引用本文： 袁維, 鄭軍, 錢晉宇, 周小小, 王明輝, 王秀會. 重組人 BMP-2 緩釋作用于基質血管成分細胞促進大鼠脊柱融合的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(7): 862-869. doi: 10.7507/1002-1892.201703043 復制
脊柱融合是骨科常用手術方式，如何提高融合率一直是研究重點。自體骨移植可提供豐富的生物學環境，包括成骨細胞、MSCs 以及良好的骨傳導作用，被認為是脊柱融合的金標準；但其也存在取骨區頑固性疼痛、出現感染可能、較高假關節形成發生率及骨量來源受限等問題[1-2]。應用骨組織工程學方法是目前研究熱點，有可能解決上述問題，可形成較高的骨質量并縮短骨融合時間[3]。
按照臨床實際需要，如果能從患者自身提取一類細胞，不通過體外擴增、純化，采用“一步法”直接植入體內進行修復，是一種比較理想的方式；同時與一種高效、安全的生長因子結合是一種可能的解決辦法。本研究基于上述設想，將攜帶重組人 BMP-2（recombinant human BMP-2，rhBMP-2）的 β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP）與載體支架脫鈣骨基質（decalcified bone matrix，DBX）復合，再與新鮮提取的基質血管成分細胞（stromal vascular fraction cells，SVFs）混合，提取的細胞不進行體外擴增，進行“一步法”移植于大鼠腰椎后外側，在 rhBMP-2 緩釋作用下促進脊柱融合，是一種組織工程學方法的嘗試，以期為未來臨床應用奠定理論基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
健康 4 月齡 SD 大鼠 42 只，雌雄不限，體質量（200±15）g，由上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院實驗動物中心提供。rhBMP-2、BCA 法蛋白定量試劑盒（Sigma 公司，美國）。DBX 選擇直徑 212～850 μm 的同種異體凍干脫鈣骨基質（上海貝奧路生物材料有限公司）與透明質酸鈉混合而成；β-TCP（上海貝奧路生物材料有限公司）；骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN；Santa Cruz 公司，美國）。倒置顯微鏡（Olympus 公司，日本）；Skyscan1172 micro-CT（SkyScan 公司，比利時）。
1.2 SVFs 提取
取 10 只 SD 大鼠雙側腹股溝區皮下脂肪，將脂肪組織用 PBS 反復沖洗除去血液，剔除血管。無菌操作下將脂肪倒入 50 mL 試管內，4℃ 以 215×g 離心 10 min；轉移上層脂肪組織至新試管內，加入同體積 PBS 混勻，同上法離心 5 min。加入 0.1% Ⅰ 型膠原酶，于震蕩箱內 37℃ 消化 40 min；然后同上法離心 10 min，保留細胞集落。用 PBS 懸浮細胞，200 目濾網過濾，以 150×g 離心 5 min。去除上清液，加入 10 mL 紅細胞裂解液，室溫孵育 10 min；加入 2 倍體積含 5 mmol/L EDTA 的 PBS，200 目濾網過濾，150×g 離心 5 min，保留沉淀，PBS 混勻。用錐蟲藍拒染法檢測細胞活性，計數細胞，備移植實驗用。倒置顯微鏡觀察 SVFs 形態。
1.3 rhBMP-2/β-TCP 緩釋載體構建
1.3.1 仿生磷灰石涂層 β-TCP 的構建 按照文獻[4]方法，經過 2 次過飽和模擬體液（supersaturated simulated body fluid，SBF）浸泡處理方法構建仿生磷灰石涂層 β-TCP。具體方法：① SBF1 配制：CaCl2 0.347 g、MgCl2·6H2O 0.380 g、NaHCO3 0.441 g 及 K2HPO4 0.285 g 加入 250 mL 雙蒸水中進行溶解，調整溶液 pH 值為 6；繼續加入 Na2SO4 0.089 g、KCl 0.280 g 和 NaCl 10.01 g，并調整 pH 值至 6.5。② SBF2 配制：CaCl2 0.347 g 和 K2HPO4·3H2O 0.285 g 加入 250 mL 雙蒸水中進行溶解，調整溶液 pH 值至 6；最后加入 NaCl 10.01 g，并調整 pH 值至 6.8。③ 仿生磷灰石涂層 β-TCP 構建：保持上述 2 種 SBF 溫度為 37℃，移植實驗所用的 β-TCP 放入 SBF1 浸泡 24 h 后，再放入 SBF2 浸泡 24 h，然后用雙蒸水沖洗去除過多金屬陽離子，通過干燥機干燥后得到仿生磷灰石涂層 β-TCP 粉末。
