引用本文： 代廣春, 李滎娟, 徐宏亮, 林禹丞, 劉俊延, 徐林, 芮云峰. 深低溫冷凍對大鼠髕腱組織內肌腱干細胞生物學特性影響的研究. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(7): 845-852. doi: 10.7507/1002-1892.201703033 復制
肌腱損傷是運動系統最常見損傷之一，發病率逐年上升。有研究顯示，肌腱缺損占肌腱損傷的 25%[1]，其臨床治療效果欠佳，致殘率較高，嚴重影響患者生活質量。既往關于肌腱缺損治療方法的研究多集中于自體肌腱移植，該方法存在肌腱供區受損問題，增加患者痛苦。而同種異體肌腱來源廣泛、取材方便，其生物結構和功能與自體肌腱完全相同，已成為應用最廣泛的肌腱移植材料。目前，深低溫冷凍是同種異體肌腱組織最常用的保存和處理方法[2]。早期研究認為，深低溫冷凍處理后的同種異體肌腱組織中無活性細胞，僅作為生長支架[3]。但隨著近年研究的深入，有學者發現深低溫冷凍處理后的同種異體肌腱組織中仍存有活性肌腱細胞，且肌腱細胞能主動以內在性愈合方式參與到肌腱損傷愈合過程中[3-4]，提高缺損肌腱的愈合質量。研究發現，肌腱組織中包含具有多向分化潛能的肌腱干細胞（tendon-derived stem cells，TDSCs），其在維持肌腱穩態與修復肌腱損傷方面發揮了重要作用[5-9]。目前，有關深低溫冷凍處理對同種異體肌腱組織中 TDSCs 活性的影響罕見報道。本研究中，我們以體外分離培養的大鼠髕腱 TDSCs 為研究對象，探究深低溫冷凍處理對 TDSCs 細胞成活、細胞活力、細胞早期凋亡、細胞遷移能力及成肌腱相關基因表達的影響，以期為臨床應用同種異體肌腱移植修復肌腱缺損提供相關理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4 月齡雄性 SD 大鼠 12 只，體質量 450～500 g，由常州卡文斯實驗動物有限公司提供。
L-DMEM 培養基、FBS、慶大霉素、鏈霉素、胰蛋白酶（GIBCO 公司，美國）；Trizol 試劑（Life Technologies 公司，美國）；Ⅰ型膠原酶、蔗糖（Sigma-Aldrich 公司，美國）；Alamar Blue（YEASON 公司，美國）；Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒（Vazyme 公司，美國）；PrimeScriptTM RT Master Mix 試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM（Takara 公司，日本）；實時熒光定量 PCR 引物（上海捷瑞生物工程有限公司）。
V370 掃描儀（EPSON 公司，日本）；細胞培養箱、分光光度計、酶聯免疫檢測儀（Thermo Fisher 公司，美國）；FACS Calibur 流式細胞儀（BD Biosciences 公司，美國）；實時熒光定量 PCR 儀（Applied Biosystems 公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Olympus 公司，日本）；6.5 mm Transwell 小室（孔徑 8 μm）（Sigma-Aldrich 公司，美國）。
1.2 大鼠髕腱組織處理
隨機取 6 只 SD 大鼠引頸法處死，取雙側髕腱，剔除肌腱組織表面腱膜及腱-骨、腱-肌交界部位；生理鹽水沖洗后，置入含 10%DMSO、0.1 mol/L 蔗糖的 FBS 冷凍保護液的細胞凍存管中[10]，置于 4℃ 冰箱 2 h 后轉至–80℃ 冰箱，以 1℃/min 的恒定速率降溫至–80℃，過夜，轉至液氮中保存 7 d；取出并立即置入 37℃ 水浴中快速復溫，待凍存管中液體融解（<2 min）后，于無菌條件下將肌腱依次置入 1.0、0.5、0.25 mmol/L 蔗糖溶液（4℃）中各 5 min，間隔 10 min；最后，將深低溫冷凍處理的肌腱保存在含 10%FBS 的 L-DMEM 培養基中。另取 6 只大鼠，同上法麻醉、取出雙側髕腱后，直接置于含 10%FBS 的 L-DMEM 培養基中。
1.3 TDSCs 的分離及培養
參照本課題組前期經驗及方法[6]分離培養大鼠 TDSCs。無菌條件下，分別取 1.2 中獲得的深低溫冷凍處理髕腱組織（實驗組）及正常髕腱組織（對照組），PBS 沖洗，取中段組織，用眼科剪將其剪成 1 mm×1 mm×1 mm 小塊，置于含 4～5 mL 0.3%Ⅰ型膠原酶的 15 mL 離心管中，兩種髕腱組織各 12 條，可分成 5～6 管；消化 2.5 h，每 30 分鐘搖晃 1 次；待消化后，用 3 mL 吸管輕輕吹打后以 70 μm 細胞濾器過濾，收集單細胞懸液。PBS 洗滌 2 次，以 300×g 離心 5 min，去上清，用基礎培養基（含 10%FBS、1% 雙抗的 L-DMEM 培養基）重懸細胞。然后按 50 個/cm2 細胞密度接種至直徑為 6 cm 的培養皿中，第 2 天首次換液，PBS 洗滌 2 次，移除未貼壁細胞。培養 7 d 左右用 0.25% 胰蛋白酶消化細胞并混合，標記為原代細胞。細胞鋪滿培養瓶底達 90% 后傳代，棄培養液，PBS 洗滌 2 次，0.25% 胰蛋白酶消化 2～3 min，加入基礎培養基終止消化，細胞懸液以 300×g 離心 5 min，棄上清，加入 2 mL 基礎培養基重懸細胞并計數，按 5×103個/cm2 密度接種至培養瓶。取第 3 代細胞進行克隆形成能力及三系分化能力實驗等，鑒定為 TDSCs 后用于實驗[6]。
1.4 觀測指標
