎間盤退行性疾病的臨床治療中具有極大潛力與發展空間。
下腰痛與椎間盤退變密切相關，超過 80% 的人群曾有不同程度下腰痛困擾，是威脅人類健康的重大問題[1]。研究表明，超過 40% 的下腰痛癥狀由椎間盤退變引起[2-4]。嚴重的椎間盤退行性疾病不僅使患者喪失勞動能力，影響生活質量，而且給社會帶來巨大經濟負擔[5]。但目前仍缺乏椎間盤退變的有效治療手段，以緩解疼痛為主的保守治療以及手術治療的長期效果并不令人滿意。近年來，隨著對疾病研究的深入，生物工程與再生醫學得到迅速發展，為椎間盤退行性疾病的治療提供了新的方向。其中，椎間盤內源性干細胞的發現及其在椎間盤組織修復再生中的作用得到廣泛關注，通過椎間盤內源性修復途徑誘導椎間盤組織再生的治療策略展現出巨大潛力。
內源性修復是指當組織受損或發生退變時，通過釋放細胞因子來募集組織特異性干細胞或祖細胞，在一定微環境下完成增殖和分化，從而進行組織自我修復與更新，是機體內許多組織或器官再生過程中的重要一環[6-7]。內源性修復過程中，干細胞主要通過脈管系統及骨髓輸送到有自我更新能力的組織器官中，參與其修復再生過程。而椎間盤是一種復雜而特殊的關節，由位于中央區域的髓核、外圍的纖維環以及上下側的軟骨終板共同組成，作為人體內最大的無脈管結構，細胞主要通過擴散作用汲取鄰近椎體血管內的氧氣及營養物質，因此來自血液及骨髓的外源性干細胞難以到達椎間盤組織中[8]。此外，椎間盤微環境與其他組織不同，表現為細胞量少、葡萄糖含量低、低氧、低 pH 值、缺乏營養物質等[9-11]。這些因素均會對干細胞的遷移、黏附以及分化造成不利影響。因此，相對于其他組織，椎間盤常被認為因缺乏足夠的組織特異性干/祖細胞而缺少自我修復能力，導致其退變發生率高[12]。隨著近年來對椎間盤內源性修復機制以及組織特異性干/祖細胞的深入研究，生物工程與再生療法在治療椎間盤退變方面展現出獨特的優勢與潛力，為椎間盤退行性疾病帶來全新的治療策略。以下就椎間盤內源性干細胞在椎間盤組織修復再生中的研究進展作一綜述。
1 椎間盤組織的再生潛能
來自血液及骨髓的干細胞，是大部分具有自我修復能力的器官進行組織更新與再生的主要細胞源[13]。由于椎間盤組織中無血管系統，從血液及骨髓等周邊組織募集干細胞進入受損或退變的椎間盤參與修復再生受到極大限制。因此，學者們近年來致力于椎間盤組織內源性修復再生的研究，發掘存在于椎間盤內的組織特異性干/祖細胞的潛能，并探索其是否參與椎間盤組織的內源性修復再生過程。
Henriksson 等[14]在兔椎間盤組織中，探測細胞增殖區域及椎間盤細胞對 5’-BrdU 的標記保留情況，隨后采用免疫組織化學染色對兔、大鼠、豬的正常椎間盤組織以及人退變椎間盤組織進行干細胞標記物檢測，發現在中央髓核區及外周纖維環區均存在持續而緩慢的細胞增殖情況，而各物種的椎間盤組織中均有 Notch1、Delta4、Stro-1 等干/祖細胞標記物的表達。該研究團隊還發現，早期有大量 5’-BrdU 標記陽性細胞存在于纖維環邊緣靠近韌帶及軟骨膜的區域，隨時間延長，標記保留細胞數量逐漸減少；而干/祖細胞標記物表達陽性的細胞也被檢測到分布于纖維環外周，鄰近軟骨終板，這與 5’-BrdU 所標記區域一致，因此將該區域定義為干細胞巢。