1.3.2 rhBMP-2 體外緩釋效應測定 rhBMP-2/β-TCP 緩釋載體構建：取 10 μg rhBMP-2（200 μg/mL）與 50 mg 仿生磷灰石涂層 β-TCP 粉末（直徑 200～300 mm）混合（實驗組），–180℃ 保存 12 h，然后在真空干燥機內風干，經 17×g 離心使粉末集中。將上述緩釋載體粉末分別加入 6 個 U 型試管中，加入 1 mL PBS 溶液（pH7.4）適度震蕩，每個試管分別于 0、1、4、7、10、14 d 取上清液，每個時間點重復 3 次，按照 BCA 法蛋白定量試劑盒說明書方法，測定 rhBMP-2 蛋白累積釋放量，繪制累積釋放曲線；以未經仿生磷灰石涂層的單純 50 mg β-TCP 顆粒與 10 μg rhBMP-2 混合作為對照組。
1.4 動物實驗分組及方法
1.4.1 移植樣品術前準備 rhBMP-2 經過處理構建為 rhBMP-2/β-TCP 緩釋載體用于以下移植實驗。A 組 PBS+DBX：取 300 mL DBX 與 50 mL PBS 混合。B 組 rhBMP-2+DBX：取 300 mL DBX 與 10 μg rhBMP-2（200 μg/mL）混合。C 組 SVFs+DBX：取 300 mL DBX 與 1×105 個/μL SVFs 混合。D 組 rhBMP-2+SVFs+DBX：取 300 mL DBX 與 10 μg rhBMP-2（200 μg/mL）和 1×105 個/μL SVFs 混合。具體步驟以 D 組為例：經仿生磷灰石涂層處理的含有 10 μg rhBMP-2/β-TCP 與 300 mL DBX 混合，放入無菌 Eppendorf 管中并封口備用；由 2 名術者同時進行手術，根據手術進度，提取的 SVFs 被送入手術室，由助手將 1×105 個/μL SVFs+10 μg rhBMP-2/β-TCP+300 mL DBX 混合為移植使用。所有操作都在細胞培養超凈臺內進行，避免樣品污染。
1.4.2 實驗分組及手術方法 將 32 只 SD 大鼠隨機分為 4 組，每組 8 只。A、B、C、D 組移植物分別為 PBS+DBX、rhBMP-2+DBX、SVFs+DBX 和 rhBMP-2+SVFs+DBX。手術方法：采用氯胺酮（40 mg/kg）聯合地西泮（2 mg/kg）腹腔注射麻醉。麻醉成功后，取腰背側正中入路，雙側髂嵴對應 L6 椎體，手術切口以 L4、5 為中心，長約 4 cm。距棘突兩側約 2 mm 各作一旁正中切口切開筋膜，用神經剝離子沿棘突鈍性分離椎旁肌至關節突關節，顯露雙側 L4 和 L5 橫突并切斷橫突間韌帶，用高速磨鉆打磨橫突皮質至松質骨面點狀滲血，術中防止用力過猛以免發生橫突骨折。無菌生理鹽水沖洗傷口后，于雙側橫突間植入各組移植物。4-0 Vicryl 可吸收縫線逐層關閉切口，術后大鼠自由活動。術后連續 3 d 給予頸部皮下注射止痛藥卡洛芬，2 次/d，每次 0.2 mg；口服復方新諾明抗生素藥水 1 周后改用正常純凈水。
1.4.3 X 線片觀察脊柱融合情況 術后 8 周行 X 線片評估脊柱融合情況，兩側橫突間存在骨性連接為融合，兩側或單側未融合為失敗融合。
1.4.4 手動觸診評價脊柱融合情況 術后 8 周，32 只大鼠采用 CO2 窒息法處死各組動物，取出腰椎標本后，由 3 名有經驗的脊柱外科醫生獨立進行標本屈曲、伸展和側屈活動測試，對抗融合節段是否產生活動，有活動出現及任何一側有活動則認為是失敗融合。
1.4.5 micro-CT評估 手動觸診評價后將各組標本置于 10% 甲醛浸泡 48 h 以上，然后行 micro-CT 掃描獲得高分辨率圖像，掃描分辨率 19.73 mm、電壓 55 kV、電流 181 mA，橫突間存在骨性連接為骨融合。運用 micro-CT 中 CTAn、CTVol 和 Data-Viewer 3 種軟件進行骨形成情況的三維重建和數據分析，根據每側腰椎形成骨塊確定感興趣區域范圍，分析骨密度（bone mineral density，BMD）以及骨體積分數（為感興趣區域內代表骨塊結構體素的總體積與區域內所有體素的總體積之比）。
1.4.6 組織學觀察 取 10% 甲醛浸泡 48 h 后的各組脊柱標本，修剪 L4、5 間的融合骨塊后，用 Cal-Ex 脫鈣處理 1 周左右，經石蠟包埋、切片（片厚 5 μm），行 HE 染色及 Masson 三色染色（礦化組織呈紅色，連接組織呈藍色）觀察骨形成情況。
1.4.7 免疫組織化學染色觀察 取上述部分切片，行 OCN 免疫組織化學染色，鏡下觀察新骨形成情況（陽性染色為棕黃色）。
1.5 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 法；計數資料以率表示，組間比較采用 χ2 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 SVFs 形態觀察
倒置顯微鏡觀察示，新鮮分離的細胞絕大部分形態為小圓形。接種 4 h 開始貼壁，6～18 h 細胞處于生長停滯期，24 h 完全貼壁。24 h 后細胞開始伸展，增殖加速，形態由圓形變為梭形，胞體形成突起。48 h 后細胞伸展明顯，多數呈成纖維細胞樣梭形，部分呈三角形。培養 7 d 細胞達 85% 融合，然后進行傳代培養。見圖 1。
圖1
新鮮分離的 SVFs 形態學觀察（倒置顯微鏡×100）
Figure1.