1.4.1 深低溫冷凍對肌腱組織有核細胞成活率的影響 采用錐蟲藍染色測定細胞成活率。取兩組肌腱組織經 0.3%Ⅰ型膠原酶消化獲得的有核細胞懸液置入 15 mL 離心管中，以 300×g 離心 3 min，棄上清，加入 2 mL PBS 重懸細胞。吸取 100 μL 重懸的細胞懸液至另一 15 mL 離心管內，加入 100 μL 錐蟲藍染色液，輕輕混勻，染色 5 min。吸取染色后的細胞懸液，用血細胞計數板計數，鏡下見死細胞呈藍染。按照以下公式計算細胞成活率：（細胞總數—藍染細胞數）/細胞總數×100%。
1.4.2 深低溫冷凍對肌腱組織有核細胞克隆集落形成的影響 取兩組肌腱組織經 0.3%Ⅰ型膠原酶消化獲得的有核細胞懸液，以 150 個/cm2 細胞密度接種于面積為 21 cm2 的培養皿中，置于普通細胞培養箱中培養，用基礎培養基培養細胞，第 2 天首次換液，PBS 洗滌 2 次，移除未貼壁細胞。每 3 天換液 1 次，培養 12 d 后采用 0.5% 龍膽紫染色 15 min，觀察細胞克隆集落形成情況，用 Image J 軟件計算克隆集落形成數目，直徑<2 mm 舍去。按照以下公式計算每 1 000 個有核細胞中克隆集落形成數：克隆集落形成數/有核細胞總數×1 000；計算 TDSCs 占活性有核細胞比例：每 1 000 個有核細胞中克隆集落形成數/（1 000×有核細胞成活率）×100%。其中，克隆集落形成數代表 TDSCs 數。
1.4.3 深低溫冷凍對肌腱組織 TDSCs 細胞活力的影響 采用 Alamar Blue 法檢測細胞活力。取兩組第 3 代 TDSCs 接種至 96 孔板中，每孔 2×103個細胞，每組設 6 個復孔。每孔加入 100 μL 基礎培養基，于普通細胞培養箱中培養。于培養 2、4、6、8、10、12、14 d，每孔加入 Alamar Blue 溶液 10 μL，37℃ 繼續孵育 4 h 后終止培養，采用酶聯免疫檢測儀于 570 nm 測量各孔吸光度（A）值。檢測完畢后，吸盡孔內培養上清液，PBS 清洗 3 次后，加入新鮮培養基 100 μL，繼續培養至下一觀測時間點，重復以上操作。
1.4.4 深低溫冷凍對肌腱組織 TDSCs 細胞早期凋亡的影響 采用 Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測細胞早期凋亡率。取兩組第 3 代 TDSCs，以 5×103個/cm2細胞密度接種至 6 孔板，每組設 3 個復孔。每孔加入 2.5 mL 基礎培養基，于普通細胞培養箱中培養 3 d，待細胞融合達 80%～90% 后，用不含 EDTA 的 0.25% 胰蛋白酶消化后收集細胞，用 4℃ 預冷的 PBS 洗滌細胞 2 次，每次洗滌按 4℃、300×g 離心 5 min 條件進行操作，最終收集（1～5）×105 個細胞。加入 100 μL 1×Binding Buffer 重懸細胞，并加入 5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI 染色液，輕輕混勻，避光、室溫反應 10 min。加入 400 μL 1×Binding Buffer，輕輕混勻，采用 FACS Calibur 流式細胞儀，激發波長設為 488 nm，每管計數 1×104個細胞，流式細胞儀分選后，計算出對應右下象限的早期凋亡細胞，細胞早期凋亡率計算公式：早期凋亡細胞/細胞總數×100%。
1.4.5 深低溫冷凍對 TDSCs 體外遷移能力的影響 采用 Transwell 法檢測細胞體外遷移能力。取兩組第 3 代 TDSCs，以 2×104 個/孔密度接種于 24 孔板 Transwell 的上室。上室每孔加入 100 μL 不含血清的 L-DMEM，下室每孔加入 600 μL 含 20%FBS 的 L-DMEM 培養基，每組設 6 個復孔。置于普通細胞培養箱中培養 36 h 后，輕輕移去培養基，PBS 清洗 3 次，用棉簽擦去上室未穿孔的細胞；每孔加入 600 μL 甲醇固定 10 min；移去甲醇，每孔加入 600 μL 0.1% 結晶紫染液染色 20 min；移去結晶紫染液，PBS 清洗 3 次，每次 5 min，室溫下晾干，小室翻轉膜朝上，倒置相差顯微鏡觀察并拍照。于 40 倍鏡下隨機選取 6 個視野拍照，用 Image J 軟件計數遷移至濾膜下表面的細胞。
1.4.6 深低溫冷凍對 TDSCs 肌腱相關基因表達的影響 采用實時熒光定量 PCR 檢測Ⅰ型膠原（colla-gen type Ⅰ，Col1α1）、scleraxis（Scx）和 tenomodulin（Tnmd）的 mRNA 表達。取兩組第 3 代 TDSCs，以 5×103 個/cm2 密度接種至 6 孔板中，每組設 6 個復孔，每孔加入 2.5 mL 基礎培養基。于普通細胞培養箱中培養 3 d，待細胞融合達 80%～90% 后，每孔加 1 mL Trizol 提取總 RNA，根據 PrimeScriptTM RT Master Mix 試劑盒說明書反轉錄為 cDNA，參照 SYBR Premix Ex TaqTM 說明書進行實時熒光定量 PCR 擴增。以 β-actin 為內參，引物序列見表 1。反應體系為 SYBR Premix Ex TaqTM 10 μL，10 μmol/L 正反引物各 0.4 μL，加去離子水補足體積至 20 μL。反應條件：95℃、10 min 變性，進入擴增曲線，95℃、15 s，最佳退火溫度 20 s，72℃、30 s，進行 40 個循環；進入溶解曲線，95℃、15 s，60℃、1 min，以 0.3℃/s 速度升到 95℃、15 s。Col1α1、Scx 和 Tnmd 的 mRNA 相對表達量用 2–△Ct表示，其中△Ct=Ct目的–Ct內參。
表1
目的基因引物序列、產物長度及退火溫度
Table1.
