引用本文： 萬珊, 余希杰. microRNA-17-92 家簇對骨發育、骨重塑和骨代謝的調控作用. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(7): 870-875. doi: 10.7507/1002-1892.201701068 復制
骨細胞、成骨細胞、破骨細胞和軟骨細胞及其組成的復雜分子信號網絡精確調控骨骼的生長發育和重塑，該分子信號網絡失衡會造成骨骼先天發育異常出現畸形。骨質疏松癥是一種臨床最常見的代謝性骨病，各種原因引起骨代謝異常，進而導致骨強度下降和骨折風險增加。骨骼先天發育畸形和骨質疏松癥是由成骨和/或破骨功能異常和/或兩者之間的偶聯失衡所致。microRNA 是近年發現的、在轉錄后水平調控基因表達的新型 RNA 分子，其廣泛參與生物體的生命活動。microRNA-17-92 家簇是近來研究較多的 microRNA 家簇之一，其在骨骼生長發育、重塑以及成骨細胞分化成熟和骨代謝過程中發揮重要調控作用。現就 microRNA-17-92 家簇對骨骼系統的調控作用作一綜述。
1 microRNA-17-92 家簇的組成及其生理病理作用
1.1 microRNA-17-92 家簇基因結構概述
在人類基因組，microRNA-17-92 家簇是由位于 13q31.3、長約 7 000 bp 的氨基酸序列的 MIR17HG 基因所編碼[1]。MIR17HG 基因轉錄后形成 6 個串聯的頸環結構，經進一步加工、剪切最終形成 7 個成熟的 microRNA：miR-17（miR-17-5p）、miR-17（miR-17-3p）、miR-18a（miR-18a-5p）、miR-19a（miR-19a-3p）、miR-20a（miR-20a-5p）、miR-19b（miR-19b-3p）、miR-92a（miR-92a-3p），這些成熟的 microRNA 統稱為 microRNA-17-92 家簇。成熟 microRNA 在脊椎動物間高度保守，表明其在正常生命活動中不可或缺，但目前對其作用及機制尚未明確。
microRNA-17-92 家簇與其上游轉錄因子、下游靶蛋白組成錯綜復雜的信號網絡，該網絡精細調控 microRNA-17-92 家簇的時空表達特異性，從而對正常生命活動進行調控；相反，該分子網絡的失調則導致器官發育異常及腫瘤發生發展。已經證實的 microRNA-17-92 家簇的上游轉錄因子包括原癌基因（MYC、MYCN）、信號轉導和轉錄激活因子 3、轉錄因子（E2F1-3）等[2-3]，下游的靶基因涉及細胞周期調控、細胞增殖與凋亡、骨發育與骨重塑等的關鍵調節因子[4-5]。
1.2 microRNA-17-92 家簇在正常器官發育中的生理作用
microRNA-17-92 家簇參與生物體正常心臟、肺、淋巴系統、生殖系統等的發育，具體表現為以下方面：全身純合敲除 microRNA-17-92 家簇的小鼠胚胎不能正常發育存活。全身雜合敲除 microRNA-17-92 家簇的小鼠出現胚胎發育不良及圍產期死亡，肺發育不良及心臟室間隔缺損是其主要死亡原因[6]；microRNA-17-92 家簇可能通過靶向作用于 T 形盒子基因、細胞信號轉導分子（Smad6）、Heg1、Kruppel 樣因子 2、10 號染色體缺失的同源性磷酸酶-張力蛋白和連接蛋白（Connxin43）等調控心臟發育，靶向作用于視網膜母細胞瘤樣蛋白 2、信號轉導和轉錄激活因子 3 以及絲裂原活化蛋白激酶等調節肺的發育[7]。相反，在心臟、肺中特異性過表達 microRNA-17-92 家簇則導致小鼠出現心肺發育異常，生命周期縮短[8]。另外，研究發現 microRNA-17-92 家簇調節正常 B 淋巴細胞的發育，microRNA-17-92 家簇特異性缺失會導致 B 淋巴細胞分化發育障礙，過表達則導致淋巴增生性疾病[6, 9]，microRNA-17-92 家簇可能是作為核糖核酸內切酶 DICER 的下游靶基因來調節淋巴系統的發育。
上述研究結果表明，microRNA-17-92 家簇作為重要的調節因子廣泛參與生物體正常器官的發育、成熟。
