引用本文： 龍海燕, 楊剛, 馬坤龍, 肖正華, 任小梅. 不同電刺激波形對脂肪間充質干細胞定向排列的影響. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(7): 853-861. doi: 10.7507/1002-1892.201702027 復制
細胞排列在細胞骨架重組、膜蛋白重定位、細胞核基因表達和細胞外基質重塑等多種細胞行為中起著關鍵性作用，并且對組織的修復和再生具有重要影響[1]。細胞有序排列的重要性在臨床上已得到證實，例如因肥厚性心肌病引起的心肌紊亂，在臨床上首先表現為心肌細胞定位失調，進而失去有序排列狀態[2]；而且伴隨著心肌紊亂，心肌細胞之間原本有規律的縫隙連接結構（閏盤結構）也出現紊亂，最終導致心律失常[3]。
在體外細胞培養中，誘導細胞產生有序排列可采用力學拉伸、培養表面雕刻條紋、表面化學修飾以及電刺激等方法[1]，其中電刺激方式由于其電氣參數設定相對方便而受到較大關注。迄今為止，在細胞定向排列方面對于直流電場的研究較多，而對其他電刺激波形，例如方波和雙相脈沖波的研究較少（圖 1）。脂肪間充質干細胞（adi-pose derived mesenchymal stem cells，ADSCs）是從脂肪組織中分離獲得的一種具有向脂肪、軟骨、成骨、成肌、心肌細胞等多向分化潛能的干細胞[4-6]。本文研究 ADSCs 對于不同電刺激波形（包括直流、方波和雙相脈沖波）的細胞響應，采用倒置顯微鏡定時拍照法記錄細胞電刺激響應過程，并計算細胞排列的平均對齊指數（orientation factor，OF）；羅丹明-鬼筆環肽熒光染色分析電刺激后細胞的骨架排列；活死染色法分析細胞存活率；鈣離子熒光染色試劑標識電場刺激過程中的細胞內鈣離子分布，分析細胞鈣離子活動功能。通過上述研究以期提高對不同電刺激波形在細胞定向排列中作用的認識，為組織工程和再生醫學的研究提供新的實驗依據。
1 材料與方法
1.1 電刺激裝置
細胞電刺激裝置采用自制電場生物反應器[7-8]。該反應器采用有機玻璃材料制作，包含細胞培養室和密封蓋，培養室兩端直接與培養液池相連。該反應器有 2 個鹽溶液池，用來注入 Steinberg 緩沖液，在鹽池中插入石墨電極并與外部直流電源相連。細胞培養室與 2 個鹽溶液池之間通過溝槽型瓊脂鹽橋相連，這種特殊設計的瓊脂鹽橋可有效防止鹽溶液池中電解產物向細胞培養室擴散，避免電解產物對細胞造成影響。反應器蓋板用于防止培養液和 Steinberg 緩沖液蒸發；反應器蓋板預留測試探針通孔，可插入數字萬用表探針實時監測細胞培養室兩端的電勢差，以確定細胞培養室的電場強度。細胞電刺激所使用的直流電場由一臺輸出電壓可調的電泳儀電源（DYB-1；上海博通化學科技有限公司）提供，實測細胞培養室電場強度調節范圍為 0～10 V/cm。方波和雙相脈沖波均由自行設計的脈沖發生器產生，輸出頻率可調（1～10 Hz），電壓幅值可調（0～10 V），脈寬可調（1～5 ms）。
1.2 實驗動物及主要試劑、儀器
5 周齡清潔級 SD 大鼠 2 只，雌雄不限，體質量分別為 100 g 和 150 g，由四川大學實驗動物中心提供。Ⅰ型膠原酶、DAPI、鈣黃綠素-AM、碘化丙啶、Hoechst33342（Sigma 公司，美國）；FBS（Invitrogen 公司，美國）；H-DMEM（HyClone 公司，美國）；25 cm2 培養瓶、100 mm 細胞培養皿（Corning 公司，美國）；羅丹明-鬼筆環肽（Cytoskeleton 公司，美國）；抗熒光淬滅封片劑（碧云天生物技術研究所）；鈣離子熒光試劑 Fluo-3/AM（AAT Bioquest 公司，美國）。CKX41 倒置顯微鏡、BX60 熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）；IBE2000 倒置顯微鏡（重慶光學儀器廠）；MD50 顯微鏡攝像頭（廣州明美光電技術有限公司）；XDS-30 倒置熒光顯微鏡（浙江舜宇光學有限公司）；Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件（Media Cybernetics 公司，美國）。
1.3 ADSCs 分離培養及鑒定
參照文獻[9-11]方法分離培養 ADSCs：取 SD 大鼠皮下脂肪組織，剪碎成 1 cm3 大小的顆粒；加入 0.1%Ⅰ型膠原酶，37℃ 振蕩消化 45 min；加入 2 倍體積的基礎培養液（含 10%FBS 的 H-DMEM 培養基）中和消化液，收集細胞懸液，283×g 離心 8 min；棄上清獲得細胞沉淀物，加入適量基礎培養液重懸細胞，同上法離心 1 次；棄上清，加入完全培養液（含 15%FBS、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 鏈霉素的 H-DMEM 培養基）重懸細胞；經 200 目細胞濾網過濾后接種至 25 cm2 培養瓶，于 37℃、5% CO2、飽和濕度培養箱培養，隔天換液；當細胞鋪滿接近融合狀態時，用含 0.02%EDTA 的 0.25% 胰蛋白酶消化、傳代，此后每隔 5～6 d 進行傳代培養，取第 3～5 代細胞用于以下研究。參照文獻[9]方法采用流式細胞儀鑒定分離培養的細胞為 ADSCs。
1.4 實驗分組及方法
根據不同電刺激波形將實驗分為 4 組，A 組采用直流電刺激，B 組采用方波電刺激，C 組采用雙相脈沖波電刺激，D 組無電刺激作為對照組。具體方法如下：
A 組：預先準備 10 mm×20 mm 血蓋片，經過強酸和強堿浸泡、清洗、高壓滅菌、烘干后放入超凈臺。取適量血蓋片置于 100 mm 細胞培養皿，加入 0.1% 明膠包被溶液（溶于 0.01 mol/L PBS，過濾除菌）浸泡血蓋片，于 37℃、5%CO2、飽和濕度細胞培養箱中靜置 30 min；棄包被液，PBS 清洗 3 次，晾干備用。用 0.25% 胰蛋白酶消化 ADSCs，將 200 μL 濃度為 1×104 個/mL 的細胞懸液接種于血蓋片，制成細胞爬片，置于 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養 4 h；待細胞完全貼壁后補充細胞培養液，繼續培養 24 h。將細胞爬片放入電場生物反應器，蓋好細胞培養室密封塞，在培養基儲液池中加注電刺激細胞培養液{[在完全培養液中添加 25 mmol/L 羥乙基哌嗪乙磺酸[（N-（2-Hydroxyethyl）piperazine-N'-（2-ethanesulfonic acid），HEPES]}。在兩個鹽溶液池中注入 Steinberg 緩沖液，插入碳棒電極，連接電源。將反應器置于倒置顯微鏡操作平臺上，選擇觀察視野；開啟電泳儀電源，調節輸出電壓使得細胞培養室電場強度達到預設參數。開啟顯微鏡攝像頭進行定時拍照記錄，拍照間隔為 1 min。分別給予 1、2、3、4、5、6 V/cm 電場強度刺激（分別設為 A1、A2、A3、A4、A5、A6 組），每組刺激時間為 6 h。各個測試條件至少完成 3 個重復樣本的實驗。