Primer sequences, product size, and annealing temperature of target genes
1.5 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 深低溫冷凍對肌腱組織有核細胞成活率的影響
對照組正常肌腱組織消化后，原代有核細胞絕大部分不著色，原代有核細胞成活率為 91.00%±3.63%。與對照組比較，實驗組深低溫冷凍組肌腱組織消化所得的原代有核細胞大部分不著色，原代有核細胞成活率為 61.65%±4.76%，組間細胞成活率比較差異有統計學意義（t=12.010，P=0.000）。
2.2 深低溫冷凍對肌腱組織有核細胞克隆集落形成的影響
兩組有核細胞接種后，均呈克隆樣生長（圖 1）；培養 12 d，實驗組每 1 000 個有核細胞克隆集落形成數為（8.41±0.33）個，較對照組（15.19±0.47）個顯著減少，比較差異有統計學意義（t=28.910，P=0.000）；實驗組 TDSCs 占活性有核細胞比例為 1.37%±0.09%，較對照組 1.67%±0.10% 顯著減少，比較差異有統計學意義（t=5.508，P=0.003）。
圖1
兩組培養 12 d 有核細胞克隆集落形成觀察
a. 實驗組；b. 對照組
Figure1. Observation of nucleated cells clones in 2 groups after cultured for 12 daysa. Experimental group; b. Control group
2.3 深低溫冷凍對肌腱組織 TDSCs 細胞活力的影響
培養 14 d 內觀察，兩組細胞生長趨勢一致；培養前 8 d 細胞均呈平穩增長趨勢，8～12 d 為生長加速期，12 d 后又趨于平穩。兩組各時間點 A 值比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 2。
圖2
Alamar Blue 法檢測兩組細胞活力
Figure2.
Cell viability in 2 groups by Alamar Blue method
2.4 深低溫冷凍對肌腱組織 TDSCs 細胞早期凋亡的影響
實驗組及對照組 TDSCs 早期凋亡率分別為 1.67%±0.06%、1.63%±0.06%，比較差異無統計學意義（t=0.707，P=0.519）。見圖 3。
圖3
流式細胞儀檢測兩組 TDSCs 早期凋亡
a. 實驗組；b. 對照組
Figure3. Early apoptosis of TDSCs in 2 groups by flow cytometrya. Experimental group; b. Control group
2.5 深低溫冷凍對 TDSCs 體外遷移能力的影響
鏡下見，兩組均有 TDSCs 黏附于 Transwell 小室下室（圖 4），且黏附于 Transwell 小室下室面的細胞均明顯多于漏出到孔板中的細胞。實驗組細胞數為（445.00±9.70）個，對照組為（451.50±12.66）個，比較差異無統計學意義（t=0.998，P=0.342）。
圖4
兩組培養 3 d 后細胞遷移觀察（倒置相差顯微鏡×40）
a. 實驗組；b. 對照組
Figure4. Observation of cell migration in 2 groups after cultured for 3 days (Inverted phase contrast microscope×40)a. Experimental group; b. Control group
2.6 深低溫冷凍對 TDSCs 肌腱相關基因表達的影響
實驗組 Col1α1、Scx、Tnmd 的 mRNA 相對表達量分別為 3.498±0.065、0.062±0.002、（4.211±0.211）×10–5，對照組分別為 3.499±0.113、0.062±0.001、（4.341±0.274）×10–5，比較差異均無統計學意義（t=0.013，P=0.991；t=0.042，P=0.969；t=0.653，P=0.549）。
3 討論
目前，深低溫冷凍處理是目前應用最廣泛且最有效的保存同種異體肌腱組織的方法[11]。深低溫冷凍處理過程中受多種因素影響，如被保存物體大小、冷凍速率、冷凍保護劑、冷凍保存時間等[12-15]，其中，冷凍保護劑是冷凍成敗的關鍵之一[12]。冷凍保護劑可分為滲透性和非滲透性兩類，目前多聯合使用兩種以上冷凍保護劑組成的保護液，以降低保護劑本身毒性，同時提高冷凍保護效率。本實驗選擇滲透性的 DMSO 和非滲透性的蔗糖加入 FBS 中作為冷凍保護劑，以達到更好的冷凍效果[10]。前期研究多將肌腱組織保存在液氮中 1 周左右，或者 2 周甚至更長，結果顯示肌腱組織免疫原性降低，但生物力學性能等方面無顯著變化[4, 16-17]。張發惠等[15]的研究將兔小腿肌腱給予不同冷凍時間處理，結果顯示冷凍儲存 360 d 組的肌腱破壞荷載和肌腱延伸率較對照組顯著下降，而其余低于 360 d 處理時間組與對照組比較均無明顯變化，提示短時間冷凍儲存不會影響肌腱組織力學性能。因此，本研究選擇于液氮中保存 7 d。
