引用本文： 喬瑋, 任曉琦, 石浩, 李晶, 楊婷, 馬紹英, 趙亞平, 蘇成忠, 李寶興. 煅燒異種骨的生物相容性研究. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(10): 1250-1255. doi: 10.7507/1002-1892.201705001 復制
在臨床上，自體骨移植被認為是骨缺損修復的“金標準”[1]，但存在二次創傷、移植材料稀缺等不足，因而來源豐富的異種骨成為研究熱點[2-3]。理想的骨缺損修復材料必須有良好的生物相容性、骨傳導性、生物降解性[4]、低免疫原性以及類似天然骨的孔隙結構。牛松質骨經高溫煅燒制得的煅燒異種骨是一種骨無機物有序晶體，其主要成分是高純度的羥基磷灰石[5]，具有與人骨相似的鈣磷比和孔隙結構[6]，高溫煅燒在有效去除抗原的同時保留了天然多孔結構，為新生骨組織和血管的長入提供了理想的通道[7-8]，是一種潛在的理想骨缺損修復材料。對煅燒骨的制備工藝以及理化性質的研究已有諸多報道[9-10]，為了解煅燒異種骨的生物相容性，本實驗按照國際標準化組織 ISO10993 醫療器械和生物材料生物學評價試驗指南（ISO10993-1）標準[11]，選擇了細胞毒性、細胞相容性與組織相容性試驗來進行評價，以期為煅燒骨作為骨缺損修復材料用于臨床提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康成年新西蘭大白兔 10 只，體質量（3.0±0.2）kg，雌雄不限，購自北京市昌揚西山養殖場；中國輻射防護研究院 GLP 實驗中心負責飼養，實驗中對動物的處置符合動物倫理學要求。
L929 小鼠成纖維細胞株（中國科學院上海細胞生物學研究所）。L-DMEM 培養液、FBS（HyClone 公司，美國）。3111 型 CO2 培養箱（Thermo 公司，美國）；JSM-6360LV 型掃描電鏡（日本電子株式會社）；IX71 倒置相差顯微鏡及照相系統、VANOX 型顯微鏡（Olympus 公司，日本）；680 型酶標儀（Bio-Rad 公司，美國）；KD-TS1 型生物組織自動脫水機（浙江金華科迪儀器設備有限公司）；BMJ-A 型包埋機（常州中威電子儀器有限公司）；RM2015 型石蠟切片機（Leica 公司，德國）。
1.2 煅燒異種骨的制備
取市售新鮮健康成年牛松質骨，去除軟組織，加工成大小為 5 mm×5 mm×5 mm 的松質骨塊和直徑 2 mm、長 6 mm 的松質骨柱。經清洗、脫蛋白后置于馬弗爐內高溫煅燒 4～6 h，自然冷卻至室溫，純化水清洗、烘干后分裝并經輻照滅菌備用，見圖 1a。
以直徑 2 mm、長 6 mm 的羥基磷灰石生物陶瓷（四川大學生物材料中心）作為對照，材料孔隙率約 70%，經過輻射滅菌備用，見圖 1b。
圖1
兩種材料外觀
a. 煅燒異種骨；b. 羥基磷灰石生物陶瓷
Figure1. The appearance of materialsa. TBC; b. HA
1.3 細胞毒性實驗
參照 GB/T16886.5-2003 醫療器械生物學評價第 5 部分：體外細胞毒性試驗[12]相關規定，對煅燒異種骨細胞毒性進行檢測。
① 取煅燒異種骨，按照 0.2 g/mL 浸提比例置于不含血清的 L-DMEM 培養液中，37℃ 培養箱中浸提 72 h，獲得材料浸提液[13]。② 取 L929 小鼠成纖維細胞株，復蘇后培養至第 3 代，貼壁細胞經 0.25% 胰蛋白酶消化后離心富集（離心半徑 10 cm，1 200 r/min 離心 3 min）。用培養液調整細胞密度為 2×104 個/mL，制備細胞懸液，接種至 96 孔培養板，每孔 100 μL，37℃、CO2 培養箱內培養 24 h；棄培養液，加入含 10%FBS 的材料浸提液，每孔 200 μL；以單純含 10%FBS 的培養液作為空白對照組。兩組各設 3 個平行，每個平行 5 孔；實驗重復 3 次。③ 繼續培養至第 2、4、7 天，采用 MTT 法檢測波長 490 nm 處細胞吸光度（A）值，按照公式計算細胞相對增殖率（relative growth rate，RGR），RGR=材料浸提液組 A 值/空白對照組 A 值。參照有關醫用材料生物學評價方法中推薦的細胞毒性反應分級標準[14]判斷材料細胞毒性。其中 RGR>100%，細胞毒性為 0 級；80%～99%，1 級；50%～79%，2 級；30%～49%，3 級；1%～29%，4 級。細胞毒性 0 級或 1 級為合格，2 級應結合細胞形態分析，綜合評價；3～4 級為不合格。