B 組：除了電刺激波形為方波外，其余細胞爬片的準備和實驗方法同 A 組。設置 2 個亞組，電刺激條件分別為電場強度 6 V/cm、占空比 50%、1 Hz（B1 組）和電場強度 6 V/cm、占空比 50%、2 Hz（B2 組），每組刺激時間為 6 h。
C 組：除了電刺激波形為雙相脈沖波外，其余細胞爬片的準備和實驗方法同 A 組。設置 2 個亞組，電刺激條件分別為電場強度 6 V/cm、2 ms、1 Hz（C1 組）和電場強度 6 V/cm、2 ms、2 Hz（C2 組），每組刺激時間為 6 h。
D 組：同上法將細胞爬片放入電場生物反應器中，但不施加電刺激。
1.5 觀測指標
1.5.1 細胞形態變化觀察 采用倒置顯微鏡觀察各組各時間點細胞形態變化。
1.5.2 細胞排列的 檢測 細胞排列的對齊程度采用 進行評估，參照文獻[12]方法并作適當修改。將倒置顯微鏡采集到的細胞圖像導入 Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件，每幅圖像隨機選擇 30～50 個細胞進行分析。分別標示出每個待測細胞的長軸與電場矢量的夾角，然后用以下公式進行計算： 。其中 為平均 ， 為第 i 個細胞的 ，i 取值范圍為 1～n；θ 為細胞長軸與電場矢量方向的夾角，θi 的取值范圍為 –90～90°，因此 的取值范圍為 –1～1（圖 2）。例如：若細胞與電場矢量方向平行，θi=0°，則 =cos（2×0°）=1；若細胞與電場矢量方向垂直，θi=90° 或 θi=–90°，則 OFi= cos（±2×90°）=–1。依次將所有細胞的 計算出來并取平均值，得到全部細胞的 。
1.5.3 細胞骨架染色分析 電刺激結束后取出各組細胞爬片，選擇一部分樣本（A4、A5、A6 組和 D 組）采用細胞肌動蛋白絲染色法檢測細胞形態學變化。將細胞爬片用 4% 多聚甲醛固定 10 min，PBS 漂洗 3 次，0.01%Triton X-100 對細胞膜打孔 10 min；PBS 漂洗 3 次，加入 100 nmol/L 羅丹明-鬼筆環肽，室溫避光孵育 30 min；PBS 漂洗 3 次，加入 1 μg/mL DAPI 復染細胞核；棄多余水分，用抗熒光淬滅封片劑封片，然后置于連接 MD50 顯微鏡攝像頭的熒光顯微鏡平臺，觀察羅丹明-鬼筆環肽標記的細胞肌動蛋白絲的分布狀況。
1.5.4 細胞活死染色檢測 取各組剩余細胞爬片置于新的 6 孔培養板中，每孔放置 1 片并加入 2 mL 完全培養液繼續培養 2 h。取出爬片，PBS 漂洗 3 次，加入細胞活死染色液（每毫升 PBS 中加入 4 μmol/L 鈣黃綠素-AM、4 μmol/L 碘化丙啶、1 μg/mL Hoechst33342），37℃、5%CO2、飽和濕度細胞培養箱中孵育 30 min。棄染色液，PBS 漂洗 3 次后放置在連接 MD50 顯微鏡攝像頭的倒置熒光顯微鏡平臺觀察，活細胞被染成綠色，死細胞被染成紅色。每個樣本隨機選取 5 個視野，分別統計活細胞數和死細胞數，按以下公式計算細胞存活率：[活細胞數/（活細胞數+死細胞數）]×100%。
1.5.5 電刺激作用下細胞的鈣離子活動檢測 為探索細胞在電場刺激下定向排列的內在機制，采用鈣離子熒光染色法[13]對 ADSCs 內的鈣離子活動進行染色分析。具體方法：按 1.4 描述的方法制備細胞爬片（未經電場刺激），加入含 10 μmol/L 鈣離子熒光試劑 Fluo-3/AM 的 Tyrode 溶液（136 mmol/L NaCl、5.4 mmol/L KCl、0.33 mmol/L NaH2PO4、1.0 mmol/L MgCl2、10 mmol/L HEPES、10 mmol/L Glucose、1.8 mmol/L CaCl2，pH=7.4），在 37℃、5% CO2、飽和濕度細胞培養室孵化 20 min。然后用無染色劑的 Tyrode 溶液漂洗 2 遍，將分組后的細胞爬片放入生物反應器，接通電刺激電源，給予相應電刺激，倒置熒光顯微鏡下觀察。
1.6 統計學方法
采用 SPSS14.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 不同波形電刺激作用下細胞的定向排列
2.1.1 倒置顯微鏡觀察 A 組：ADSCs 對直流電刺激的響應與電場強度相關，電場強度越高，形成垂直排列的細胞越多。A1～A4 組僅有少量細胞響應電場刺激而垂直于電場排列；A5 組許多細胞在 2 h 已呈現出垂直于電場排列的趨勢，6 h 后絕大部分細胞垂直于電場的定向排列。提示在相同的直流電場刺激時間內，ADSCs 對電場刺激的響應存在閾值現象，此閾值可能在 4～5 V/cm 間。A6 組絕大多數細胞響應電場刺激，4 h 時基本上垂直于電場排列。在響應電場刺激的過程中，可觀察到 ADSCs 通過細胞偽足的橫向收縮和縱向延長來實現；一些原本呈現多邊形的細胞在電場力作用下，逐漸形成垂直于電場的紡錘形細胞形態。另外，在電場刺激過程中，一些細胞保持正常的細胞分裂活動（如 A6 組中的一些折光性強的小圓形細胞）；說明 6 V/cm 直流電場強度是處于生理強度范圍內的。有個別細胞不受電場的影響，保持其原來的細胞排列方向，推測可能與 ADSCs 中包含其他類型混雜細胞有關。見圖 3。
各時間點 B1、B2 組，C1、C2 組及 D 組均未發現明顯的細胞定向排列現象。另外，在雙相脈沖作用下，細胞仍保持正常的細胞分裂和增殖，說明雙相脈沖電場強度處于生理強度范圍內。見圖 4。
2.1.2 D 組 為 –0.01±0.07。A1～A6 組分別為 0.02±0.14、–0.12±0.03、–0.18±0.09、–0.23±0.10、–0.71±0.08、–0.84±0.03，B1、B2 組分別為 0.06±0.19 和 –0.04±0.17，C1、C2 組分別為 –0.07±0.09 和 –0.07±0.18。除 A5、A6 組 顯著高于 D 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）外，其余各組 與 D 組比較差異均無統計學意義（P>0.05）；A5、A6 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