Morphological observation of the fresh SVFs (Inver- ted microscope×100)
2.2 rhBMP-2 蛋白體外緩釋效應測定
對照組 rhBMP-2 蛋白于 1 d 時累積釋放量已達 87% 左右，為爆發性釋放，之后 2 周內幾乎釋放靜止；而實驗組經仿生磷灰石涂層的 β-TCP 可使 rhBMP-2 緩慢釋放，14 d 時 rhBMP-2 蛋白體外累計釋放量為 40% 左右。見圖 2。
圖2
經仿生磷灰石涂層及未經涂層的 β-TCP 中 rhBMP-2 的累積釋放曲線
Figure2.
Cumulative release curve of rhBMP-2 in coated β- TCP and uncoated β-TCP
2.3 動物實驗相關觀測
2.3.1 X 線片觀察 A 組 L4、5 橫突間缺乏骨性連接；C 組橫突間僅有少量骨性連接；B、D 組橫突間均呈現出融合，D 組融合骨形態更密實、結構更緊湊。見圖 3。A、B、C、D 組融合率分別為 12.5%（1/8）、75.0%（6/8）、37.5（3/8）、100%（8/8），組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。
圖3
術后 8 周各組大鼠 X 線片觀察
a. A 組（箭頭示橫突間存在明顯間隙）；b. B 組；c. C 組（箭頭示橫突間存在間隙）；d. D 組
Figure3. X-ray film observation in each group at 8 weeksa. Group A (Arrow for the obvious gap between the transverse processes); b. Group B; c. Group C (Arrow for the obvious gap between the transverse processes); d. Group D
2.3.2 手動觸診評價 手動觸診評價顯示，A、B、C、D 組融合率分別為 12.5%（1/8）、75.0%（6/8）、37.5（3/8）、100%（8/8），組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。
2.2.3 micro-CT 觀察 A 組無骨橋連接兩側橫突；C 組僅見單側脊柱融合；B、D 組可見骨橋連接形成融合，D 組形成的骨質量優于 B 組。見圖 4。A、B、C、D 組融合率分別為 12.5%（1/8）、75.0%（6/8）、37.5（3/8）、100%（8/8），組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。
圖4
術后 8 周各組大鼠 micro-CT 評估脊柱融合情況
從左至右分別為 A、B、C、D 組 a. 三維重建；b. 冠狀面圖像
Figure4. Spinal fusion observation in each group at 8 weeks by micro-CTFrom left to right for groups A, B, C, and D, respectively a. Three-dimensional reconstruction; b. Coronal plane image
A、B、C、D 組 BMD 分別為（1.37±0.05）、（1.50±0.04）、（1.45±0.09）、（1.61±0.44）g/cm3，骨體積分數分別為 10.58%±2.25%、17.55%±3.23%、13.20%±2.81%、23.07%±5.59%。BMD 及骨體積分數 D 組顯著高于其余 3 組，B 組高于 A、C 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A、C 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
2.3.4 組織學觀察 ① HE 染色：A 組 DBX 間僅為纖維組織連接；B 組 DBX 間有軟骨細胞連接；C 組 DBX 間有血管基質層細胞存在，但因缺乏生長因子刺激，未形成有效骨連接；D 組 DBX 間有大量軟骨細胞連接，且在 DBX 之間有軟骨內骨化形成的“骨橋”形成。見圖 5。② Masson 三色染色：A 組包含大量未礦化的 DBX 顆粒，其邊緣較銳利，之間僅以纖維組織連接；B 組 DBX 顆粒邊緣被侵蝕，新生的肥大軟骨細胞參與骨塑形過程；C 組 DBX 顆粒間以細胞連接為主，為植入的 SVFs；D 組有大量軟骨細胞出現，塑形過程中有類似骨髓空洞形成，伴有骨基質沉積，類似長骨的礦化過程，見圖 6。
圖5
術后 8 周各組 HE 染色觀察（×200）
a. A 組（箭頭示纖維組織連接）；b. B 組（箭頭示肥大軟骨細胞）；c. C 組（箭頭示 SVFs）；d. D 組（箭頭示肥大軟骨細胞）
Figure5. HE staining observation in each group at 8 weeks (×200)a. Group A (Arrow for fiber connection); b. Group B (Arrow for hypertrophic chondrocytes); c. Group C (Arrow for SVFs); d. Group D (Arrow for hypertrophic chondrocytes)
圖6
術后 8 周各組 Masson 三色染色觀察（×200）