1.4 細胞相容性實驗
將煅燒異種骨塊置于含 10%FBS 的培養基中，常溫浸泡 24 h 后置于 6 孔培養板中，每孔 3 塊。然后將濃度為 1×106 個/mL 的 L929 細胞懸液滴至骨塊上，每塊滴加 200 μL；37℃、CO2 培養箱內培養 4 h 后，加含 10%FBS 的培養基至淹沒骨塊；繼續于 37℃、CO2 培養箱內培養 4 d 后；取出骨塊用 2.5% 戊二醛緩沖溶液固定 72 h，純化水沖洗 3 次，冷凍干燥后掃描電鏡下觀察細胞在材料表面的生長情況，評價材料細胞相容性。
1.5 組織相容性實驗
參照 GB/T16886.6-1997 醫療器械生物學評價第 6 部分：植入后局部反應試驗[15]相關規定，對煅燒異種骨組織相容性進行檢測。
將 10 只新西蘭大白兔耳緣靜脈注射 3% 戊巴比妥鈉（1.0 mg/kg）麻醉后，雙側后肢脛骨內側剃毛，手術區域聚維酮碘溶液消毒，逐層切開并分離皮膚、皮下組織、肌肉、骨膜；用低速牙科鉆在脛骨內側皮質上鉆 3 個孔，孔直徑為 2 mm、孔間間距為 10 mm，穿透一側骨皮質達骨髓腔。左側孔內植入煅燒異種骨（實驗組），右側植入羥基磷灰石生物陶瓷（對照組）；材料垂直植入鉆孔內，直至與脛骨面平齊，見圖 2。術后紗布包扎切口，單籠飼養，允許患肢負重；連續 3 d 肌肉注射慶大霉素（1.5 萬 U/kg），每天 1 次。
圖2
實驗操作步驟
a. 牙科鉆在脛骨內側皮質上鉆孔；b. 植入材料
Figure2. Operation procedurea. Drilling holes on the cortical of medial tibia by a dental bur; b. Implanting the material
術后 4、26 周各取 5 只動物，過量麻醉處死。觀察切口愈合情況，然后按照原切口入路，大體觀察并取材。將包含植入材料及其周圍組織的組織塊置于 4% 甲醛緩沖液中固定，1 周后轉至 50% 甲酸中脫鈣 7～14 d，常規系列乙醇脫水，石蠟包埋。垂直植入體長軸方向進行連續切片，制備組織學切片，HE 染色，光鏡下觀察材料/組織界面炎癥程度、炎性細胞類型以及骨形成情況，評價材料組織相容性。
2 結果
2.1 細胞毒性實驗
培養第 2、4、7 天，細胞貼壁生長良好，密度均勻，胞體呈圓形、梭形或不規則三角形，無細胞溶解或死亡，細胞膜完整，細胞毒性為 0～1 級，合格。見圖 3。
圖3
L929細胞于煅燒異種骨浸提液中培養各時間點觀察（倒置相差顯微鏡×100）
a. 第 2 天； b. 第 4 天； c. 第 7 天
Figure3. Observation of L929 cells cultured with the leaching liquor of TBC at different days (Inverted phase contrast microscope×100)a. At the 2nd day; b. At the 4th day; c. At the 7th day
2.2 細胞相容性實驗
L929 細胞接種于煅燒異種骨表面 4 d 后，掃描電鏡下觀察可見細胞在材料表面附著生長，胞體不規則，有長短不一的細胞突起與其他胞體相連，并向孔洞中生長。見圖 4。
圖4
L929 細胞接種至煅燒異種骨 4 d 后掃描電鏡觀察
a. 細胞在材料表面增殖（×430）；b. 細胞向材料孔洞內爬行生長（×750）
Figure4. Scanning electron microscopy observation of L929 cells proliferation after cultured on surface of the TBC for 4 daysa. L929 cells proliferated on the surface of TBC (×430); b. L929 cells have migrated into the pores (×750)
2.3 組織相容性實驗
2.3.1 大體觀察 術后 4 周，實驗動物切口處均已有體毛覆蓋，愈合良好，無紅腫及瘢痕增生；切開皮膚可見肌肉色澤正常、彈性良好，無萎縮、硬化。取材后可見植入位置有不同程度骨痂形成。術后 26 周，實驗動物切口處觀察情況與 4 周一致，切開皮膚可見材料周圍組織顏色、質地正常，材料植入部位均有不同程度骨痂形成。兩組大體觀察情況無明顯差異。