2.2 細胞骨架染色分析
電刺激 6 h 后，A5、A6 組絕大部分細胞的肌動蛋白絲垂直于電場強度方向排列，并形成平行排列的條束狀結構；一些原先呈圓形的細胞核在電場力作用下變為橢圓狀，也傾向于垂直電場矢量方向。A1～4 組，B1、B2 組，C1、C2 組和 D 組細胞的肌動蛋白絲處于隨機分布狀態，單個細胞占有培養表面的面積較大。見圖 5。
2.3 細胞活死染色檢測
細胞活死染色檢測示，各組絕大多數細胞為活細胞，死亡細胞很少。D 組細胞呈隨機排列；A4 組有一些定向排列趨勢，而 A5、A6 組大多數細胞垂直于電場方向排列。見圖 6。
D 組細胞存活率為 95.73%±1.99%；A1～A6 組分別為 96.50%±1.15%、95.07%±2.01%、91.73%±1.56%、87.50%±1.21%、85.10%±2.10%、80.73%±2.46%；B1、B2 組分別為 93.47%±3.20%、92.47%±4.54%；C1、C2 組分別為 92.33%±2.06%、92.00%±3.20%。除 A4、A5、A6 組細胞存活率顯著低于D組，比較差異有統計學意義（P<0.05）外，其余各組細胞存活率與 D 組比較差異均無統計學意義（P>0.05）；A4、A5 組細胞存活率顯著高于 A6 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）。
2.4 電刺激作用下細胞的鈣離子活動檢測
A4、A5、A6 組細胞內的鈣離子熒光強度稍高于 D 組，其余各組細胞內的鈣離子熒光強度與 D 組比較無顯著差別。見圖 7。另外，在開通和關斷 A6 組電刺激的瞬間，觀察到部分細胞出現了鈣離子振蕩波，這些振蕩波持續時間為 1～3 s，說明 6 V/cm 直流電刺激開關狀態能夠誘發細胞的鈣離子振蕩波；但持續給予直流電刺激并未出現更多鈣離子振蕩波，表明 ADSCs 尚未分化成具有電傳導功能的細胞（如心肌細胞或神經細胞）。
圖1
電刺激波形示意圖
a. 直流電；b. 方波；c. 雙相脈沖波
Figure1. Illustrations of electrical stimulation wave formsa. Direct current; b. Square wave; c. Biphasic pulse wave
圖2
細胞 OF 示意圖
表示電場矢量 a. 當 θ
The represents the electric field vector a. When θ
圖3
倒置顯微鏡觀察 A 組各時間點細胞形態變化（白箭頭示電場方向）
從左至右依次為 0、2、4、6 h a. A1 組（×10）；b. A2 組（×10）；c. A3 組（×25）；d. A4 組（×10）；e. A5 組（×10）；f. A6 組（×10）
Figure3. The morphological changes of cells in group A by inverted microscope at each time point (White arrow indicated the direction of electrical field)From left to right for the images at 0, 2, 4, and 6 hours, respectively a. Group A1 (×10); b. Group A2 (×10); c. Group A3 (×25); d. Group A4 (×10); e. Group A5 (×10); f. GroupA6 (×10)
圖4
倒置顯微鏡觀察 B1、C1、D 組各時間點細胞形態變化（白箭頭示電場方向）
從左至右依次為 0、2、4、6 h a. B1 組（×10）；b. C1 組（×10）；c. D 組（×10）
Figure4. The morphological changes of cells in groups B1, C1, and D by inverted microscope at each time point (White arrow indicated the direction of electrical field)From left to right for the images at 0, 2, 4, and 6 hours, respectively a. Group B1 (×10); b. Group C1 (×10); c. Group D (×10)
圖5
電刺激 6 h 后各組細胞骨架染色分析（熒光顯微鏡×20）
紅色示羅丹明-鬼筆環肽標記的細胞肌動蛋白絲，藍色示 DAPI 標記的細胞核 a. A4 組；b. A5 組；c. A6 組；d. D 組
Figure5. Fluorescence staining of cytoskeleton in each group after 6 hours electrical stimulation (Fluorescence microscope×20)Cellular actin filaments were stained with rhodamin-phalloidin (red), nuclei were stained with DAPI (blue) a. Group A4; b. Group A5; c. Group A6; d. Group D
圖6
電刺激 6 h 后各組細胞活死染色檢測（熒光顯微鏡×20）
綠色示鈣黃綠素-AM 標記活細胞的細胞質，紅色示碘化丙啶標記死細胞的細胞核，藍色示 Hoechst33342 標記所有細胞的細胞核 a. A4 組；b. A5 組；c. A6 組；d. D 組
Figure6. Live/dead cell assay in each group after 6 hours electrical stimulation (Fluorescence microscope×20)Cytoplasm of live cells were stained with calcein-AM (green), nuclei of dead cells were stained with propidium iodide (red), and the nuclei of all cells were stained with Hoechst33342 (blue) a. Group A4; b. Group A5; c. Group A6; d. Group D