研究表明，深低溫冷凍技術用于保存椎間盤、皮膚等組織時，組織經深低溫冷凍后均有細胞存活[18-20]。本實驗中，兩組肌腱組織均檢測到有活性的肌腱細胞，但實驗組原代有核細胞成活率顯著低于對照組，提示深低溫冷凍處理過程中會造成部分細胞損傷死亡。但經過深低溫冷凍處理后，肌腱組織中仍有細胞存活，當肌腱組織植入機體內，存活的細胞會在肌腱組織的修復及愈合過程中發揮作用。結合研究結果分析，提示深低溫冷凍處理可用于保存肌腱組織，且冷凍后組織中有活性腱細胞。
學者們分別從大鼠﹑小鼠和人肌腱組織中成功分離 TDSCs，證實在多個物種肌腱組織中除肌腱細胞外，還存在一群具有克隆形成能力﹑自我更新以及多向分化潛能的MSCs群[6, 21]。成體干細胞在組織內以保持沉默態和處于激活態兩種方式并存，在維持組織平衡和參與組織損傷修復方面發揮作用[5]。在生理狀態細胞發生更替或肌腱組織遭受創傷正常愈合時，TDSCs 被激活，通過成肌腱分化定向分化為肌腱細胞，對自身特異性組織中已經分化的肌腱起到維持﹑再生和替代的作用[22]。這種 TDSCs 的分化將促進受損肌腱組織的愈合修復[5-9, 21-22]。鑒于 TDSCs 在肌腱組織損傷修復過程中的重要作用，有必要對其生物學特性等方面進行研究。
本課題組既往研究發現，將肌腱組織消化所得有核細胞以較低密度接種到培養皿后，干細胞增殖相對較快，在培養皿中呈克隆集落樣貼壁生長[6]。本實驗按此步驟將兩組肌腱組織消化所得的有核細胞進行相同條件培養后，均呈克隆樣生長，形成細胞簇，實驗組細胞克隆集落形成數少于對照組，表明冷凍過程中，肌腱組織消化所得有核細胞中有干性細胞的存在，但數目較正常肌腱組織減少。實驗組 TDSCs 占活性有核細胞比例較對照組降低，說明 TDSCs 在深低溫冷凍過程中易受損傷。
干細胞生長至第 1 代過程中，細胞中存在具有不同細胞形態及細胞表型的其他細胞，傳代至第 3 代時，細胞主要表現為均一的具有成纖維細胞特征的長梭形，高表達具有 MSCs 特性的表面標志物，具有克隆形成、體外增殖能力以及多向分化的能力[6]。因此，本實驗選擇第 3 代 TDSCs 進行相關實驗。細胞活力是檢測細胞生物學特性常用指標之一，Alamar Blue 對細胞無毒、無害，幾乎不干擾細胞正常代謝[23]，所我們利用 Alamar Blue 法比較兩組 TDSCs 相同條件培養 14 d 后的細胞活力。結果顯示，培養 14 d 內兩組細胞生長過程可分成 3 個時間段，與細胞正常生長過程相符合，即分為細胞生長滯留期、指數增殖期及平臺期 3 個時期。兩組各時間點 A 值比較差異無統計學意義，可見深低溫冷凍處理后的 TDSCs 細胞活力可恢復至正常水平。Annexin V-FITC/PI 雙染法結果顯示，兩組 TDSCs 早期凋亡率差異無統計學意義。細胞凋亡是為了維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主、有序的死亡，也是細胞生長、代謝、增殖能力指標之一。本實驗結果說明，經深低溫冷凍處理后的 TDSCs 生長過程中分裂增殖和代謝等能力可恢復至正常細胞水平。細胞遷移能力是細胞正常基本功能之一，是活細胞普遍存在的一種運動形式，也因細胞遷移獨有的運動特性，成為細胞生物學特性研究熱點之一。細胞遷移主要受細胞內肌動蛋白細胞骨架和其動力學性能及細胞外基質影響[24-25]。實驗組 TDSCs 遷移能力與對照組相似，且 TDSCs 合成胞內蛋白及細胞外基質能力均可達正常水平。TDSCs 作為 MSCs 的一個類型，除了表達表面標志 CD44 和 CD90 等外，還高表達肌腱相關性基因，主要有 Col1α1、Scx、Tnmd、巢蛋白等[6, 21, 26]。肌腱組織主要由大量富含膠原纖維的結締組織構成，Ⅰ 型膠原是膠原纖維主要成分，其中 Col1α1 是 Ⅰ 型膠原合成的第 1 鏈，故選擇 Col1α1 基因作為研究基質蛋白的目標基因。在胚胎發育過程中，Scx 是最早發現的 TDSCs 特異標志基因，Scx 基因敲除老鼠會出現嚴重的肌腱缺損，證實了在肌腱組織形成過程中 Scx 發揮著重要作用[27]。Tnmd 是 Ⅱ 型跨膜蛋白新的一員，常高表達于肌腱、韌帶和眼睛部位，低表達于胸腺、心臟和肝臟等組織中，Tnmd 基因敲除鼠的新生肌腱組織中增殖細胞嚴重減少，細胞密度減低，膠原纖維排列紊亂，由此可見 Tnmd 是肌腱組織發育過程中的重要標志，在肌腱細胞增殖和膠原纖維成熟中起重要調節作用[28-29]。因此，我們選擇檢測 Col1α1、Scx、Tnmd 基因相對表達量來代表細胞外基質合成與成肌腱分化轉錄基因的表達，結果實驗組以上指標與對照組無顯著差異。與 Brandau 等[30]研究認為深低溫冷凍處理后細胞 Tnmd mRNA 的高表達不同，本實驗組 Tnmd 的 mRNA 相對表達量較低，但兩組表達均低，無明顯差異，說明深低溫冷凍處理后的 TDSCs 其成肌腱分化能力可恢復至正常水平。
TDSCs 在肌腱損傷修復過程中起著重要作用，其可通過成肌腱定向分化為肌腱細胞，與肌腱細胞一起通過合成分泌膠原纖維，重塑肌腱纖維結構，以此維持肌腱的正常生理功能。同種異體肌腱組織經深低溫冷凍可以保存肌腱纖維結締組織，可提供一個良好的“膠原纖維支架”。本實驗成功從深低溫冷凍處理后的肌腱組織中提取 TDSCs，且與正常細胞相比生物學特性無顯著差異，仍能定向成肌腱分化為肌腱細胞，提示以原有纖維為支架，可能會更高效地促進肌腱組織損傷的愈合。然而，影響同種異體肌腱組織植入機體后發揮作用的因素很多，后續實驗需要研究冷凍同種異體肌腱組織應用于機體的免疫原性、組織學及生物力學的變化，以期為同種異體肌腱組織組織在肌腱缺損中的應用提供完整的理論依據。