2.3.2 組織學觀察 術后兩時間點兩組觀察結果基本一致。術后 4 周，兩組植入材料周圍組織均排列正常，材料孔隙均被骨髓組織填充，未見纖維性包裹，材料周圍組織無充血、壞死、積液、化膿等反應；均可見少量淋巴細胞浸潤，未見巨噬細胞，炎性反應為中度或者輕度；均可觀察到成骨細胞及新骨形成（圖 5、6）。
圖5
對照組術后 4 周 HE 染色觀察
a. 材料周圍組織排列正常，孔隙被骨髓組織填充（×40）；b. 材料孔內有大量新骨形成（×400） 紅箭頭示新生骨組織，黑箭頭示羥基磷灰石生物陶瓷材料； c. 可見整齊排列的成骨細胞（箭頭）（×400）；d. 材料孔隙內可見淋巴細胞（箭頭）（×1 000）
Figure5. HE staining observation of control group after HA implanted for 4 weeksa. The tissue arranged around HA was regularly, and the porosity was filled with bone marrow (×40); b. New bone formation were observed (×400) Red arrow showed the new bone, black arrow showed the HA; c. Osteoblasts (arrow) were observed (×400); d. Lymphocyte (arrow) were observed in pores (×1 000)
圖6
實驗組術后 4 周 HE 染色觀察
a. 材料周圍組織排列正常，孔隙被骨髓組織填充（×40）；b. 材料孔內有新骨形成（×400） 紅箭頭示新生骨組織，黑箭頭示煅燒異種骨材料；c. 可見整齊排列的成骨細胞（箭頭）（×400）；d. 材料孔隙內可見淋巴細胞（箭頭）（×1 000）
Figure6. HE staining observation of experimental group after TBC implanted for 4 weeksa. The tissue arranged around TBC was regularly, and the porosity filled with bone marrow (×40); b. New bone formation were observed (×400) Red arrow showed the new bone, black arrow showed the TBC; c. Osteoblasts (arrow) were observed (×400); d. Lymphocyte (arrow) were observed in pores (×1 000)
術后 26 周，兩組材料周圍組織排列正常，材料孔隙被骨髓組織填充；均未觀察到炎性細胞，無組織反應或者輕微組織反應；材料孔隙內可見大量新生骨組織（圖 7）。
圖7
兩組術后 26 周 HE 染色觀察
a. 實驗組材料周圍組織排列正常（×100）；b. 實驗組材料孔隙內可見大量新骨新生骨組織（箭頭），未見炎性細胞（×400）；c. 對照組材料周圍組織排列正常（×100）；d. 對照組材料孔隙內可見大量新生骨組織（箭頭），未見炎性細胞（×400）
Figure7. HE staining observation of 2 groups after 26 weeksa. The tissue arranged around TBC was regularly in experimental group (×100); b. New bone (arrow) formation were observed in experimental group, no inflammatory cells was observed (×400); c. The tissue arranged around HA was regularly in control group (×100); d. New bone (arrow) formation were observed in control group, no inflammatory cells was observed (×400)