圖7
電刺激 6 h 后各組細胞鈣離子熒光強度檢測（熒光顯微鏡×20）
a. A4 組；b. A5 組；c. A6 組；d. D 組
Figure7. The fluorescence intensity of calcium ion in each group after 6 hours electrical stimulation (Fluorescence microscope×20)a. Group A4; b. Group A5; c. Group A6; d. Group D
3 討論
細胞有序排列在細胞骨架重組、基因表達和細胞外基質重塑等細胞行為中起關鍵作用，并影響組織的修復和再生。采用電場刺激是一種調控細胞有序排列的便捷手段。既往文獻表明直流電場可促進細胞形態伸長并垂直于電場矢量方向排列[14]。細胞由無序到有序排列的響應時間取決于所施加的電場強度。例如，給予內皮祖細胞直流電場連續作用 4 h，其有序排列程度與電場強度（1～4 V/cm）成正比，電場強度越高，細胞有序排列程度越高[15]。電刺激還會影響細胞和組織的生物學功能，例如心肌細胞在電刺激作用下產生同步收縮，并逐漸形成有序排列的結構，從而降低興奮閾值電壓和增加收縮幅度[16]。在分子水平上，電刺激還會增強心肌細胞的基因表達水平，增加縫隙連接蛋白 43、心肌肌鈣蛋Ⅰ、肌球蛋白重鏈和橫紋肌 α 肌動蛋白的表達，并顯著增強組織工程心肌片的電脈沖傳播[17]。
在細胞定向排列研究方面，目前對于直流電場的研究文獻較多，而對其他電刺激波形的研究較少。雖然方波和雙相脈沖波已廣泛應用于臨床實踐，但它們對細胞定向排列的影響目前所知甚少。方波本質是以一種周期性間斷的直流電場，描述方波的電氣參數一般用電壓幅度、頻率和占空比表示，標準方波是占空比為 50% 的矩形波，占空比<50% 的方波被稱為矩形脈沖波或單相脈沖波，常用脈寬來標識其波形參數，脈寬與占空比和頻率相關。雙相脈沖波是指同時具有正負脈沖的波形，在電生理研究和臨床上最常見的雙相脈沖波是電荷平衡雙相脈沖波。單個波形周期內正負脈沖相伴出現，以避免連續的單相脈沖波（正脈沖或負脈沖）造成刺激電極直流極化，進而產生電化學副作用。無論是方波還是雙相脈沖波，在基礎醫學和臨床醫學中的應用都比較廣泛。例如，方波可用于透皮給藥，通過皮膚電穿孔促進藥物滲透至皮下，實現無創或微創治療[18]；雙相脈沖波常用于心臟起搏、除顫[19-20]；雙相脈沖波（2.5 V/cm、1 Hz、1 ms）能引起心肌成纖維細胞形態伸長，促進細胞增殖[21]。與單相方波相比，雙相脈沖波能夠更有效地促進心肌祖細胞向心肌細胞分化[22]，并促進 ADSCs 分化為心肌細胞樣細胞[9]。ADSCs 是從脂肪組織中分離獲得的一種具有多向分化潛能的干細胞，其具有取材容易的特點，只需少量組織即可獲得大量干細胞，適宜大規模培養，是一種比 BMSCs 更理想的成體干細胞[23]。還有研究發現 ADSCs 能夠在體外連續傳代 20 次以上，且穩定保持其干細胞轉錄因子特征[24]。
本研究觀察了 ADSCs 在各種直流、方波和雙相脈沖波作用下的細胞響應，結果顯示在 5 V/cm 和 6 V/cm 直流電場作用下，ADSCs 響應電刺激垂直于電場矢量方向排列；直流電場強度低于 5 V/cm 時，以及方波（6 V/cm、1 Hz 和 6 V/cm、2 Hz）和雙相脈沖波（6 V/cm、2 ms、1 Hz 和 6 V/cm、2 ms、2 Hz）均未能引起細胞的定向排列。從細胞的 分布來看，6 V/cm 直流電場作用下細胞具有最高的 ，5 V/cm 電刺激組次之，說明細胞的定向排列與電場強度密切相關。在 6 h 的電刺激時間段內，未觀測到方波和雙相脈沖波對細胞定向排列的影響，推測可能是因細胞受到的電刺激強度不夠所致。雖然方波和雙相脈沖波都具有 6 V/cm 的電場強度，但方波只有 50% 的占空比，在相同刺激電壓下，方波電刺激組中細胞受到的平均電流僅有直流電場刺激的一半，因此較低的電流刺激不足以引起細胞的定向排列。雙相脈沖波刺激組中的脈寬為 2 ms，當頻率為 1 Hz 時占空比為 0.2%，當頻率為 2 Hz 時占空比為 0.4%，顯然施加到細胞中的平均電流比方波更弱，因此也未能引起細胞的定向排列。但這并不排除方波和雙相脈沖波誘導細胞定向排列的可能性。在細胞響應電刺激過程中，還有一個重要因素應引起注意，即細胞膜的靜息電位變化。實際上，雙相脈沖波之所以能夠用于心臟起搏或心肌除顫，就是因為脈沖信號引起細胞膜靜息電位的改變，細胞膜去極化引起了細胞的電傳導，從而調控細胞的力電行為。要進一步了解脈沖波對細胞定向排列的影響，需要對電刺激參數進行更多摸索。另外，延長刺激時間也是一個重要選項，而這一點恰恰是應用直流電場刺激的限制條件，長時間的直流電場刺激會造成刺激電極極化，引起細胞培養液的電解，產生電化學副作用，造成細胞凋亡。雙相脈沖波是一種正負電荷平衡的波形，能夠有效抑制電化學副作用，因此可對細胞施加更長時間的電刺激。
直流電場 6 V/cm 屬于生理電場強度范圍，已有研究表明，受損的角膜上皮組織能夠產生相當于 5 V/cm 的內源性直流電場，進而動員周邊細胞遷徙至傷口處來促進傷口愈合[14, 25-26]。本研究的細胞骨架染色結果可見，定向排列的細胞形成比較緊密的細胞骨架結構，這有助于組織的修復和連接。若進一步提高直流電場強度，細胞定向排列的 可能會提高，但相應的電化學副作用也會增大。由于細胞培養液發生電解反應，pH 值變化，加上電流增大后產生的焦耳熱，導致細胞凋亡率上升。本研究結果也可觀察到，細胞存活率與所施加的直流電場強度成負相關，電場強度越高，存活率越低。但各實驗組的細胞存活率均>80%，表明在實驗中所采用的電刺激波形尚屬生理電場強度范圍以內。
細胞之所以能夠形成垂直于電場矢量方向的定向排列，可能與細胞內的鈣離子活動相關。本研究中鈣離子熒光染色結果顯示，5 V/cm 和 6 V/cm 電場刺激后細胞鈣離子活動增強，據此推測，細胞質內帶二價正電荷的游離鈣離子，在直流電場作用下向電場矢量的負極聚集，細胞內帶負電荷的氯離子向電場矢量的正極遷徙，形成細胞內正負離子的極化分布，導致細胞骨架的重新排列。同時細胞通過鈣離子通道對細胞內外鈣離子的流動進行調控，逐漸達到新的動態平衡，并使細胞偽足垂直于電場矢量方向排列。
綜上述，在 3 種電刺激波形中，直流電場刺激促進 ADSCs 的形態學變化，在 5 V/cm 和 6 V/cm 電場強度作用下可使其垂直于電場矢量方向定向排列，并保持良好的細胞存活率；實驗方案中的方波與雙相脈沖電場可保持 ADSCs 具有良好的細胞存活率，但不能引起細胞的定向排列。這些實驗研究有助于提高我們對不同電刺激波形在細胞定向排列中作用的認識，也為組織工程和再生醫學的研究提供了新的實驗依據。