肌腱損傷是運動系統最常見損傷之一，發病率逐年上升。有研究顯示，肌腱缺損占肌腱損傷的 25%[1]，其臨床治療效果欠佳，致殘率較高，嚴重影響患者生活質量。既往關于肌腱缺損治療方法的研究多集中于自體肌腱移植，該方法存在肌腱供區受損問題，增加患者痛苦。而同種異體肌腱來源廣泛、取材方便，其生物結構和功能與自體肌腱完全相同，已成為應用最廣泛的肌腱移植材料。目前，深低溫冷凍是同種異體肌腱組織最常用的保存和處理方法[2]。早期研究認為，深低溫冷凍處理后的同種異體肌腱組織中無活性細胞，僅作為生長支架[3]。但隨著近年研究的深入，有學者發現深低溫冷凍處理后的同種異體肌腱組織中仍存有活性肌腱細胞，且肌腱細胞能主動以內在性愈合方式參與到肌腱損傷愈合過程中[3-4]，提高缺損肌腱的愈合質量。研究發現，肌腱組織中包含具有多向分化潛能的肌腱干細胞（tendon-derived stem cells，TDSCs），其在維持肌腱穩態與修復肌腱損傷方面發揮了重要作用[5-9]。目前，有關深低溫冷凍處理對同種異體肌腱組織中 TDSCs 活性的影響罕見報道。本研究中，我們以體外分離培養的大鼠髕腱 TDSCs 為研究對象，探究深低溫冷凍處理對 TDSCs 細胞成活、細胞活力、細胞早期凋亡、細胞遷移能力及成肌腱相關基因表達的影響，以期為臨床應用同種異體肌腱移植修復肌腱缺損提供相關理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4 月齡雄性 SD 大鼠 12 只，體質量 450～500 g，由常州卡文斯實驗動物有限公司提供。
L-DMEM 培養基、FBS、慶大霉素、鏈霉素、胰蛋白酶（GIBCO 公司，美國）；Trizol 試劑（Life Technologies 公司，美國）；Ⅰ型膠原酶、蔗糖（Sigma-Aldrich 公司，美國）；Alamar Blue（YEASON 公司，美國）；Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒（Vazyme 公司，美國）；PrimeScriptTM RT Master Mix 試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM（Takara 公司，日本）；實時熒光定量 PCR 引物（上海捷瑞生物工程有限公司）。
V370 掃描儀（EPSON 公司，日本）；細胞培養箱、分光光度計、酶聯免疫檢測儀（Thermo Fisher 公司，美國）；FACS Calibur 流式細胞儀（BD Biosciences 公司，美國）；實時熒光定量 PCR 儀（Applied Biosystems 公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Olympus 公司，日本）；6.5 mm Transwell 小室（孔徑 8 μm）（Sigma-Aldrich 公司，美國）。
1.2 大鼠髕腱組織處理
隨機取 6 只 SD 大鼠引頸法處死，取雙側髕腱，剔除肌腱組織表面腱膜及腱-骨、腱-肌交界部位；生理鹽水沖洗后，置入含 10%DMSO、0.1 mol/L 蔗糖的 FBS 冷凍保護液的細胞凍存管中[10]，置于 4℃ 冰箱 2 h 后轉至–80℃ 冰箱，以 1℃/min 的恒定速率降溫至–80℃，過夜，轉至液氮中保存 7 d；取出并立即置入 37℃ 水浴中快速復溫，待凍存管中液體融解（<2 min）后，于無菌條件下將肌腱依次置入 1.0、0.5、0.25 mmol/L 蔗糖溶液（4℃）中各 5 min，間隔 10 min；最后，將深低溫冷凍處理的肌腱保存在含 10%FBS 的 L-DMEM 培養基中。另取 6 只大鼠，同上法麻醉、取出雙側髕腱后，直接置于含 10%FBS 的 L-DMEM 培養基中。
1.3 TDSCs 的分離及培養
參照本課題組前期經驗及方法[6]分離培養大鼠 TDSCs。無菌條件下，分別取 1.2 中獲得的深低溫冷凍處理髕腱組織（實驗組）及正常髕腱組織（對照組），PBS 沖洗，取中段組織，用眼科剪將其剪成 1 mm×1 mm×1 mm 小塊，置于含 4～5 mL 0.3%Ⅰ型膠原酶的 15 mL 離心管中，兩種髕腱組織各 12 條，可分成 5～6 管；消化 2.5 h，每 30 分鐘搖晃 1 次；待消化后，用 3 mL 吸管輕輕吹打后以 70 μm 細胞濾器過濾，收集單細胞懸液。PBS 洗滌 2 次，以 300×g 離心 5 min，去上清，用基礎培養基（含 10%FBS、1% 雙抗的 L-DMEM 培養基）重懸細胞。然后按 50 個/cm2 細胞密度接種至直徑為 6 cm 的培養皿中，第 2 天首次換液，PBS 洗滌 2 次，移除未貼壁細胞。培養 7 d 左右用 0.25% 胰蛋白酶消化細胞并混合，標記為原代細胞。細胞鋪滿培養瓶底達 90% 后傳代，棄培養液，PBS 洗滌 2 次，0.25% 胰蛋白酶消化 2～3 min，加入基礎培養基終止消化，細胞懸液以 300×g 離心 5 min，棄上清，加入 2 mL 基礎培養基重懸細胞并計數，按 5×103個/cm2 密度接種至培養瓶。取第 3 代細胞進行克隆形成能力及三系分化能力實驗等，鑒定為 TDSCs 后用于實驗[6]。
1.4 觀測指標
1.4.1 深低溫冷凍對肌腱組織有核細胞成活率的影響 采用錐蟲藍染色測定細胞成活率。取兩組肌腱組織經 0.3%Ⅰ型膠原酶消化獲得的有核細胞懸液置入 15 mL 離心管中，以 300×g 離心 3 min，棄上清，加入 2 mL PBS 重懸細胞。吸取 100 μL 重懸的細胞懸液至另一 15 mL 離心管內，加入 100 μL 錐蟲藍染色液，輕輕混勻，染色 5 min。吸取染色后的細胞懸液，用血細胞計數板計數，鏡下見死細胞呈藍染。按照以下公式計算細胞成活率：（細胞總數—藍染細胞數）/細胞總數×100%。