箭頭示新骨形成 a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure6. Masson trichrome staining observation in each group at 8 weeks (×200)Arrow for new bone formation a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.3.5 OCN 免疫組織化學染色觀察 B、D 組塑形的 DBX 周圍有大量 OCN 染色陽性表現，D 組表達量更高；A、C 組 OCN 染色強度較低。見圖 7。
圖7
術后 8 周各組 OCN 免疫組織化學染色觀察（×400）
箭頭示 OCN 陽性表達 a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure7. OCN immunohistochemical staining observation in each group at 8 weeks (×400)Arrow for OCN positive expression a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
3 討論
3.1 SVFs 作為種子細胞的優勢
在組織工程研究中，種子細胞是非常重要的一環。目前干細胞研究是主流方向，如 BMSCs 和脂肪來源干細胞（adipose derived stem cells，ADSCs），但對于臨床實際應用仍有一定距離，如 BMSCs 來源受限，且取材對自體損傷較大[5]；ADSCs 可避免上述問題，但提取后需要體外培養、傳代及純化，人為增加了感染風險，限制了其實際應用[6-7]。本實驗采用 SVFs 作為移植細胞，SVFs 是從新鮮脂肪組織提取的混雜細胞群，主要包括 ADSCs、內皮細胞、血管平滑肌細胞/周細胞和其他部分血液來源細胞（粒細胞、單核細胞、淋巴細胞及造血干細胞等）等[8-9]。SVFs 與 ADSCs 比較具有以下優點：① 無需經 2～3 周傳代培養，提取分離操作在數小時內即可完成，并能即時用于臨床治療；② 取材容易，來源充分，并可分泌多種細胞因子；③ 含有大量多向分化潛能的基質干細胞，可向軟骨細胞、骨細胞等多種成體細胞分化，是組織工程學較理想的種子細胞。Varma 等[10]進行了一項對比研究，從人的脂肪組織中分離出 SVFs 和 ADSCs（第 4 代），從細胞表型分析兩者基本近似，主要是 CD34+ CD117+ HLADR+；體外誘導成骨能力方面，基因表達（Runx2）、ALP 活性以及 OCN 形成等方面兩者也基本相同。所以，本實驗選擇 SVFs 作為種子細胞，不需要通過體外純化，可應用“一步法”直接移植進行脊柱融合。
3.2 構建具有緩釋作用的 rhBMP-2
rhBMP-2 是目前被美國食品和藥物管理局（FDA）同意應用于人身上的一類生長因子，具有良好的骨修復和骨再生效果；但因其是水溶性蛋白并且半衰期較短，在體內降解較快，為獲得良好的融合效果，臨床上常使用超生理劑量，這種大劑量使用出現了一些不良反應，如局部炎性反應、異位骨化、軟組織水腫以及激發破骨細胞活躍等[11-13]，影響治療效果。如何使 rhBMP-2 在體內緩慢釋放，維持植入部位較高藥物濃度，提高骨融合率的同時避免并發癥的發生，是目前研究熱點。
為使生長因子或蛋白達到持續作用或緩釋效果，有采用干細胞轉染生長因子基因的方法，如 Wang 等[14]通過腺病毒攜帶的 rhBMP-2 轉染 BMSCs，Hsu 等[15]通過腺病毒攜帶的 rhBMP-2 轉染 ADSCs，雖然都取得了不錯的結果，但很難在臨床實際中應用，主要問題是體外需要較長時間構建，此外還有病毒載體的問題[16]。除了基因轉染的方法，還可使生長因子包裹或吸附至釋放載體或支架上[17-18]，從而阻止多肽鏈解離。為了使 rhBMP-2 達到局部緩慢釋放的作用，本實驗選用 β-TCP 作為載體，通過仿生磷灰石方法使 rhBMP-2 涂層至 β-TCP 顆粒上[4, 19]，然后應用凍干法使 rhBMP-2 結合到 β-TCP 上。體外實驗結果表明該方法可使 rhBMP-2 持續釋放，14 d 達 40% 左右釋放，而單純 rhBMP-2 結合 β-TCP 幾乎在 1～2 d 時間內達到完全釋放，觀察的 2 周內近乎零釋放。因此該方法使 rhBMP-2 達到了緩釋作用于 SVFs 獲得骨再生的效果。
3.3 rhBMP-2 緩釋作用 SVFs 在脊柱融合中的優勢
骨組織形成有兩種方式，即膜內成骨和軟骨內成骨[20]。前者的新生骨組織在結締組織膜中由間充質細胞直接形成，后者是指結締組織內的間充質細胞首先分化為軟骨組織，然后在軟骨組織的基礎上進行鈣化成骨。從本實驗結果看，主要以軟骨內成骨方式形成新骨，植入 SVFs 與 rhBMP-2，rhBMP-2 除了直接作用于移植的 SVFs，也可使體內 BMSCs 向成骨轉化，提高了成骨效率，從成骨質量上 D 組優于 B 組。
對脊柱融合效果進行分析時，我們選取橫突之間作為檢測范圍，與 Boden 等[21]報道相一致，他們認為脊柱融合的外圍部分即鄰近橫突處，最易形成骨性連接，而在融合范圍的中央部分最易形成假關節，因為橫突細小，對移植物的中央部位血液供應少，需要血管再化生。本實驗通過 micro-CT 和組織學檢測提示達到了良好的骨融合效果。實驗中發現單純細胞移植組骨融合率較低，既往報道也顯示，單純使用 BMSCs 以及 ADSCs 與可吸收性膠原海綿結合也未發生融合，而且成骨量幾乎可以忽略不計[14-15]。Lin 等[22]也認為，單純應用干細胞進行骨修復及再生成骨能力有限，除非干細胞預先進行成骨誘導或者與骨誘導因子共同作用。所以我們認為在脊柱融合方面，單純干細胞移植成骨能力有限，需要與生長因子結合才能發揮有效的作用。