細胞排列在細胞骨架重組、膜蛋白重定位、細胞核基因表達和細胞外基質重塑等多種細胞行為中起著關鍵性作用，并且對組織的修復和再生具有重要影響[1]。細胞有序排列的重要性在臨床上已得到證實，例如因肥厚性心肌病引起的心肌紊亂，在臨床上首先表現為心肌細胞定位失調，進而失去有序排列狀態[2]；而且伴隨著心肌紊亂，心肌細胞之間原本有規律的縫隙連接結構（閏盤結構）也出現紊亂，最終導致心律失常[3]。
在體外細胞培養中，誘導細胞產生有序排列可采用力學拉伸、培養表面雕刻條紋、表面化學修飾以及電刺激等方法[1]，其中電刺激方式由于其電氣參數設定相對方便而受到較大關注。迄今為止，在細胞定向排列方面對于直流電場的研究較多，而對其他電刺激波形，例如方波和雙相脈沖波的研究較少（圖 1）。脂肪間充質干細胞（adi-pose derived mesenchymal stem cells，ADSCs）是從脂肪組織中分離獲得的一種具有向脂肪、軟骨、成骨、成肌、心肌細胞等多向分化潛能的干細胞[4-6]。本文研究 ADSCs 對于不同電刺激波形（包括直流、方波和雙相脈沖波）的細胞響應，采用倒置顯微鏡定時拍照法記錄細胞電刺激響應過程，并計算細胞排列的平均對齊指數（orientation factor，OF）；羅丹明-鬼筆環肽熒光染色分析電刺激后細胞的骨架排列；活死染色法分析細胞存活率；鈣離子熒光染色試劑標識電場刺激過程中的細胞內鈣離子分布，分析細胞鈣離子活動功能。通過上述研究以期提高對不同電刺激波形在細胞定向排列中作用的認識，為組織工程和再生醫學的研究提供新的實驗依據。
1 材料與方法
1.1 電刺激裝置
細胞電刺激裝置采用自制電場生物反應器[7-8]。該反應器采用有機玻璃材料制作，包含細胞培養室和密封蓋，培養室兩端直接與培養液池相連。該反應器有 2 個鹽溶液池，用來注入 Steinberg 緩沖液，在鹽池中插入石墨電極并與外部直流電源相連。細胞培養室與 2 個鹽溶液池之間通過溝槽型瓊脂鹽橋相連，這種特殊設計的瓊脂鹽橋可有效防止鹽溶液池中電解產物向細胞培養室擴散，避免電解產物對細胞造成影響。反應器蓋板用于防止培養液和 Steinberg 緩沖液蒸發；反應器蓋板預留測試探針通孔，可插入數字萬用表探針實時監測細胞培養室兩端的電勢差，以確定細胞培養室的電場強度。細胞電刺激所使用的直流電場由一臺輸出電壓可調的電泳儀電源（DYB-1；上海博通化學科技有限公司）提供，實測細胞培養室電場強度調節范圍為 0～10 V/cm。方波和雙相脈沖波均由自行設計的脈沖發生器產生，輸出頻率可調（1～10 Hz），電壓幅值可調（0～10 V），脈寬可調（1～5 ms）。
1.2 實驗動物及主要試劑、儀器
5 周齡清潔級 SD 大鼠 2 只，雌雄不限，體質量分別為 100 g 和 150 g，由四川大學實驗動物中心提供。Ⅰ型膠原酶、DAPI、鈣黃綠素-AM、碘化丙啶、Hoechst33342（Sigma 公司，美國）；FBS（Invitrogen 公司，美國）；H-DMEM（HyClone 公司，美國）；25 cm2 培養瓶、100 mm 細胞培養皿（Corning 公司，美國）；羅丹明-鬼筆環肽（Cytoskeleton 公司，美國）；抗熒光淬滅封片劑（碧云天生物技術研究所）；鈣離子熒光試劑 Fluo-3/AM（AAT Bioquest 公司，美國）。CKX41 倒置顯微鏡、BX60 熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）；IBE2000 倒置顯微鏡（重慶光學儀器廠）；MD50 顯微鏡攝像頭（廣州明美光電技術有限公司）；XDS-30 倒置熒光顯微鏡（浙江舜宇光學有限公司）；Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件（Media Cybernetics 公司，美國）。
1.3 ADSCs 分離培養及鑒定
參照文獻[9-11]方法分離培養 ADSCs：取 SD 大鼠皮下脂肪組織，剪碎成 1 cm3 大小的顆粒；加入 0.1%Ⅰ型膠原酶，37℃ 振蕩消化 45 min；加入 2 倍體積的基礎培養液（含 10%FBS 的 H-DMEM 培養基）中和消化液，收集細胞懸液，283×g 離心 8 min；棄上清獲得細胞沉淀物，加入適量基礎培養液重懸細胞，同上法離心 1 次；棄上清，加入完全培養液（含 15%FBS、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 鏈霉素的 H-DMEM 培養基）重懸細胞；經 200 目細胞濾網過濾后接種至 25 cm2 培養瓶，于 37℃、5% CO2、飽和濕度培養箱培養，隔天換液；當細胞鋪滿接近融合狀態時，用含 0.02%EDTA 的 0.25% 胰蛋白酶消化、傳代，此后每隔 5～6 d 進行傳代培養，取第 3～5 代細胞用于以下研究。參照文獻[9]方法采用流式細胞儀鑒定分離培養的細胞為 ADSCs。
1.4 實驗分組及方法
根據不同電刺激波形將實驗分為 4 組，A 組采用直流電刺激，B 組采用方波電刺激，C 組采用雙相脈沖波電刺激，D 組無電刺激作為對照組。具體方法如下：
A 組：預先準備 10 mm×20 mm 血蓋片，經過強酸和強堿浸泡、清洗、高壓滅菌、烘干后放入超凈臺。取適量血蓋片置于 100 mm 細胞培養皿，加入 0.1% 明膠包被溶液（溶于 0.01 mol/L PBS，過濾除菌）浸泡血蓋片，于 37℃、5%CO2、飽和濕度細胞培養箱中靜置 30 min；棄包被液，PBS 清洗 3 次，晾干備用。用 0.25% 胰蛋白酶消化 ADSCs，將 200 μL 濃度為 1×104 個/mL 的細胞懸液接種于血蓋片，制成細胞爬片，置于 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養 4 h；待細胞完全貼壁后補充細胞培養液，繼續培養 24 h。將細胞爬片放入電場生物反應器，蓋好細胞培養室密封塞，在培養基儲液池中加注電刺激細胞培養液{[在完全培養液中添加 25 mmol/L 羥乙基哌嗪乙磺酸[（N-（2-Hydroxyethyl）piperazine-N'-（2-ethanesulfonic acid），HEPES]}。在兩個鹽溶液池中注入 Steinberg 緩沖液，插入碳棒電極，連接電源。將反應器置于倒置顯微鏡操作平臺上，選擇觀察視野；開啟電泳儀電源，調節輸出電壓使得細胞培養室電場強度達到預設參數。開啟顯微鏡攝像頭進行定時拍照記錄，拍照間隔為 1 min。分別給予 1、2、3、4、5、6 V/cm 電場強度刺激（分別設為 A1、A2、A3、A4、A5、A6 組），每組刺激時間為 6 h。各個測試條件至少完成 3 個重復樣本的實驗。