椎間盤干細胞巢的存在對于椎間盤組織修復再生有重大意義。對人體而言，特異性的干細胞巢存在于不同組織器官中，是其修復再生過程的主要參與者。在干細胞巢中，干細胞處于休眠狀態，增殖緩慢，可被 5’-BrdU 標記為標記保留細胞而被檢測出來；當干細胞從干細胞巢遷移出后，可到達特定部位完成增殖分化，參與組織修復再生[15]。因此，椎間盤干細胞巢能夠在人體椎間盤組織的修復再生過程中發揮重大作用。Henriksson 等[16]進一步研究顯示，在不同年齡兔的椎間盤組織中均發現了軟骨形成標記物 Sox-9、生長分化因子-5 和細胞遷移標記物 SNAI1、SLUG、整合素 β1 等與細胞增殖、遷移、分化相關的基因表達，這些標記物出現在干細胞巢區域以及外周纖維環和中央髓核區；而在前期對椎間盤組織的 5’-BrdU 標記保留細胞分布的研究中，同樣發現 5’-BrdU 標記保留細胞在最開始存在于上述干細胞巢區域，隨著時間推移，5’-BrdU 標記保留細胞出現在纖維環周圍區域及中央髓核區，進一步證實椎間盤干細胞從干細胞巢到中央髓核區及纖維環周圍完成了遷移活動。
這一系列研究都證實了椎間盤組織內組織特異性干細胞巢的存在，干/祖細胞可從干細胞巢募集與遷移至椎間盤組織，參與椎間盤內源性修復再生過程，這也為治療椎間盤退變、誘導椎間盤修復再生提供了新靶向。
2 椎間盤內源性干細胞遷移參與椎間盤組織修復
在許多椎間盤退變的動物模型以及一些早期臨床試驗中，MSCs 移植被證實能夠延緩或抑制椎間盤退變進程，改善椎間盤功能，維持椎間盤結構穩定[17-21]。移植的 MSCs 能夠在適宜的微環境中向椎間盤類細胞分化，提高髓核細胞的生存能力，幫助退變的椎間盤組織修復與再生[22]。同時移植的 MSCs 能夠釋放生物活性因子促進椎間盤細胞的新陳代謝，并抑制降解酶及炎性因子的表達，從而減少細胞外基質降解，增加細胞外基質合成，維持椎間盤的微環境[23]。盡管 MSCs 移植療法在研究中取得巨大成果，其在臨床應用時仍存在限制：自體 BMSCs 的獲取和移植均需通過有創途徑，可能引起移植細胞在移植靶點的回漏和骨贅形成等相關潛在并發癥風險；此外，對干細胞的體外培養和加工是一個復雜且耗費極大的過程，而干細胞移植后的存活率較低，對干細胞療法的運用也將產生極大限制[24-25]。
因此，如何募集椎間盤內源性干/祖細胞參與修復椎間盤退變，成為了研究新方向。對內源性干/祖細胞的動員是椎間盤內源性修復過程的重要環節，然而目前對椎間盤內源性干/祖細胞存在的數量及其再生能力所知有限，尤其是在疾病發展階段[26]。當細胞或組織受損或退變后，細胞會釋放多種信號分子促進組織修復與再生。一些細胞趨化因子能夠顯著動員周邊組織的干細胞巢，誘導干細胞介導的組織內源性修復[27]。而對于椎間盤組織，由于無脈管系統，來自血液或骨髓的干細胞需遷移很長一段距離才能進入纖維環或到達髓核組織，因此干細胞很難通過募集作用遷移到椎間盤組織內參與修復再生。近年來有研究表明，退變的椎間盤組織能夠通過釋放具有趨化作用的細胞因子對干細胞產生募集作用，IGF-1、TGF-β、基質細胞衍生因子-1（stromal cell derived factor 1，SDF-1）、趨化因子配體5（chemokine ligand 5，CCL-5）等均能夠促進 MSCs 的遷移[28-30]。