綜上述，本研究結果表明，從大鼠脂肪組織中提取 SVFs，不經過體外培養直接與骨誘導因子 rhBMP-2 結合，可有效促進脊柱融合，為臨床應用提供實驗基礎。但本研究也存在以下不足：本實驗直接植入提取的 SVFs，為避免外在因素對 SVFs 的影響，未對 SVFs 進行示蹤標記，影響了對所移植 SVFs 的體內觀察；此外，人來源的 SVFs 可能與大鼠來源的 SVFs 存在差異，在未來研究工作中需要進一步論證，如提取人來源的 SVFs，選用無胸腺大鼠（為避免排斥反應）作為實驗動物進行對比研究等。
脊柱融合是骨科常用手術方式，如何提高融合率一直是研究重點。自體骨移植可提供豐富的生物學環境，包括成骨細胞、MSCs 以及良好的骨傳導作用，被認為是脊柱融合的金標準；但其也存在取骨區頑固性疼痛、出現感染可能、較高假關節形成發生率及骨量來源受限等問題[1-2]。應用骨組織工程學方法是目前研究熱點，有可能解決上述問題，可形成較高的骨質量并縮短骨融合時間[3]。
按照臨床實際需要，如果能從患者自身提取一類細胞，不通過體外擴增、純化，采用“一步法”直接植入體內進行修復，是一種比較理想的方式；同時與一種高效、安全的生長因子結合是一種可能的解決辦法。本研究基于上述設想，將攜帶重組人 BMP-2（recombinant human BMP-2，rhBMP-2）的 β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP）與載體支架脫鈣骨基質（decalcified bone matrix，DBX）復合，再與新鮮提取的基質血管成分細胞（stromal vascular fraction cells，SVFs）混合，提取的細胞不進行體外擴增，進行“一步法”移植于大鼠腰椎后外側，在 rhBMP-2 緩釋作用下促進脊柱融合，是一種組織工程學方法的嘗試，以期為未來臨床應用奠定理論基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
健康 4 月齡 SD 大鼠 42 只，雌雄不限，體質量（200±15）g，由上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院實驗動物中心提供。rhBMP-2、BCA 法蛋白定量試劑盒（Sigma 公司，美國）。DBX 選擇直徑 212～850 μm 的同種異體凍干脫鈣骨基質（上海貝奧路生物材料有限公司）與透明質酸鈉混合而成；β-TCP（上海貝奧路生物材料有限公司）；骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN；Santa Cruz 公司，美國）。倒置顯微鏡（Olympus 公司，日本）；Skyscan1172 micro-CT（SkyScan 公司，比利時）。
1.2 SVFs 提取
取 10 只 SD 大鼠雙側腹股溝區皮下脂肪，將脂肪組織用 PBS 反復沖洗除去血液，剔除血管。無菌操作下將脂肪倒入 50 mL 試管內，4℃ 以 215×g 離心 10 min；轉移上層脂肪組織至新試管內，加入同體積 PBS 混勻，同上法離心 5 min。加入 0.1% Ⅰ 型膠原酶，于震蕩箱內 37℃ 消化 40 min；然后同上法離心 10 min，保留細胞集落。用 PBS 懸浮細胞，200 目濾網過濾，以 150×g 離心 5 min。去除上清液，加入 10 mL 紅細胞裂解液，室溫孵育 10 min；加入 2 倍體積含 5 mmol/L EDTA 的 PBS，200 目濾網過濾，150×g 離心 5 min，保留沉淀，PBS 混勻。用錐蟲藍拒染法檢測細胞活性，計數細胞，備移植實驗用。倒置顯微鏡觀察 SVFs 形態。
1.3 rhBMP-2/β-TCP 緩釋載體構建
1.3.1 仿生磷灰石涂層 β-TCP 的構建 按照文獻[4]方法，經過 2 次過飽和模擬體液（supersaturated simulated body fluid，SBF）浸泡處理方法構建仿生磷灰石涂層 β-TCP。具體方法：① SBF1 配制：CaCl2 0.347 g、MgCl2·6H2O 0.380 g、NaHCO3 0.441 g 及 K2HPO4 0.285 g 加入 250 mL 雙蒸水中進行溶解，調整溶液 pH 值為 6；繼續加入 Na2SO4 0.089 g、KCl 0.280 g 和 NaCl 10.01 g，并調整 pH 值至 6.5。② SBF2 配制：CaCl2 0.347 g 和 K2HPO4·3H2O 0.285 g 加入 250 mL 雙蒸水中進行溶解，調整溶液 pH 值至 6；最后加入 NaCl 10.01 g，并調整 pH 值至 6.8。③ 仿生磷灰石涂層 β-TCP 構建：保持上述 2 種 SBF 溫度為 37℃，移植實驗所用的 β-TCP 放入 SBF1 浸泡 24 h 后，再放入 SBF2 浸泡 24 h，然后用雙蒸水沖洗去除過多金屬陽離子，通過干燥機干燥后得到仿生磷灰石涂層 β-TCP 粉末。
1.3.2 rhBMP-2 體外緩釋效應測定 rhBMP-2/β-TCP 緩釋載體構建：取 10 μg rhBMP-2（200 μg/mL）與 50 mg 仿生磷灰石涂層 β-TCP 粉末（直徑 200～300 mm）混合（實驗組），–180℃ 保存 12 h，然后在真空干燥機內風干，經 17×g 離心使粉末集中。將上述緩釋載體粉末分別加入 6 個 U 型試管中，加入 1 mL PBS 溶液（pH7.4）適度震蕩，每個試管分別于 0、1、4、7、10、14 d 取上清液，每個時間點重復 3 次，按照 BCA 法蛋白定量試劑盒說明書方法，測定 rhBMP-2 蛋白累積釋放量，繪制累積釋放曲線；以未經仿生磷灰石涂層的單純 50 mg β-TCP 顆粒與 10 μg rhBMP-2 混合作為對照組。