3 討論
目前，同種異體骨被臨床廣泛使用，但其來源相對不足，更多學者開始關注其替代材料的研究，其中以人工合成材料和異種骨的研究較多。常見人工骨材料為磷酸鈣類合成物質，如羥基磷灰石、β-磷酸三鈣等，此類物質具有良好的生物相容性[16-17]，但結構上與天然骨有較大差異且生物降解性差[18]，限制了其在骨缺損修復中的廣泛應用。
異種骨具有與人骨組織相似的結構，可作為骨移植替代材料，但難點在于如何消除或降低其抗原性。研究表明，異種骨的各種細胞成分是其抗原性的主要來源，膠原成分抗原性弱，礦物質成分無抗原性[19-20]。常用的異種骨去抗原處理方法有深低溫冷凍、反復凍融、煅燒、交聯、脫蛋白、輻照或多種方法聯合運用等[21]，其中高溫煅燒可以有效去除抗原性。經高溫煅燒的牛松質骨材料，保留了骨的天然孔隙結構，與人骨相似。劉斌鈺等[22]的研究表明，煅燒骨異種骨孔隙率達 80% 以上，孔隙大小為 190～750 μm，均為>100 μm 的有效孔[7]。而多孔結構為成骨細胞增殖提供了較大的表面，有利于骨單位形成，也有利于材料降解，適宜新生骨組織細胞的長入，具有良好的骨傳導性[18]。
鄭啟新等[23]通過溶血試驗、全身急性毒性試驗等，證明煅燒牛松質骨有可靠的生物安全性；高媛等[24]將煅燒牛骨與成骨細胞共同培養，結果表明煅燒牛骨有良好的成骨細胞親和性；許永華等[25]將兔骨膜成骨細胞接種至煅燒牛骨表面并培養，結果表明煅燒牛骨與成骨細胞有良好的組織相容性。本研究中采用脫蛋白聯合高溫煅燒方法制備來源于牛的煅燒異種骨，通過細胞毒性和生物相容性實驗表明，煅燒異種骨無細胞毒性，有良好的細胞相容性。Li 等[26]研究表明，羥基磷灰石生物陶瓷材料有良好的生物相容性，因此本研究采用該材料作為對照組。實驗結果表明，煅燒異種骨材料和羥基磷灰石生物陶瓷材料都具有良好組織相容性，植入 4 周后 HE 染色可見成骨細胞與新生骨組織，26 周后有大量新生骨組織。
綜上述，煅燒異種骨材料具有良好的生物相容性，并且具有天然孔隙結構和一定的骨傳導性。目前國外已有將煅燒異種骨產品成功運用于口腔學和創傷學的報道[27-28]，國內也有采用煅燒異種骨產品修復額骨缺損的報道[29]，提示煅燒異種骨是一種理想的骨修復材料，在骨缺損修復領域有一定的應用前景。但因煅燒骨材料力學強度不夠且缺乏骨誘導活性，目前僅能應用于非負重部位的植骨，其力學性能和骨誘導活性的改進仍有待進一步研究。
在臨床上，自體骨移植被認為是骨缺損修復的“金標準”[1]，但存在二次創傷、移植材料稀缺等不足，因而來源豐富的異種骨成為研究熱點[2-3]。理想的骨缺損修復材料必須有良好的生物相容性、骨傳導性、生物降解性[4]、低免疫原性以及類似天然骨的孔隙結構。牛松質骨經高溫煅燒制得的煅燒異種骨是一種骨無機物有序晶體，其主要成分是高純度的羥基磷灰石[5]，具有與人骨相似的鈣磷比和孔隙結構[6]，高溫煅燒在有效去除抗原的同時保留了天然多孔結構，為新生骨組織和血管的長入提供了理想的通道[7-8]，是一種潛在的理想骨缺損修復材料。對煅燒骨的制備工藝以及理化性質的研究已有諸多報道[9-10]，為了解煅燒異種骨的生物相容性，本實驗按照國際標準化組織 ISO10993 醫療器械和生物材料生物學評價試驗指南（ISO10993-1）標準[11]，選擇了細胞毒性、細胞相容性與組織相容性試驗來進行評價，以期為煅燒骨作為骨缺損修復材料用于臨床提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康成年新西蘭大白兔 10 只，體質量（3.0±0.2）kg，雌雄不限，購自北京市昌揚西山養殖場；中國輻射防護研究院 GLP 實驗中心負責飼養，實驗中對動物的處置符合動物倫理學要求。
L929 小鼠成纖維細胞株（中國科學院上海細胞生物學研究所）。L-DMEM 培養液、FBS（HyClone 公司，美國）。3111 型 CO2 培養箱（Thermo 公司，美國）；JSM-6360LV 型掃描電鏡（日本電子株式會社）；IX71 倒置相差顯微鏡及照相系統、VANOX 型顯微鏡（Olympus 公司，日本）；680 型酶標儀（Bio-Rad 公司，美國）；KD-TS1 型生物組織自動脫水機（浙江金華科迪儀器設備有限公司）；BMJ-A 型包埋機（常州中威電子儀器有限公司）；RM2015 型石蠟切片機（Leica 公司，德國）。
1.2 煅燒異種骨的制備