1.4.2 深低溫冷凍對肌腱組織有核細胞克隆集落形成的影響 取兩組肌腱組織經 0.3%Ⅰ型膠原酶消化獲得的有核細胞懸液，以 150 個/cm2 細胞密度接種于面積為 21 cm2 的培養皿中，置于普通細胞培養箱中培養，用基礎培養基培養細胞，第 2 天首次換液，PBS 洗滌 2 次，移除未貼壁細胞。每 3 天換液 1 次，培養 12 d 后采用 0.5% 龍膽紫染色 15 min，觀察細胞克隆集落形成情況，用 Image J 軟件計算克隆集落形成數目，直徑<2 mm 舍去。按照以下公式計算每 1 000 個有核細胞中克隆集落形成數：克隆集落形成數/有核細胞總數×1 000；計算 TDSCs 占活性有核細胞比例：每 1 000 個有核細胞中克隆集落形成數/（1 000×有核細胞成活率）×100%。其中，克隆集落形成數代表 TDSCs 數。
1.4.3 深低溫冷凍對肌腱組織 TDSCs 細胞活力的影響 采用 Alamar Blue 法檢測細胞活力。取兩組第 3 代 TDSCs 接種至 96 孔板中，每孔 2×103個細胞，每組設 6 個復孔。每孔加入 100 μL 基礎培養基，于普通細胞培養箱中培養。于培養 2、4、6、8、10、12、14 d，每孔加入 Alamar Blue 溶液 10 μL，37℃ 繼續孵育 4 h 后終止培養，采用酶聯免疫檢測儀于 570 nm 測量各孔吸光度（A）值。檢測完畢后，吸盡孔內培養上清液，PBS 清洗 3 次后，加入新鮮培養基 100 μL，繼續培養至下一觀測時間點，重復以上操作。
1.4.4 深低溫冷凍對肌腱組織 TDSCs 細胞早期凋亡的影響 采用 Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測細胞早期凋亡率。取兩組第 3 代 TDSCs，以 5×103個/cm2細胞密度接種至 6 孔板，每組設 3 個復孔。每孔加入 2.5 mL 基礎培養基，于普通細胞培養箱中培養 3 d，待細胞融合達 80%～90% 后，用不含 EDTA 的 0.25% 胰蛋白酶消化后收集細胞，用 4℃ 預冷的 PBS 洗滌細胞 2 次，每次洗滌按 4℃、300×g 離心 5 min 條件進行操作，最終收集（1～5）×105 個細胞。加入 100 μL 1×Binding Buffer 重懸細胞，并加入 5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI 染色液，輕輕混勻，避光、室溫反應 10 min。加入 400 μL 1×Binding Buffer，輕輕混勻，采用 FACS Calibur 流式細胞儀，激發波長設為 488 nm，每管計數 1×104個細胞，流式細胞儀分選后，計算出對應右下象限的早期凋亡細胞，細胞早期凋亡率計算公式：早期凋亡細胞/細胞總數×100%。
1.4.5 深低溫冷凍對 TDSCs 體外遷移能力的影響 采用 Transwell 法檢測細胞體外遷移能力。取兩組第 3 代 TDSCs，以 2×104 個/孔密度接種于 24 孔板 Transwell 的上室。上室每孔加入 100 μL 不含血清的 L-DMEM，下室每孔加入 600 μL 含 20%FBS 的 L-DMEM 培養基，每組設 6 個復孔。置于普通細胞培養箱中培養 36 h 后，輕輕移去培養基，PBS 清洗 3 次，用棉簽擦去上室未穿孔的細胞；每孔加入 600 μL 甲醇固定 10 min；移去甲醇，每孔加入 600 μL 0.1% 結晶紫染液染色 20 min；移去結晶紫染液，PBS 清洗 3 次，每次 5 min，室溫下晾干，小室翻轉膜朝上，倒置相差顯微鏡觀察并拍照。于 40 倍鏡下隨機選取 6 個視野拍照，用 Image J 軟件計數遷移至濾膜下表面的細胞。
1.4.6 深低溫冷凍對 TDSCs 肌腱相關基因表達的影響 采用實時熒光定量 PCR 檢測Ⅰ型膠原（colla-gen type Ⅰ，Col1α1）、scleraxis（Scx）和 tenomodulin（Tnmd）的 mRNA 表達。取兩組第 3 代 TDSCs，以 5×103 個/cm2 密度接種至 6 孔板中，每組設 6 個復孔，每孔加入 2.5 mL 基礎培養基。于普通細胞培養箱中培養 3 d，待細胞融合達 80%～90% 后，每孔加 1 mL Trizol 提取總 RNA，根據 PrimeScriptTM RT Master Mix 試劑盒說明書反轉錄為 cDNA，參照 SYBR Premix Ex TaqTM 說明書進行實時熒光定量 PCR 擴增。以 β-actin 為內參，引物序列見表 1。反應體系為 SYBR Premix Ex TaqTM 10 μL，10 μmol/L 正反引物各 0.4 μL，加去離子水補足體積至 20 μL。反應條件：95℃、10 min 變性，進入擴增曲線，95℃、15 s，最佳退火溫度 20 s，72℃、30 s，進行 40 個循環；進入溶解曲線，95℃、15 s，60℃、1 min，以 0.3℃/s 速度升到 95℃、15 s。Col1α1、Scx 和 Tnmd 的 mRNA 相對表達量用 2–△Ct表示，其中△Ct=Ct目的–Ct內參。
表1
目的基因引物序列、產物長度及退火溫度
Table1.