在一項對體外退變椎間盤器官培養的研究中，Pereira 等[31]發現 SDF-1 能夠誘導 MSCs 穿過軟骨終板完成遷移。研究人員將熒光標記的 BMSCs 與 SDF-1 一同搭載于一種熱可逆水凝膠中，置于體外椎間盤組織軟骨終板表面并孵育 48 h，通過顯微鏡觀察到，用水凝膠搭載 SDF-1 的細胞組向椎間盤內部遷移的活動明顯強于單用水凝膠或 SDF-1 的細胞組；此外，研究還發現 BMSCs 的募集作用同時存在于纖維環及髓核組織，提示遷移活動在纖維環及髓核的細胞外基質中均有發生。此研究表明誘導 MSCs 向受損的椎間盤中央區募集是能夠實現的；同時，由特定的水凝膠和有效的趨化因子組成的趨化因子傳導系統，能夠加強 MSCs 的募集作用。此類組織特異性趨化因子是當椎間盤組織受損或退變時產生的，為了進一步了解椎間盤組織受損時細胞因子的釋放與干細胞募集的關系，研究者在體外誘導退變的椎間盤組織中進行了蛋白組學分析，發現誘導退變的條件下椎間盤組織分泌的 CCL-5 濃度高于生理條件下的分泌量[32]。
研究證實 CCL-5 的表達的確與椎間盤退變密切相關。Gruber 等[33]采用基因芯片技術分析正常與退變的椎間盤組織差異，證實退變椎間盤組織中 CCL-5 的表達量明顯上調；此外，免疫組織化學分析結果顯示除了部分髓核組織外，大部分 CCL-5 陽性區域集中在纖維環組織；后續實驗中，他們發現使用 IL-1β 和 TNF 刺激椎間盤組織可使 CCL-5 表達上調。Kepler 等[34]通過對比導致疼痛的退變腰椎間盤組織和正常腰椎間盤組織，同樣發現前者 CCL-5/RANTES（調節活化正常 T 細胞表達與分泌的趨化因子）表達量顯著高于后者，且與 IL-1β 的表達量關系密切。值得注意的是，Pattappa 等[32]在體外趨化性實驗中發現，在退變椎間盤組織中抑制 CCL-5 的功能將顯著減弱 MSCs 的化學趨向性活動，表明 CCL-5 對再生性干細胞的募集過程起關鍵性作用。此外，Li 等[35]對退變椎間盤分泌細胞因子的檢測中發現，除 CCL-5 表達增高外，CXCL-10、IL-6 和 IL-8 等趨化因子均存在高水平表達。Phillips 等[36]發現隨著椎間盤組織學退變程度的增加，趨化因子 CCL-2、CCL-7、CXCL-8 的表達量均有明顯增加，可通過其表達水平評估椎間盤退變程度，但是否對椎間盤干細胞的募集作用產生影響仍需進一步研究。
綜上，特異性炎性趨化因子或許是椎間盤退行性改變和椎間盤內源性修復再生的重要影響因素。目前，多項研究成果均已表明，椎間盤組織內存在內源性干/祖細胞的遷移募集活動，并能夠被趨化因子系統所誘導。然而機體內也存在干細胞遷移的抑制因素，Xiong 等[37]經過分離鑒定軟骨終板源干細胞后，發現巨噬細胞遷移抑制因子（MIF）及其受體 CD74 能夠抑制軟骨終板源干細胞的遷移活動。因此，未來研究中仍需進一步發掘最有效的化學驅動因子，排除遷移抑制因素的干擾作用。對內源性干細胞的動員及募集將成為研究椎間盤內源性修復機制的重要課題。
3 椎間盤干細胞的分離與鑒定
目前的研究成果證實了椎間盤內源性干/祖細胞的存在并參與椎間盤組織修復再生過程。而如何實現對椎間盤內源性干/祖細胞的分離、提純和鑒定，成為研究椎間盤組織修復再生的重要課題。現階段，研究者已能夠從髓核組織、纖維環及軟骨終板中分離培養出與 MSCs 細胞表型相似的細胞，這部分細胞在體外培養中表現出多向分化能力和自我更新潛能。