取市售新鮮健康成年牛松質骨，去除軟組織，加工成大小為 5 mm×5 mm×5 mm 的松質骨塊和直徑 2 mm、長 6 mm 的松質骨柱。經清洗、脫蛋白后置于馬弗爐內高溫煅燒 4～6 h，自然冷卻至室溫，純化水清洗、烘干后分裝并經輻照滅菌備用，見圖 1a。
以直徑 2 mm、長 6 mm 的羥基磷灰石生物陶瓷（四川大學生物材料中心）作為對照，材料孔隙率約 70%，經過輻射滅菌備用，見圖 1b。
圖1
兩種材料外觀
a. 煅燒異種骨；b. 羥基磷灰石生物陶瓷
Figure1. The appearance of materialsa. TBC; b. HA
1.3 細胞毒性實驗
參照 GB/T16886.5-2003 醫療器械生物學評價第 5 部分：體外細胞毒性試驗[12]相關規定，對煅燒異種骨細胞毒性進行檢測。
① 取煅燒異種骨，按照 0.2 g/mL 浸提比例置于不含血清的 L-DMEM 培養液中，37℃ 培養箱中浸提 72 h，獲得材料浸提液[13]。② 取 L929 小鼠成纖維細胞株，復蘇后培養至第 3 代，貼壁細胞經 0.25% 胰蛋白酶消化后離心富集（離心半徑 10 cm，1 200 r/min 離心 3 min）。用培養液調整細胞密度為 2×104 個/mL，制備細胞懸液，接種至 96 孔培養板，每孔 100 μL，37℃、CO2 培養箱內培養 24 h；棄培養液，加入含 10%FBS 的材料浸提液，每孔 200 μL；以單純含 10%FBS 的培養液作為空白對照組。兩組各設 3 個平行，每個平行 5 孔；實驗重復 3 次。③ 繼續培養至第 2、4、7 天，采用 MTT 法檢測波長 490 nm 處細胞吸光度（A）值，按照公式計算細胞相對增殖率（relative growth rate，RGR），RGR=材料浸提液組 A 值/空白對照組 A 值。參照有關醫用材料生物學評價方法中推薦的細胞毒性反應分級標準[14]判斷材料細胞毒性。其中 RGR>100%，細胞毒性為 0 級；80%～99%，1 級；50%～79%，2 級；30%～49%，3 級；1%～29%，4 級。細胞毒性 0 級或 1 級為合格，2 級應結合細胞形態分析，綜合評價；3～4 級為不合格。
1.4 細胞相容性實驗
將煅燒異種骨塊置于含 10%FBS 的培養基中，常溫浸泡 24 h 后置于 6 孔培養板中，每孔 3 塊。然后將濃度為 1×106 個/mL 的 L929 細胞懸液滴至骨塊上，每塊滴加 200 μL；37℃、CO2 培養箱內培養 4 h 后，加含 10%FBS 的培養基至淹沒骨塊；繼續于 37℃、CO2 培養箱內培養 4 d 后；取出骨塊用 2.5% 戊二醛緩沖溶液固定 72 h，純化水沖洗 3 次，冷凍干燥后掃描電鏡下觀察細胞在材料表面的生長情況，評價材料細胞相容性。
1.5 組織相容性實驗
參照 GB/T16886.6-1997 醫療器械生物學評價第 6 部分：植入后局部反應試驗[15]相關規定，對煅燒異種骨組織相容性進行檢測。
將 10 只新西蘭大白兔耳緣靜脈注射 3% 戊巴比妥鈉（1.0 mg/kg）麻醉后，雙側后肢脛骨內側剃毛，手術區域聚維酮碘溶液消毒，逐層切開并分離皮膚、皮下組織、肌肉、骨膜；用低速牙科鉆在脛骨內側皮質上鉆 3 個孔，孔直徑為 2 mm、孔間間距為 10 mm，穿透一側骨皮質達骨髓腔。左側孔內植入煅燒異種骨（實驗組），右側植入羥基磷灰石生物陶瓷（對照組）；材料垂直植入鉆孔內，直至與脛骨面平齊，見圖 2。術后紗布包扎切口，單籠飼養，允許患肢負重；連續 3 d 肌肉注射慶大霉素（1.5 萬 U/kg），每天 1 次。
圖2
實驗操作步驟
a. 牙科鉆在脛骨內側皮質上鉆孔；b. 植入材料
Figure2. Operation procedurea. Drilling holes on the cortical of medial tibia by a dental bur; b. Implanting the material
術后 4、26 周各取 5 只動物，過量麻醉處死。觀察切口愈合情況，然后按照原切口入路，大體觀察并取材。將包含植入材料及其周圍組織的組織塊置于 4% 甲醛緩沖液中固定，1 周后轉至 50% 甲酸中脫鈣 7～14 d，常規系列乙醇脫水，石蠟包埋。垂直植入體長軸方向進行連續切片，制備組織學切片，HE 染色，光鏡下觀察材料/組織界面炎癥程度、炎性細胞類型以及骨形成情況，評價材料組織相容性。
2 結果
2.1 細胞毒性實驗