B 組：除了電刺激波形為方波外，其余細胞爬片的準備和實驗方法同 A 組。設置 2 個亞組，電刺激條件分別為電場強度 6 V/cm、占空比 50%、1 Hz（B1 組）和電場強度 6 V/cm、占空比 50%、2 Hz（B2 組），每組刺激時間為 6 h。
C 組：除了電刺激波形為雙相脈沖波外，其余細胞爬片的準備和實驗方法同 A 組。設置 2 個亞組，電刺激條件分別為電場強度 6 V/cm、2 ms、1 Hz（C1 組）和電場強度 6 V/cm、2 ms、2 Hz（C2 組），每組刺激時間為 6 h。
D 組：同上法將細胞爬片放入電場生物反應器中，但不施加電刺激。
1.5 觀測指標
1.5.1 細胞形態變化觀察 采用倒置顯微鏡觀察各組各時間點細胞形態變化。
1.5.2 細胞排列的 檢測 細胞排列的對齊程度采用 進行評估，參照文獻[12]方法并作適當修改。將倒置顯微鏡采集到的細胞圖像導入 Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件，每幅圖像隨機選擇 30～50 個細胞進行分析。分別標示出每個待測細胞的長軸與電場矢量的夾角，然后用以下公式進行計算： 。其中 為平均 ， 為第 i 個細胞的 ，i 取值范圍為 1～n；θ 為細胞長軸與電場矢量方向的夾角，θi 的取值范圍為 –90～90°，因此 的取值范圍為 –1～1（圖 2）。例如：若細胞與電場矢量方向平行，θi=0°，則 =cos（2×0°）=1；若細胞與電場矢量方向垂直，θi=90° 或 θi=–90°，則 OFi= cos（±2×90°）=–1。依次將所有細胞的 計算出來并取平均值，得到全部細胞的 。
1.5.3 細胞骨架染色分析 電刺激結束后取出各組細胞爬片，選擇一部分樣本（A4、A5、A6 組和 D 組）采用細胞肌動蛋白絲染色法檢測細胞形態學變化。將細胞爬片用 4% 多聚甲醛固定 10 min，PBS 漂洗 3 次，0.01%Triton X-100 對細胞膜打孔 10 min；PBS 漂洗 3 次，加入 100 nmol/L 羅丹明-鬼筆環肽，室溫避光孵育 30 min；PBS 漂洗 3 次，加入 1 μg/mL DAPI 復染細胞核；棄多余水分，用抗熒光淬滅封片劑封片，然后置于連接 MD50 顯微鏡攝像頭的熒光顯微鏡平臺，觀察羅丹明-鬼筆環肽標記的細胞肌動蛋白絲的分布狀況。
1.5.4 細胞活死染色檢測 取各組剩余細胞爬片置于新的 6 孔培養板中，每孔放置 1 片并加入 2 mL 完全培養液繼續培養 2 h。取出爬片，PBS 漂洗 3 次，加入細胞活死染色液（每毫升 PBS 中加入 4 μmol/L 鈣黃綠素-AM、4 μmol/L 碘化丙啶、1 μg/mL Hoechst33342），37℃、5%CO2、飽和濕度細胞培養箱中孵育 30 min。棄染色液，PBS 漂洗 3 次后放置在連接 MD50 顯微鏡攝像頭的倒置熒光顯微鏡平臺觀察，活細胞被染成綠色，死細胞被染成紅色。每個樣本隨機選取 5 個視野，分別統計活細胞數和死細胞數，按以下公式計算細胞存活率：[活細胞數/（活細胞數+死細胞數）]×100%。
1.5.5 電刺激作用下細胞的鈣離子活動檢測 為探索細胞在電場刺激下定向排列的內在機制，采用鈣離子熒光染色法[13]對 ADSCs 內的鈣離子活動進行染色分析。具體方法：按 1.4 描述的方法制備細胞爬片（未經電場刺激），加入含 10 μmol/L 鈣離子熒光試劑 Fluo-3/AM 的 Tyrode 溶液（136 mmol/L NaCl、5.4 mmol/L KCl、0.33 mmol/L NaH2PO4、1.0 mmol/L MgCl2、10 mmol/L HEPES、10 mmol/L Glucose、1.8 mmol/L CaCl2，pH=7.4），在 37℃、5% CO2、飽和濕度細胞培養室孵化 20 min。然后用無染色劑的 Tyrode 溶液漂洗 2 遍，將分組后的細胞爬片放入生物反應器，接通電刺激電源，給予相應電刺激，倒置熒光顯微鏡下觀察。
1.6 統計學方法
采用 SPSS14.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 不同波形電刺激作用下細胞的定向排列
2.1.1 倒置顯微鏡觀察 A 組：ADSCs 對直流電刺激的響應與電場強度相關，電場強度越高，形成垂直排列的細胞越多。A1～A4 組僅有少量細胞響應電場刺激而垂直于電場排列；A5 組許多細胞在 2 h 已呈現出垂直于電場排列的趨勢，6 h 后絕大部分細胞垂直于電場的定向排列。提示在相同的直流電場刺激時間內，ADSCs 對電場刺激的響應存在閾值現象，此閾值可能在 4～5 V/cm 間。A6 組絕大多數細胞響應電場刺激，4 h 時基本上垂直于電場排列。在響應電場刺激的過程中，可觀察到 ADSCs 通過細胞偽足的橫向收縮和縱向延長來實現；一些原本呈現多邊形的細胞在電場力作用下，逐漸形成垂直于電場的紡錘形細胞形態。另外，在電場刺激過程中，一些細胞保持正常的細胞分裂活動（如 A6 組中的一些折光性強的小圓形細胞）；說明 6 V/cm 直流電場強度是處于生理強度范圍內的。有個別細胞不受電場的影響，保持其原來的細胞排列方向，推測可能與 ADSCs 中包含其他類型混雜細胞有關。見圖 3。
各時間點 B1、B2 組，C1、C2 組及 D 組均未發現明顯的細胞定向排列現象。另外，在雙相脈沖作用下，細胞仍保持正常的細胞分裂和增殖，說明雙相脈沖電場強度處于生理強度范圍內。見圖 4。
2.1.2 D 組 為 –0.01±0.07。A1～A6 組分別為 0.02±0.14、–0.12±0.03、–0.18±0.09、–0.23±0.10、–0.71±0.08、–0.84±0.03，B1、B2 組分別為 0.06±0.19 和 –0.04±0.17，C1、C2 組分別為 –0.07±0.09 和 –0.07±0.18。除 A5、A6 組 顯著高于 D 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）外，其余各組 與 D 組比較差異均無統計學意義（P>0.05）；A5、A6 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
2.2 細胞骨架染色分析