Blanco 等[38]從人退變的椎間盤組織中分離出了髓核 MSCs，發現其形態、細胞表型及分化潛能等方面與 BMSCs 相似，而髓核 MSCs 成脂分化能力較弱。Erwin 等[39]從犬椎間盤髓核組織中分離得到椎間盤髓核祖細胞，占椎間盤細胞總數的 1%，這些細胞能夠表達干細胞表面標記物 Sox2、Pou5f1、Nanog、CD133、Nestin 以及 CD56，但與 MSCs 相比，Nanog 表達水平更高；體外培養中，此類椎間盤髓核祖細胞表現出多向分化能力，可分化為軟骨、脂類及神經性細胞；而體內實驗中也可分化為少突膠質細胞、神經元、星狀膠質細胞的特異性前體細胞。Feng 等[40]從纖維環中分離得到具有多向分化能力的纖維環 MSCs。Liu 等[41]分離得到軟骨終板 MSCs，與 BMSCs 相比具有更強的成骨與成軟骨能力。
研究者又針對不同的椎間盤干細胞作生物學行為的比較。Wang 等[21]分別從人椎間盤組織中分離出纖維環 MSCs、髓核 MSCs、軟骨終板 MSCs，并在兔椎間盤退變模型中與 BMSCs 比較修復再生能力。以上干細胞提取后分別在體外進行擴增，隨后搭載海藻酸鹽凝膠注入經髓核抽吸處理后的兔椎間盤中，6 個月后通過 MRI、X 線片及組織學分析發現，軟骨終板 MSCs 具有最強的修復再生能力，髓核 MSCs 和 BMSCs 能力稍弱，而纖維環 MSCs 效果最差。隨后，Wang 等[42]又將纖維環 MSCs、髓核 MSCs、軟骨終板 MSCs 與 BMSCs 進行生物學分析，發現其增殖能力相似，細胞表型也僅存細微差別，成骨能力由軟骨終板 MSCs、纖維環 MSCs、BMSCs、髓核 MSCs 依次減弱，成軟骨能力與之一致，而成脂能力由 BMSCs、髓核 MSCs、軟骨終板 MSCs、纖維環 MSCs 依次減弱。Liu 等[43]同樣比較了髓核 MSCs、軟骨終板 MSCs、纖維環 MSCs 3 種干細胞的生物學特性，發現軟骨終板 MSCs 具有最強的遷移能力，并且 CXCR4 的表達量最高。
而對于椎間盤干細胞的鑒定，Risbud 等[44]于 2007 年首先在人退變的椎間盤組織中發現了表達干細胞表型特征（包括 CD105、CD166、CD63、CD49a、CD90、CD73、p75 以及 CD133/1）的髓核及纖維環細胞，并且這些細胞能夠向成骨、成軟骨、成脂方向分化；此后，Henriksson 等[16]發現在兔、大鼠、人等椎間盤組織中存在增殖能力強的細胞，表達 Notch1、Delta4、Jagged1、CKIT 和 STRO-1 等干細胞表面標記物。目前已有越來越多研究證實了椎間盤內源性干/祖細胞的存在，但始終缺乏組織特異性細胞表面標記物來鑒別。
值得關注的是，近幾年 Sakai 等[45]在該領域研究中取得突破性進展，他們首次提出了椎間盤內源性干/祖細胞的組織特異性表面標記物 Tie2 和 GD2，他們還發現隨著年齡增大及椎間盤退變程度加重，表達椎間盤干細胞表面標記物 Tie2 的細胞數量逐漸減少。他們從椎間盤組織中得到的 Tie2+GD2+ 細胞具有多向分化能力，并能夠產生蛋白聚糖和Ⅱ型膠原酶，被認為是椎間盤內源性干/祖細胞；Tie2+GD2– 細胞是 Tie2+GD2+ 細胞的前體細胞，CD24 是其下游的細胞表面標記物，這些表面標記物（Tie2、GD2、CD24）隨著椎間盤內源性干/祖細胞的分化而呈現出不可逆的改變。