Primer sequences, product size, and annealing temperature of target genes
1.5 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 深低溫冷凍對肌腱組織有核細胞成活率的影響
對照組正常肌腱組織消化后，原代有核細胞絕大部分不著色，原代有核細胞成活率為 91.00%±3.63%。與對照組比較，實驗組深低溫冷凍組肌腱組織消化所得的原代有核細胞大部分不著色，原代有核細胞成活率為 61.65%±4.76%，組間細胞成活率比較差異有統計學意義（t=12.010，P=0.000）。
2.2 深低溫冷凍對肌腱組織有核細胞克隆集落形成的影響
兩組有核細胞接種后，均呈克隆樣生長（圖 1）；培養 12 d，實驗組每 1 000 個有核細胞克隆集落形成數為（8.41±0.33）個，較對照組（15.19±0.47）個顯著減少，比較差異有統計學意義（t=28.910，P=0.000）；實驗組 TDSCs 占活性有核細胞比例為 1.37%±0.09%，較對照組 1.67%±0.10% 顯著減少，比較差異有統計學意義（t=5.508，P=0.003）。
圖1
兩組培養 12 d 有核細胞克隆集落形成觀察
a. 實驗組；b. 對照組
Figure1. Observation of nucleated cells clones in 2 groups after cultured for 12 daysa. Experimental group; b. Control group
2.3 深低溫冷凍對肌腱組織 TDSCs 細胞活力的影響
培養 14 d 內觀察，兩組細胞生長趨勢一致；培養前 8 d 細胞均呈平穩增長趨勢，8～12 d 為生長加速期，12 d 后又趨于平穩。兩組各時間點 A 值比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 2。
圖2
Alamar Blue 法檢測兩組細胞活力
Figure2.
Cell viability in 2 groups by Alamar Blue method
2.4 深低溫冷凍對肌腱組織 TDSCs 細胞早期凋亡的影響
實驗組及對照組 TDSCs 早期凋亡率分別為 1.67%±0.06%、1.63%±0.06%，比較差異無統計學意義（t=0.707，P=0.519）。見圖 3。
圖3
流式細胞儀檢測兩組 TDSCs 早期凋亡
a. 實驗組；b. 對照組
Figure3. Early apoptosis of TDSCs in 2 groups by flow cytometrya. Experimental group; b. Control group
2.5 深低溫冷凍對 TDSCs 體外遷移能力的影響
鏡下見，兩組均有 TDSCs 黏附于 Transwell 小室下室（圖 4），且黏附于 Transwell 小室下室面的細胞均明顯多于漏出到孔板中的細胞。實驗組細胞數為（445.00±9.70）個，對照組為（451.50±12.66）個，比較差異無統計學意義（t=0.998，P=0.342）。
圖4
兩組培養 3 d 后細胞遷移觀察（倒置相差顯微鏡×40）
a. 實驗組；b. 對照組
Figure4. Observation of cell migration in 2 groups after cultured for 3 days (Inverted phase contrast microscope×40)a. Experimental group; b. Control group
2.6 深低溫冷凍對 TDSCs 肌腱相關基因表達的影響
實驗組 Col1α1、Scx、Tnmd 的 mRNA 相對表達量分別為 3.498±0.065、0.062±0.002、（4.211±0.211）×10–5，對照組分別為 3.499±0.113、0.062±0.001、（4.341±0.274）×10–5，比較差異均無統計學意義（t=0.013，P=0.991；t=0.042，P=0.969；t=0.653，P=0.549）。
3 討論
目前，深低溫冷凍處理是目前應用最廣泛且最有效的保存同種異體肌腱組織的方法[11]。深低溫冷凍處理過程中受多種因素影響，如被保存物體大小、冷凍速率、冷凍保護劑、冷凍保存時間等[12-15]，其中，冷凍保護劑是冷凍成敗的關鍵之一[12]。冷凍保護劑可分為滲透性和非滲透性兩類，目前多聯合使用兩種以上冷凍保護劑組成的保護液，以降低保護劑本身毒性，同時提高冷凍保護效率。本實驗選擇滲透性的 DMSO 和非滲透性的蔗糖加入 FBS 中作為冷凍保護劑，以達到更好的冷凍效果[10]。前期研究多將肌腱組織保存在液氮中 1 周左右，或者 2 周甚至更長，結果顯示肌腱組織免疫原性降低，但生物力學性能等方面無顯著變化[4, 16-17]。張發惠等[15]的研究將兔小腿肌腱給予不同冷凍時間處理，結果顯示冷凍儲存 360 d 組的肌腱破壞荷載和肌腱延伸率較對照組顯著下降，而其余低于 360 d 處理時間組與對照組比較均無明顯變化，提示短時間冷凍儲存不會影響肌腱組織力學性能。因此，本研究選擇于液氮中保存 7 d。