1.4 動物實驗分組及方法
1.4.1 移植樣品術前準備 rhBMP-2 經過處理構建為 rhBMP-2/β-TCP 緩釋載體用于以下移植實驗。A 組 PBS+DBX：取 300 mL DBX 與 50 mL PBS 混合。B 組 rhBMP-2+DBX：取 300 mL DBX 與 10 μg rhBMP-2（200 μg/mL）混合。C 組 SVFs+DBX：取 300 mL DBX 與 1×105 個/μL SVFs 混合。D 組 rhBMP-2+SVFs+DBX：取 300 mL DBX 與 10 μg rhBMP-2（200 μg/mL）和 1×105 個/μL SVFs 混合。具體步驟以 D 組為例：經仿生磷灰石涂層處理的含有 10 μg rhBMP-2/β-TCP 與 300 mL DBX 混合，放入無菌 Eppendorf 管中并封口備用；由 2 名術者同時進行手術，根據手術進度，提取的 SVFs 被送入手術室，由助手將 1×105 個/μL SVFs+10 μg rhBMP-2/β-TCP+300 mL DBX 混合為移植使用。所有操作都在細胞培養超凈臺內進行，避免樣品污染。
1.4.2 實驗分組及手術方法 將 32 只 SD 大鼠隨機分為 4 組，每組 8 只。A、B、C、D 組移植物分別為 PBS+DBX、rhBMP-2+DBX、SVFs+DBX 和 rhBMP-2+SVFs+DBX。手術方法：采用氯胺酮（40 mg/kg）聯合地西泮（2 mg/kg）腹腔注射麻醉。麻醉成功后，取腰背側正中入路，雙側髂嵴對應 L6 椎體，手術切口以 L4、5 為中心，長約 4 cm。距棘突兩側約 2 mm 各作一旁正中切口切開筋膜，用神經剝離子沿棘突鈍性分離椎旁肌至關節突關節，顯露雙側 L4 和 L5 橫突并切斷橫突間韌帶，用高速磨鉆打磨橫突皮質至松質骨面點狀滲血，術中防止用力過猛以免發生橫突骨折。無菌生理鹽水沖洗傷口后，于雙側橫突間植入各組移植物。4-0 Vicryl 可吸收縫線逐層關閉切口，術后大鼠自由活動。術后連續 3 d 給予頸部皮下注射止痛藥卡洛芬，2 次/d，每次 0.2 mg；口服復方新諾明抗生素藥水 1 周后改用正常純凈水。
1.4.3 X 線片觀察脊柱融合情況 術后 8 周行 X 線片評估脊柱融合情況，兩側橫突間存在骨性連接為融合，兩側或單側未融合為失敗融合。
1.4.4 手動觸診評價脊柱融合情況 術后 8 周，32 只大鼠采用 CO2 窒息法處死各組動物，取出腰椎標本后，由 3 名有經驗的脊柱外科醫生獨立進行標本屈曲、伸展和側屈活動測試，對抗融合節段是否產生活動，有活動出現及任何一側有活動則認為是失敗融合。
1.4.5 micro-CT評估 手動觸診評價后將各組標本置于 10% 甲醛浸泡 48 h 以上，然后行 micro-CT 掃描獲得高分辨率圖像，掃描分辨率 19.73 mm、電壓 55 kV、電流 181 mA，橫突間存在骨性連接為骨融合。運用 micro-CT 中 CTAn、CTVol 和 Data-Viewer 3 種軟件進行骨形成情況的三維重建和數據分析，根據每側腰椎形成骨塊確定感興趣區域范圍，分析骨密度（bone mineral density，BMD）以及骨體積分數（為感興趣區域內代表骨塊結構體素的總體積與區域內所有體素的總體積之比）。
1.4.6 組織學觀察 取 10% 甲醛浸泡 48 h 后的各組脊柱標本，修剪 L4、5 間的融合骨塊后，用 Cal-Ex 脫鈣處理 1 周左右，經石蠟包埋、切片（片厚 5 μm），行 HE 染色及 Masson 三色染色（礦化組織呈紅色，連接組織呈藍色）觀察骨形成情況。
1.4.7 免疫組織化學染色觀察 取上述部分切片，行 OCN 免疫組織化學染色，鏡下觀察新骨形成情況（陽性染色為棕黃色）。
1.5 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 法；計數資料以率表示，組間比較采用 χ2 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 SVFs 形態觀察
倒置顯微鏡觀察示，新鮮分離的細胞絕大部分形態為小圓形。接種 4 h 開始貼壁，6～18 h 細胞處于生長停滯期，24 h 完全貼壁。24 h 后細胞開始伸展，增殖加速，形態由圓形變為梭形，胞體形成突起。48 h 后細胞伸展明顯，多數呈成纖維細胞樣梭形，部分呈三角形。培養 7 d 細胞達 85% 融合，然后進行傳代培養。見圖 1。
圖1
新鮮分離的 SVFs 形態學觀察（倒置顯微鏡×100）
Figure1.
Morphological observation of the fresh SVFs (Inver- ted microscope×100)
2.2 rhBMP-2 蛋白體外緩釋效應測定
對照組 rhBMP-2 蛋白于 1 d 時累積釋放量已達 87% 左右，為爆發性釋放，之后 2 周內幾乎釋放靜止；而實驗組經仿生磷灰石涂層的 β-TCP 可使 rhBMP-2 緩慢釋放，14 d 時 rhBMP-2 蛋白體外累計釋放量為 40% 左右。見圖 2。
圖2
經仿生磷灰石涂層及未經涂層的 β-TCP 中 rhBMP-2 的累積釋放曲線
Figure2.