盡管 Tie2 的表達意義仍需進一步研究，但其作為年齡相關性椎間盤退變的敏感標記物，可通過其表達量的變化評估椎間盤內源性干細胞的數量及其功能，從而評估椎間盤退變程度，也可為椎間盤內源性干/祖細胞的內源性治療提供基礎。該研究還發現，在體外人椎間盤內源性干/祖細胞培養中，Tie2/ANG-1 信號通路對椎間盤內源性干/祖細胞起調控作用，因此 Tie2/ANG-1 信號通路可作為細胞治療或基因治療的靶點，為椎間盤內源性修復再生療法提供新思路。然而，隨著年齡增長以及椎間盤退變程度的加重，Tie2+ 細胞數量逐漸減少，表明椎間盤內源性干/祖細胞的缺乏，這也將成為內源性修復再生療法的主要問題。
此外，Yasen 等[46]研究發現，兔髓核及纖維環細胞表達增殖標記物和干細胞標記物 PCNA、C-kit、CD166、Notch1 和 Jagged1，并且隨著年齡增長，以上標記物表達逐漸減少。Brisby 等[47]研究發現，人退變椎間盤組織中存在的內源性干/祖細胞表達多向分化潛能的表面標記物 POU5F1 和 Notch-1，以及 MSCs 表面標記物 CD105、CD90 和 STRO-1。進一步研究顯示，當退變的椎間盤細胞與 MSCs 共培養時，以上表面標記物表達量升高；而與正常椎間盤細胞共存時，又可促進蛋白聚糖的產生。Guan 等[48]成功從髓核細胞中分離出干/祖細胞，鑒定其具有干細胞表面標記物及多向分化潛能，當使用 TGF-β1 干預時，其細胞表面標記物 CD24 表達量顯著增高，表明此椎間盤內源性干/祖細胞向成熟椎間盤細胞分化。
綜上，越來越多研究證實了椎間盤內源性干/祖細胞的存在，椎間盤中不同類型的干細胞也被成功分離與鑒定，對椎間盤內源性干/祖細胞的生物學特性研究取得了重大研究成果，其修復再生能力也在動物實驗模型中得到充分認定。然而目前對椎間盤內源性干/祖細胞的研究僅停留在體外細胞實驗和動物模型階段，如何將其轉化至臨床運用階段仍需進一步研究。
4 椎間盤干細胞用于內源性修復再生的展望
目前，椎間盤內靠近軟骨終板區域的干細胞巢已得到多項研究確認，干細胞巢的存在對椎間盤組織修復再生的研究將產生深遠意義。椎間盤組織特異性干/祖細胞也在近年被成功分離與鑒定，并對 3 種類型椎間盤干細胞（髓核 MSCs、軟骨終板 MSCs、纖維環 MSCs）的生物學特性進行了深入比較與分析。同時，椎間盤干細胞具有多向分化的細胞表型，可向多個方向增殖分化。另一方面，隨著生物與再生醫學中分子療法的深入研究，具有趨化作用的細胞因子在體外組織培養干/祖細胞的募集活動中發揮出重要作用，如何在體內實現對椎間盤內源性干細胞的募集將是椎間盤內源性修復再生領域的重大課題。
目前，我們面臨的主要問題是如何將體外實驗及動物模型實驗的成果轉化到臨床應用中。因此，椎間盤組織內源性修復再生的生理過程仍需進一步研究，以便采取更安全有效的方法模仿生理性修復過程治療椎間盤退變。此外，生物工程與再生療法的最佳治療時期是椎間盤退變早期，此時椎間盤尚存在一定修復再生能力，且未發生結構性病變。所以，針對早期椎間盤退變的無創性診斷方法也將是今后重要研究方向[49]。對于椎間盤源性下腰痛的患者以及行椎間盤手術的患者，同樣可使用生物治療策略促進椎間盤組織修復再生，并防止相鄰節段的椎間盤組織發生退變。我們可以預見，隨著對椎間盤退行性疾病發病機制的進一步揭示，以及對椎間盤內源性干/祖細胞的深入研究，椎間盤內源性修復再生療法在椎間盤退行性疾病的臨床治療中具有極大潛力與發展空間。