培養第 2、4、7 天，細胞貼壁生長良好，密度均勻，胞體呈圓形、梭形或不規則三角形，無細胞溶解或死亡，細胞膜完整，細胞毒性為 0～1 級，合格。見圖 3。
圖3
L929細胞于煅燒異種骨浸提液中培養各時間點觀察（倒置相差顯微鏡×100）
a. 第 2 天； b. 第 4 天； c. 第 7 天
Figure3. Observation of L929 cells cultured with the leaching liquor of TBC at different days (Inverted phase contrast microscope×100)a. At the 2nd day; b. At the 4th day; c. At the 7th day
2.2 細胞相容性實驗
L929 細胞接種于煅燒異種骨表面 4 d 后，掃描電鏡下觀察可見細胞在材料表面附著生長，胞體不規則，有長短不一的細胞突起與其他胞體相連，并向孔洞中生長。見圖 4。
圖4
L929 細胞接種至煅燒異種骨 4 d 后掃描電鏡觀察
a. 細胞在材料表面增殖（×430）；b. 細胞向材料孔洞內爬行生長（×750）
Figure4. Scanning electron microscopy observation of L929 cells proliferation after cultured on surface of the TBC for 4 daysa. L929 cells proliferated on the surface of TBC (×430); b. L929 cells have migrated into the pores (×750)
2.3 組織相容性實驗
2.3.1 大體觀察 術后 4 周，實驗動物切口處均已有體毛覆蓋，愈合良好，無紅腫及瘢痕增生；切開皮膚可見肌肉色澤正常、彈性良好，無萎縮、硬化。取材后可見植入位置有不同程度骨痂形成。術后 26 周，實驗動物切口處觀察情況與 4 周一致，切開皮膚可見材料周圍組織顏色、質地正常，材料植入部位均有不同程度骨痂形成。兩組大體觀察情況無明顯差異。
2.3.2 組織學觀察 術后兩時間點兩組觀察結果基本一致。術后 4 周，兩組植入材料周圍組織均排列正常，材料孔隙均被骨髓組織填充，未見纖維性包裹，材料周圍組織無充血、壞死、積液、化膿等反應；均可見少量淋巴細胞浸潤，未見巨噬細胞，炎性反應為中度或者輕度；均可觀察到成骨細胞及新骨形成（圖 5、6）。
圖5
對照組術后 4 周 HE 染色觀察
a. 材料周圍組織排列正常，孔隙被骨髓組織填充（×40）；b. 材料孔內有大量新骨形成（×400） 紅箭頭示新生骨組織，黑箭頭示羥基磷灰石生物陶瓷材料； c. 可見整齊排列的成骨細胞（箭頭）（×400）；d. 材料孔隙內可見淋巴細胞（箭頭）（×1 000）
Figure5. HE staining observation of control group after HA implanted for 4 weeksa. The tissue arranged around HA was regularly, and the porosity was filled with bone marrow (×40); b. New bone formation were observed (×400) Red arrow showed the new bone, black arrow showed the HA; c. Osteoblasts (arrow) were observed (×400); d. Lymphocyte (arrow) were observed in pores (×1 000)
圖6
實驗組術后 4 周 HE 染色觀察
a. 材料周圍組織排列正常，孔隙被骨髓組織填充（×40）；b. 材料孔內有新骨形成（×400） 紅箭頭示新生骨組織，黑箭頭示煅燒異種骨材料；c. 可見整齊排列的成骨細胞（箭頭）（×400）；d. 材料孔隙內可見淋巴細胞（箭頭）（×1 000）