Cumulative release curve of rhBMP-2 in coated β- TCP and uncoated β-TCP
2.3 動物實驗相關觀測
2.3.1 X 線片觀察 A 組 L4、5 橫突間缺乏骨性連接；C 組橫突間僅有少量骨性連接；B、D 組橫突間均呈現出融合，D 組融合骨形態更密實、結構更緊湊。見圖 3。A、B、C、D 組融合率分別為 12.5%（1/8）、75.0%（6/8）、37.5（3/8）、100%（8/8），組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。
圖3
術后 8 周各組大鼠 X 線片觀察
a. A 組（箭頭示橫突間存在明顯間隙）；b. B 組；c. C 組（箭頭示橫突間存在間隙）；d. D 組
Figure3. X-ray film observation in each group at 8 weeksa. Group A (Arrow for the obvious gap between the transverse processes); b. Group B; c. Group C (Arrow for the obvious gap between the transverse processes); d. Group D
2.3.2 手動觸診評價 手動觸診評價顯示，A、B、C、D 組融合率分別為 12.5%（1/8）、75.0%（6/8）、37.5（3/8）、100%（8/8），組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。
2.2.3 micro-CT 觀察 A 組無骨橋連接兩側橫突；C 組僅見單側脊柱融合；B、D 組可見骨橋連接形成融合，D 組形成的骨質量優于 B 組。見圖 4。A、B、C、D 組融合率分別為 12.5%（1/8）、75.0%（6/8）、37.5（3/8）、100%（8/8），組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。
圖4
術后 8 周各組大鼠 micro-CT 評估脊柱融合情況
從左至右分別為 A、B、C、D 組 a. 三維重建；b. 冠狀面圖像
Figure4. Spinal fusion observation in each group at 8 weeks by micro-CTFrom left to right for groups A, B, C, and D, respectively a. Three-dimensional reconstruction; b. Coronal plane image
A、B、C、D 組 BMD 分別為（1.37±0.05）、（1.50±0.04）、（1.45±0.09）、（1.61±0.44）g/cm3，骨體積分數分別為 10.58%±2.25%、17.55%±3.23%、13.20%±2.81%、23.07%±5.59%。BMD 及骨體積分數 D 組顯著高于其余 3 組，B 組高于 A、C 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A、C 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
2.3.4 組織學觀察 ① HE 染色：A 組 DBX 間僅為纖維組織連接；B 組 DBX 間有軟骨細胞連接；C 組 DBX 間有血管基質層細胞存在，但因缺乏生長因子刺激，未形成有效骨連接；D 組 DBX 間有大量軟骨細胞連接，且在 DBX 之間有軟骨內骨化形成的“骨橋”形成。見圖 5。② Masson 三色染色：A 組包含大量未礦化的 DBX 顆粒，其邊緣較銳利，之間僅以纖維組織連接；B 組 DBX 顆粒邊緣被侵蝕，新生的肥大軟骨細胞參與骨塑形過程；C 組 DBX 顆粒間以細胞連接為主，為植入的 SVFs；D 組有大量軟骨細胞出現，塑形過程中有類似骨髓空洞形成，伴有骨基質沉積，類似長骨的礦化過程，見圖 6。
圖5
術后 8 周各組 HE 染色觀察（×200）
a. A 組（箭頭示纖維組織連接）；b. B 組（箭頭示肥大軟骨細胞）；c. C 組（箭頭示 SVFs）；d. D 組（箭頭示肥大軟骨細胞）
Figure5. HE staining observation in each group at 8 weeks (×200)a. Group A (Arrow for fiber connection); b. Group B (Arrow for hypertrophic chondrocytes); c. Group C (Arrow for SVFs); d. Group D (Arrow for hypertrophic chondrocytes)
圖6
術后 8 周各組 Masson 三色染色觀察（×200）
箭頭示新骨形成 a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure6. Masson trichrome staining observation in each group at 8 weeks (×200)Arrow for new bone formation a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.3.5 OCN 免疫組織化學染色觀察 B、D 組塑形的 DBX 周圍有大量 OCN 染色陽性表現，D 組表達量更高；A、C 組 OCN 染色強度較低。見圖 7。
圖7
術后 8 周各組 OCN 免疫組織化學染色觀察（×400）