研究表明，深低溫冷凍技術用于保存椎間盤、皮膚等組織時，組織經深低溫冷凍后均有細胞存活[18-20]。本實驗中，兩組肌腱組織均檢測到有活性的肌腱細胞，但實驗組原代有核細胞成活率顯著低于對照組，提示深低溫冷凍處理過程中會造成部分細胞損傷死亡。但經過深低溫冷凍處理后，肌腱組織中仍有細胞存活，當肌腱組織植入機體內，存活的細胞會在肌腱組織的修復及愈合過程中發揮作用。結合研究結果分析，提示深低溫冷凍處理可用于保存肌腱組織，且冷凍后組織中有活性腱細胞。
學者們分別從大鼠﹑小鼠和人肌腱組織中成功分離 TDSCs，證實在多個物種肌腱組織中除肌腱細胞外，還存在一群具有克隆形成能力﹑自我更新以及多向分化潛能的MSCs群[6, 21]。成體干細胞在組織內以保持沉默態和處于激活態兩種方式并存，在維持組織平衡和參與組織損傷修復方面發揮作用[5]。在生理狀態細胞發生更替或肌腱組織遭受創傷正常愈合時，TDSCs 被激活，通過成肌腱分化定向分化為肌腱細胞，對自身特異性組織中已經分化的肌腱起到維持﹑再生和替代的作用[22]。這種 TDSCs 的分化將促進受損肌腱組織的愈合修復[5-9, 21-22]。鑒于 TDSCs 在肌腱組織損傷修復過程中的重要作用，有必要對其生物學特性等方面進行研究。
本課題組既往研究發現，將肌腱組織消化所得有核細胞以較低密度接種到培養皿后，干細胞增殖相對較快，在培養皿中呈克隆集落樣貼壁生長[6]。本實驗按此步驟將兩組肌腱組織消化所得的有核細胞進行相同條件培養后，均呈克隆樣生長，形成細胞簇，實驗組細胞克隆集落形成數少于對照組，表明冷凍過程中，肌腱組織消化所得有核細胞中有干性細胞的存在，但數目較正常肌腱組織減少。實驗組 TDSCs 占活性有核細胞比例較對照組降低，說明 TDSCs 在深低溫冷凍過程中易受損傷。
干細胞生長至第 1 代過程中，細胞中存在具有不同細胞形態及細胞表型的其他細胞，傳代至第 3 代時，細胞主要表現為均一的具有成纖維細胞特征的長梭形，高表達具有 MSCs 特性的表面標志物，具有克隆形成、體外增殖能力以及多向分化的能力[6]。因此，本實驗選擇第 3 代 TDSCs 進行相關實驗。細胞活力是檢測細胞生物學特性常用指標之一，Alamar Blue 對細胞無毒、無害，幾乎不干擾細胞正常代謝[23]，所我們利用 Alamar Blue 法比較兩組 TDSCs 相同條件培養 14 d 后的細胞活力。結果顯示，培養 14 d 內兩組細胞生長過程可分成 3 個時間段，與細胞正常生長過程相符合，即分為細胞生長滯留期、指數增殖期及平臺期 3 個時期。兩組各時間點 A 值比較差異無統計學意義，可見深低溫冷凍處理后的 TDSCs 細胞活力可恢復至正常水平。Annexin V-FITC/PI 雙染法結果顯示，兩組 TDSCs 早期凋亡率差異無統計學意義。細胞凋亡是為了維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主、有序的死亡，也是細胞生長、代謝、增殖能力指標之一。本實驗結果說明，經深低溫冷凍處理后的 TDSCs 生長過程中分裂增殖和代謝等能力可恢復至正常細胞水平。細胞遷移能力是細胞正常基本功能之一，是活細胞普遍存在的一種運動形式，也因細胞遷移獨有的運動特性，成為細胞生物學特性研究熱點之一。細胞遷移主要受細胞內肌動蛋白細胞骨架和其動力學性能及細胞外基質影響[24-25]。實驗組 TDSCs 遷移能力與對照組相似，且 TDSCs 合成胞內蛋白及細胞外基質能力均可達正常水平。TDSCs 作為 MSCs 的一個類型，除了表達表面標志 CD44 和 CD90 等外，還高表達肌腱相關性基因，主要有 Col1α1、Scx、Tnmd、巢蛋白等[6, 21, 26]。肌腱組織主要由大量富含膠原纖維的結締組織構成，Ⅰ 型膠原是膠原纖維主要成分，其中 Col1α1 是 Ⅰ 型膠原合成的第 1 鏈，故選擇 Col1α1 基因作為研究基質蛋白的目標基因。在胚胎發育過程中，Scx 是最早發現的 TDSCs 特異標志基因，Scx 基因敲除老鼠會出現嚴重的肌腱缺損，證實了在肌腱組織形成過程中 Scx 發揮著重要作用[27]。Tnmd 是 Ⅱ 型跨膜蛋白新的一員，常高表達于肌腱、韌帶和眼睛部位，低表達于胸腺、心臟和肝臟等組織中，Tnmd 基因敲除鼠的新生肌腱組織中增殖細胞嚴重減少，細胞密度減低，膠原纖維排列紊亂，由此可見 Tnmd 是肌腱組織發育過程中的重要標志，在肌腱細胞增殖和膠原纖維成熟中起重要調節作用[28-29]。因此，我們選擇檢測 Col1α1、Scx、Tnmd 基因相對表達量來代表細胞外基質合成與成肌腱分化轉錄基因的表達，結果實驗組以上指標與對照組無顯著差異。與 Brandau 等[30]研究認為深低溫冷凍處理后細胞 Tnmd mRNA 的高表達不同，本實驗組 Tnmd 的 mRNA 相對表達量較低，但兩組表達均低，無明顯差異，說明深低溫冷凍處理后的 TDSCs 其成肌腱分化能力可恢復至正常水平。
TDSCs 在肌腱損傷修復過程中起著重要作用，其可通過成肌腱定向分化為肌腱細胞，與肌腱細胞一起通過合成分泌膠原纖維，重塑肌腱纖維結構，以此維持肌腱的正常生理功能。同種異體肌腱組織經深低溫冷凍可以保存肌腱纖維結締組織，可提供一個良好的“膠原纖維支架”。本實驗成功從深低溫冷凍處理后的肌腱組織中提取 TDSCs，且與正常細胞相比生物學特性無顯著差異，仍能定向成肌腱分化為肌腱細胞，提示以原有纖維為支架，可能會更高效地促進肌腱組織損傷的愈合。然而，影響同種異體肌腱組織植入機體后發揮作用的因素很多，后續實驗需要研究冷凍同種異體肌腱組織應用于機體的免疫原性、組織學及生物力學的變化，以期為同種異體肌腱組織組織在肌腱缺損中的應用提供完整的理論依據。