電刺激 6 h 后，A5、A6 組絕大部分細胞的肌動蛋白絲垂直于電場強度方向排列，并形成平行排列的條束狀結構；一些原先呈圓形的細胞核在電場力作用下變為橢圓狀，也傾向于垂直電場矢量方向。A1～4 組，B1、B2 組，C1、C2 組和 D 組細胞的肌動蛋白絲處于隨機分布狀態，單個細胞占有培養表面的面積較大。見圖 5。
2.3 細胞活死染色檢測
細胞活死染色檢測示，各組絕大多數細胞為活細胞，死亡細胞很少。D 組細胞呈隨機排列；A4 組有一些定向排列趨勢，而 A5、A6 組大多數細胞垂直于電場方向排列。見圖 6。
D 組細胞存活率為 95.73%±1.99%；A1～A6 組分別為 96.50%±1.15%、95.07%±2.01%、91.73%±1.56%、87.50%±1.21%、85.10%±2.10%、80.73%±2.46%；B1、B2 組分別為 93.47%±3.20%、92.47%±4.54%；C1、C2 組分別為 92.33%±2.06%、92.00%±3.20%。除 A4、A5、A6 組細胞存活率顯著低于D組，比較差異有統計學意義（P<0.05）外，其余各組細胞存活率與 D 組比較差異均無統計學意義（P>0.05）；A4、A5 組細胞存活率顯著高于 A6 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）。
2.4 電刺激作用下細胞的鈣離子活動檢測
A4、A5、A6 組細胞內的鈣離子熒光強度稍高于 D 組，其余各組細胞內的鈣離子熒光強度與 D 組比較無顯著差別。見圖 7。另外，在開通和關斷 A6 組電刺激的瞬間，觀察到部分細胞出現了鈣離子振蕩波，這些振蕩波持續時間為 1～3 s，說明 6 V/cm 直流電刺激開關狀態能夠誘發細胞的鈣離子振蕩波；但持續給予直流電刺激并未出現更多鈣離子振蕩波，表明 ADSCs 尚未分化成具有電傳導功能的細胞（如心肌細胞或神經細胞）。
圖1
電刺激波形示意圖
a. 直流電；b. 方波；c. 雙相脈沖波
Figure1. Illustrations of electrical stimulation wave formsa. Direct current; b. Square wave; c. Biphasic pulse wave
圖2
細胞 OF 示意圖
表示電場矢量 a. 當 θ
The represents the electric field vector a. When θ
圖3
倒置顯微鏡觀察 A 組各時間點細胞形態變化（白箭頭示電場方向）
從左至右依次為 0、2、4、6 h a. A1 組（×10）；b. A2 組（×10）；c. A3 組（×25）；d. A4 組（×10）；e. A5 組（×10）；f. A6 組（×10）
Figure3. The morphological changes of cells in group A by inverted microscope at each time point (White arrow indicated the direction of electrical field)From left to right for the images at 0, 2, 4, and 6 hours, respectively a. Group A1 (×10); b. Group A2 (×10); c. Group A3 (×25); d. Group A4 (×10); e. Group A5 (×10); f. GroupA6 (×10)
圖4
倒置顯微鏡觀察 B1、C1、D 組各時間點細胞形態變化（白箭頭示電場方向）
從左至右依次為 0、2、4、6 h a. B1 組（×10）；b. C1 組（×10）；c. D 組（×10）
Figure4. The morphological changes of cells in groups B1, C1, and D by inverted microscope at each time point (White arrow indicated the direction of electrical field)From left to right for the images at 0, 2, 4, and 6 hours, respectively a. Group B1 (×10); b. Group C1 (×10); c. Group D (×10)
圖5
電刺激 6 h 后各組細胞骨架染色分析（熒光顯微鏡×20）
紅色示羅丹明-鬼筆環肽標記的細胞肌動蛋白絲，藍色示 DAPI 標記的細胞核 a. A4 組；b. A5 組；c. A6 組；d. D 組
Figure5. Fluorescence staining of cytoskeleton in each group after 6 hours electrical stimulation (Fluorescence microscope×20)Cellular actin filaments were stained with rhodamin-phalloidin (red), nuclei were stained with DAPI (blue) a. Group A4; b. Group A5; c. Group A6; d. Group D
圖6
電刺激 6 h 后各組細胞活死染色檢測（熒光顯微鏡×20）
綠色示鈣黃綠素-AM 標記活細胞的細胞質，紅色示碘化丙啶標記死細胞的細胞核，藍色示 Hoechst33342 標記所有細胞的細胞核 a. A4 組；b. A5 組；c. A6 組；d. D 組
Figure6. Live/dead cell assay in each group after 6 hours electrical stimulation (Fluorescence microscope×20)Cytoplasm of live cells were stained with calcein-AM (green), nuclei of dead cells were stained with propidium iodide (red), and the nuclei of all cells were stained with Hoechst33342 (blue) a. Group A4; b. Group A5; c. Group A6; d. Group D
圖7
電刺激 6 h 后各組細胞鈣離子熒光強度檢測（熒光顯微鏡×20）