箭頭示 OCN 陽性表達 a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure7. OCN immunohistochemical staining observation in each group at 8 weeks (×400)Arrow for OCN positive expression a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
3 討論
3.1 SVFs 作為種子細胞的優勢
在組織工程研究中，種子細胞是非常重要的一環。目前干細胞研究是主流方向，如 BMSCs 和脂肪來源干細胞（adipose derived stem cells，ADSCs），但對于臨床實際應用仍有一定距離，如 BMSCs 來源受限，且取材對自體損傷較大[5]；ADSCs 可避免上述問題，但提取后需要體外培養、傳代及純化，人為增加了感染風險，限制了其實際應用[6-7]。本實驗采用 SVFs 作為移植細胞，SVFs 是從新鮮脂肪組織提取的混雜細胞群，主要包括 ADSCs、內皮細胞、血管平滑肌細胞/周細胞和其他部分血液來源細胞（粒細胞、單核細胞、淋巴細胞及造血干細胞等）等[8-9]。SVFs 與 ADSCs 比較具有以下優點：① 無需經 2～3 周傳代培養，提取分離操作在數小時內即可完成，并能即時用于臨床治療；② 取材容易，來源充分，并可分泌多種細胞因子；③ 含有大量多向分化潛能的基質干細胞，可向軟骨細胞、骨細胞等多種成體細胞分化，是組織工程學較理想的種子細胞。Varma 等[10]進行了一項對比研究，從人的脂肪組織中分離出 SVFs 和 ADSCs（第 4 代），從細胞表型分析兩者基本近似，主要是 CD34+ CD117+ HLADR+；體外誘導成骨能力方面，基因表達（Runx2）、ALP 活性以及 OCN 形成等方面兩者也基本相同。所以，本實驗選擇 SVFs 作為種子細胞，不需要通過體外純化，可應用“一步法”直接移植進行脊柱融合。
3.2 構建具有緩釋作用的 rhBMP-2
rhBMP-2 是目前被美國食品和藥物管理局（FDA）同意應用于人身上的一類生長因子，具有良好的骨修復和骨再生效果；但因其是水溶性蛋白并且半衰期較短，在體內降解較快，為獲得良好的融合效果，臨床上常使用超生理劑量，這種大劑量使用出現了一些不良反應，如局部炎性反應、異位骨化、軟組織水腫以及激發破骨細胞活躍等[11-13]，影響治療效果。如何使 rhBMP-2 在體內緩慢釋放，維持植入部位較高藥物濃度，提高骨融合率的同時避免并發癥的發生，是目前研究熱點。
為使生長因子或蛋白達到持續作用或緩釋效果，有采用干細胞轉染生長因子基因的方法，如 Wang 等[14]通過腺病毒攜帶的 rhBMP-2 轉染 BMSCs，Hsu 等[15]通過腺病毒攜帶的 rhBMP-2 轉染 ADSCs，雖然都取得了不錯的結果，但很難在臨床實際中應用，主要問題是體外需要較長時間構建，此外還有病毒載體的問題[16]。除了基因轉染的方法，還可使生長因子包裹或吸附至釋放載體或支架上[17-18]，從而阻止多肽鏈解離。為了使 rhBMP-2 達到局部緩慢釋放的作用，本實驗選用 β-TCP 作為載體，通過仿生磷灰石方法使 rhBMP-2 涂層至 β-TCP 顆粒上[4, 19]，然后應用凍干法使 rhBMP-2 結合到 β-TCP 上。體外實驗結果表明該方法可使 rhBMP-2 持續釋放，14 d 達 40% 左右釋放，而單純 rhBMP-2 結合 β-TCP 幾乎在 1～2 d 時間內達到完全釋放，觀察的 2 周內近乎零釋放。因此該方法使 rhBMP-2 達到了緩釋作用于 SVFs 獲得骨再生的效果。
3.3 rhBMP-2 緩釋作用 SVFs 在脊柱融合中的優勢
骨組織形成有兩種方式，即膜內成骨和軟骨內成骨[20]。前者的新生骨組織在結締組織膜中由間充質細胞直接形成，后者是指結締組織內的間充質細胞首先分化為軟骨組織，然后在軟骨組織的基礎上進行鈣化成骨。從本實驗結果看，主要以軟骨內成骨方式形成新骨，植入 SVFs 與 rhBMP-2，rhBMP-2 除了直接作用于移植的 SVFs，也可使體內 BMSCs 向成骨轉化，提高了成骨效率，從成骨質量上 D 組優于 B 組。
對脊柱融合效果進行分析時，我們選取橫突之間作為檢測范圍，與 Boden 等[21]報道相一致，他們認為脊柱融合的外圍部分即鄰近橫突處，最易形成骨性連接，而在融合范圍的中央部分最易形成假關節，因為橫突細小，對移植物的中央部位血液供應少，需要血管再化生。本實驗通過 micro-CT 和組織學檢測提示達到了良好的骨融合效果。實驗中發現單純細胞移植組骨融合率較低，既往報道也顯示，單純使用 BMSCs 以及 ADSCs 與可吸收性膠原海綿結合也未發生融合，而且成骨量幾乎可以忽略不計[14-15]。Lin 等[22]也認為，單純應用干細胞進行骨修復及再生成骨能力有限，除非干細胞預先進行成骨誘導或者與骨誘導因子共同作用。所以我們認為在脊柱融合方面，單純干細胞移植成骨能力有限，需要與生長因子結合才能發揮有效的作用。
綜上述，本研究結果表明，從大鼠脂肪組織中提取 SVFs，不經過體外培養直接與骨誘導因子 rhBMP-2 結合，可有效促進脊柱融合，為臨床應用提供實驗基礎。但本研究也存在以下不足：本實驗直接植入提取的 SVFs，為避免外在因素對 SVFs 的影響，未對 SVFs 進行示蹤標記，影響了對所移植 SVFs 的體內觀察；此外，人來源的 SVFs 可能與大鼠來源的 SVFs 存在差異，在未來研究工作中需要進一步論證，如提取人來源的 SVFs，選用無胸腺大鼠（為避免排斥反應）作為實驗動物進行對比研究等。