Figure6. HE staining observation of experimental group after TBC implanted for 4 weeksa. The tissue arranged around TBC was regularly, and the porosity filled with bone marrow (×40); b. New bone formation were observed (×400) Red arrow showed the new bone, black arrow showed the TBC; c. Osteoblasts (arrow) were observed (×400); d. Lymphocyte (arrow) were observed in pores (×1 000)
術后 26 周，兩組材料周圍組織排列正常，材料孔隙被骨髓組織填充；均未觀察到炎性細胞，無組織反應或者輕微組織反應；材料孔隙內可見大量新生骨組織（圖 7）。
圖7
兩組術后 26 周 HE 染色觀察
a. 實驗組材料周圍組織排列正常（×100）；b. 實驗組材料孔隙內可見大量新骨新生骨組織（箭頭），未見炎性細胞（×400）；c. 對照組材料周圍組織排列正常（×100）；d. 對照組材料孔隙內可見大量新生骨組織（箭頭），未見炎性細胞（×400）
Figure7. HE staining observation of 2 groups after 26 weeksa. The tissue arranged around TBC was regularly in experimental group (×100); b. New bone (arrow) formation were observed in experimental group, no inflammatory cells was observed (×400); c. The tissue arranged around HA was regularly in control group (×100); d. New bone (arrow) formation were observed in control group, no inflammatory cells was observed (×400)
3 討論
目前，同種異體骨被臨床廣泛使用，但其來源相對不足，更多學者開始關注其替代材料的研究，其中以人工合成材料和異種骨的研究較多。常見人工骨材料為磷酸鈣類合成物質，如羥基磷灰石、β-磷酸三鈣等，此類物質具有良好的生物相容性[16-17]，但結構上與天然骨有較大差異且生物降解性差[18]，限制了其在骨缺損修復中的廣泛應用。
異種骨具有與人骨組織相似的結構，可作為骨移植替代材料，但難點在于如何消除或降低其抗原性。研究表明，異種骨的各種細胞成分是其抗原性的主要來源，膠原成分抗原性弱，礦物質成分無抗原性[19-20]。常用的異種骨去抗原處理方法有深低溫冷凍、反復凍融、煅燒、交聯、脫蛋白、輻照或多種方法聯合運用等[21]，其中高溫煅燒可以有效去除抗原性。經高溫煅燒的牛松質骨材料，保留了骨的天然孔隙結構，與人骨相似。劉斌鈺等[22]的研究表明，煅燒骨異種骨孔隙率達 80% 以上，孔隙大小為 190～750 μm，均為>100 μm 的有效孔[7]。而多孔結構為成骨細胞增殖提供了較大的表面，有利于骨單位形成，也有利于材料降解，適宜新生骨組織細胞的長入，具有良好的骨傳導性[18]。
鄭啟新等[23]通過溶血試驗、全身急性毒性試驗等，證明煅燒牛松質骨有可靠的生物安全性；高媛等[24]將煅燒牛骨與成骨細胞共同培養，結果表明煅燒牛骨有良好的成骨細胞親和性；許永華等[25]將兔骨膜成骨細胞接種至煅燒牛骨表面并培養，結果表明煅燒牛骨與成骨細胞有良好的組織相容性。本研究中采用脫蛋白聯合高溫煅燒方法制備來源于牛的煅燒異種骨，通過細胞毒性和生物相容性實驗表明，煅燒異種骨無細胞毒性，有良好的細胞相容性。Li 等[26]研究表明，羥基磷灰石生物陶瓷材料有良好的生物相容性，因此本研究采用該材料作為對照組。實驗結果表明，煅燒異種骨材料和羥基磷灰石生物陶瓷材料都具有良好組織相容性，植入 4 周后 HE 染色可見成骨細胞與新生骨組織，26 周后有大量新生骨組織。
綜上述，煅燒異種骨材料具有良好的生物相容性，并且具有天然孔隙結構和一定的骨傳導性。目前國外已有將煅燒異種骨產品成功運用于口腔學和創傷學的報道[27-28]，國內也有采用煅燒異種骨產品修復額骨缺損的報道[29]，提示煅燒異種骨是一種理想的骨修復材料，在骨缺損修復領域有一定的應用前景。但因煅燒骨材料力學強度不夠且缺乏骨誘導活性，目前僅能應用于非負重部位的植骨，其力學性能和骨誘導活性的改進仍有待進一步研究。