a. A4 組；b. A5 組；c. A6 組；d. D 組
Figure7. The fluorescence intensity of calcium ion in each group after 6 hours electrical stimulation (Fluorescence microscope×20)a. Group A4; b. Group A5; c. Group A6; d. Group D
3 討論
細胞有序排列在細胞骨架重組、基因表達和細胞外基質重塑等細胞行為中起關鍵作用，并影響組織的修復和再生。采用電場刺激是一種調控細胞有序排列的便捷手段。既往文獻表明直流電場可促進細胞形態伸長并垂直于電場矢量方向排列[14]。細胞由無序到有序排列的響應時間取決于所施加的電場強度。例如，給予內皮祖細胞直流電場連續作用 4 h，其有序排列程度與電場強度（1～4 V/cm）成正比，電場強度越高，細胞有序排列程度越高[15]。電刺激還會影響細胞和組織的生物學功能，例如心肌細胞在電刺激作用下產生同步收縮，并逐漸形成有序排列的結構，從而降低興奮閾值電壓和增加收縮幅度[16]。在分子水平上，電刺激還會增強心肌細胞的基因表達水平，增加縫隙連接蛋白 43、心肌肌鈣蛋Ⅰ、肌球蛋白重鏈和橫紋肌 α 肌動蛋白的表達，并顯著增強組織工程心肌片的電脈沖傳播[17]。
在細胞定向排列研究方面，目前對于直流電場的研究文獻較多，而對其他電刺激波形的研究較少。雖然方波和雙相脈沖波已廣泛應用于臨床實踐，但它們對細胞定向排列的影響目前所知甚少。方波本質是以一種周期性間斷的直流電場，描述方波的電氣參數一般用電壓幅度、頻率和占空比表示，標準方波是占空比為 50% 的矩形波，占空比<50% 的方波被稱為矩形脈沖波或單相脈沖波，常用脈寬來標識其波形參數，脈寬與占空比和頻率相關。雙相脈沖波是指同時具有正負脈沖的波形，在電生理研究和臨床上最常見的雙相脈沖波是電荷平衡雙相脈沖波。單個波形周期內正負脈沖相伴出現，以避免連續的單相脈沖波（正脈沖或負脈沖）造成刺激電極直流極化，進而產生電化學副作用。無論是方波還是雙相脈沖波，在基礎醫學和臨床醫學中的應用都比較廣泛。例如，方波可用于透皮給藥，通過皮膚電穿孔促進藥物滲透至皮下，實現無創或微創治療[18]；雙相脈沖波常用于心臟起搏、除顫[19-20]；雙相脈沖波（2.5 V/cm、1 Hz、1 ms）能引起心肌成纖維細胞形態伸長，促進細胞增殖[21]。與單相方波相比，雙相脈沖波能夠更有效地促進心肌祖細胞向心肌細胞分化[22]，并促進 ADSCs 分化為心肌細胞樣細胞[9]。ADSCs 是從脂肪組織中分離獲得的一種具有多向分化潛能的干細胞，其具有取材容易的特點，只需少量組織即可獲得大量干細胞，適宜大規模培養，是一種比 BMSCs 更理想的成體干細胞[23]。還有研究發現 ADSCs 能夠在體外連續傳代 20 次以上，且穩定保持其干細胞轉錄因子特征[24]。
本研究觀察了 ADSCs 在各種直流、方波和雙相脈沖波作用下的細胞響應，結果顯示在 5 V/cm 和 6 V/cm 直流電場作用下，ADSCs 響應電刺激垂直于電場矢量方向排列；直流電場強度低于 5 V/cm 時，以及方波（6 V/cm、1 Hz 和 6 V/cm、2 Hz）和雙相脈沖波（6 V/cm、2 ms、1 Hz 和 6 V/cm、2 ms、2 Hz）均未能引起細胞的定向排列。從細胞的 分布來看，6 V/cm 直流電場作用下細胞具有最高的 ，5 V/cm 電刺激組次之，說明細胞的定向排列與電場強度密切相關。在 6 h 的電刺激時間段內，未觀測到方波和雙相脈沖波對細胞定向排列的影響，推測可能是因細胞受到的電刺激強度不夠所致。雖然方波和雙相脈沖波都具有 6 V/cm 的電場強度，但方波只有 50% 的占空比，在相同刺激電壓下，方波電刺激組中細胞受到的平均電流僅有直流電場刺激的一半，因此較低的電流刺激不足以引起細胞的定向排列。雙相脈沖波刺激組中的脈寬為 2 ms，當頻率為 1 Hz 時占空比為 0.2%，當頻率為 2 Hz 時占空比為 0.4%，顯然施加到細胞中的平均電流比方波更弱，因此也未能引起細胞的定向排列。但這并不排除方波和雙相脈沖波誘導細胞定向排列的可能性。在細胞響應電刺激過程中，還有一個重要因素應引起注意，即細胞膜的靜息電位變化。實際上，雙相脈沖波之所以能夠用于心臟起搏或心肌除顫，就是因為脈沖信號引起細胞膜靜息電位的改變，細胞膜去極化引起了細胞的電傳導，從而調控細胞的力電行為。要進一步了解脈沖波對細胞定向排列的影響，需要對電刺激參數進行更多摸索。另外，延長刺激時間也是一個重要選項，而這一點恰恰是應用直流電場刺激的限制條件，長時間的直流電場刺激會造成刺激電極極化，引起細胞培養液的電解，產生電化學副作用，造成細胞凋亡。雙相脈沖波是一種正負電荷平衡的波形，能夠有效抑制電化學副作用，因此可對細胞施加更長時間的電刺激。
直流電場 6 V/cm 屬于生理電場強度范圍，已有研究表明，受損的角膜上皮組織能夠產生相當于 5 V/cm 的內源性直流電場，進而動員周邊細胞遷徙至傷口處來促進傷口愈合[14, 25-26]。本研究的細胞骨架染色結果可見，定向排列的細胞形成比較緊密的細胞骨架結構，這有助于組織的修復和連接。若進一步提高直流電場強度，細胞定向排列的 可能會提高，但相應的電化學副作用也會增大。由于細胞培養液發生電解反應，pH 值變化，加上電流增大后產生的焦耳熱，導致細胞凋亡率上升。本研究結果也可觀察到，細胞存活率與所施加的直流電場強度成負相關，電場強度越高，存活率越低。但各實驗組的細胞存活率均>80%，表明在實驗中所采用的電刺激波形尚屬生理電場強度范圍以內。
細胞之所以能夠形成垂直于電場矢量方向的定向排列，可能與細胞內的鈣離子活動相關。本研究中鈣離子熒光染色結果顯示，5 V/cm 和 6 V/cm 電場刺激后細胞鈣離子活動增強，據此推測，細胞質內帶二價正電荷的游離鈣離子，在直流電場作用下向電場矢量的負極聚集，細胞內帶負電荷的氯離子向電場矢量的正極遷徙，形成細胞內正負離子的極化分布，導致細胞骨架的重新排列。同時細胞通過鈣離子通道對細胞內外鈣離子的流動進行調控，逐漸達到新的動態平衡，并使細胞偽足垂直于電場矢量方向排列。
綜上述，在 3 種電刺激波形中，直流電場刺激促進 ADSCs 的形態學變化，在 5 V/cm 和 6 V/cm 電場強度作用下可使其垂直于電場矢量方向定向排列，并保持良好的細胞存活率；實驗方案中的方波與雙相脈沖電場可保持 ADSCs 具有良好的細胞存活率，但不能引起細胞的定向排列。這些實驗研究有助于提高我們對不同電刺激波形在細胞定向排列中作用的認識，也為組織工程和再生醫學的研究提供了新的實驗依據。