1.3 microRNA-17-92 家簇在腫瘤發生發展轉移中的病理作用
近年來，有關 microRNA-17-92 家簇的研究主要集中于其在腫瘤發生發展中的作用。在胃癌、結腸癌、胰腺癌及前列腺癌等多種腫瘤組織中，microRNA-17-92 家簇呈高表達[10-12]，而在乳腺癌和卵巢癌中呈低表達[3, 13]，提示 microRNA-17-92 家簇可能在不同類型腫瘤中發揮相反的調節作用。另外，在多種人類腫瘤動物模型中均發現 microRNA-17-92 家簇的異位表達能夠促進或啟動腫瘤的發生發展。其可能機制主要包括以下方面：① microRNA-17-92 家簇直接作用于調控細胞周期和細胞增殖的轉錄因子，如細胞周期蛋白、細胞周期蛋白依靠性激酶抑制劑、10 號染色體缺失的同源性磷酸酶-張力蛋白、轉錄因子 E2F 家族、跨膜受體蛋白 2、跨膜受體蛋白配體以及 Delta 樣配體 1、3 等，使細胞有絲分裂障礙，細胞周期紊亂，導致細胞增殖異常而發生癌變[2-3, 14]。② miR-17、miR-20a、miR-92a 等可靶向抑制凋亡前體蛋白（Bcl2/Bim）的表達，減少凋亡蛋白的表達，進而抑制細胞的正常凋亡[15]。③ miR-18a/19a 特異性抑制腫瘤細胞中結締組織生長因子和連接組織生長因子的表達，通過旁分泌途徑調控腫瘤細胞附近內皮細胞功能，促進癌變組織血管生成，從而促進腫瘤發生發展和轉移[16]。
2 microRNA-17-92 家簇對骨發育的調控作用
2.1 臨床遺傳表型
近年來，越來越多研究表明 microRNA-17-92 家簇不僅在腫瘤的發生發展中發揮重要作用，其在骨骼系統的正常生長發育過程中亦具有重要調控作用。Feingold 綜合征是一種常染色體顯性遺傳病，大部分患者是由于 MYCN 基因突變或缺失所致；其特征是多發骨骼發育異常，包括手指（特別是第 2、5 指中節指骨短縮）畸形、腳趾畸形、體格矮小、顱面部畸形、小頭畸形及胃腸道閉鎖，部分患者存在不同程度的認知和學習障礙[17-20]；而 de Pontual 等[21]在 3 個家系中發現伴隨 microRNA-17-92 家簇的編碼基因 MIR17HG 單倍體缺失的患者亦表現為 Feingold 綜合征，為 Feingold 綜合征的基因診療提供了新的方向和思路。相反，Hemmat 等[22]在 1 個家系中發現，microRNA-17-92 家簇的微小重復突變導致骨骼發育延遲、身材矮小、中度大頭畸形、短肢畸形及顱面部異常。此外，Kannu 等[23]報道了更大拷貝的 microRNA-17-92 家簇的重復突變導致 A 型軸后多指（趾）畸形及過度生長，其表型與 Feingold 綜合征部分類似（短肢畸形及身材矮小），但也有相反之處（大頭畸形和過度生長）。進一步研究發現，microRNA-17-92 家簇靶向作用于 TGF-β 信號通路（調控骨骼發育最重要的信號通路）調節骨骼發育，且 miR-17/20a 可直接靶向結合 TGF-β 受體 Ⅱ，miR-18a 則是靶向作用于 TGF-β 的下游信號蛋白 Smad2 和 Smad4[24]。此外，microRNA-17-92 家簇還可間接與 Sonic Hedgehog（Shh）軸相互作用來調控骨骼生長發育[25-26]。
上述研究表明，microRNA-17-92 家簇在人類骨骼系統發育過程中發揮重要調控作用，且這種作用與該家簇的含量有著密切關系。不論該家簇的缺失或重復突變都會阻斷正常骨骼生長發育的通路，導致生長阻滯或過度生長，但其確切機制有待進一步研究。
2.2 動物實驗
動物實驗發現，microRNA-17-92 家簇純合缺失的小鼠胚胎不能正常發育成熟而出現圍產期死亡；對孕 18.5 d 的上述小鼠胚胎進一步研究發現，其存在廣泛的膜內成骨和軟骨內成骨延遲，表現出嚴重的骨骼發育畸形，包括小頭畸形、第 5 指中節指骨完全缺失、第 2 指中節指骨短縮、拇指發育不良以及頸椎和近端腕骨的異常融合[27]。另外，在 microRNA-17-92 家簇純合缺失的小鼠骨骼發育過程中廣泛存在同源轉化現象。例如，條件性敲除小鼠胸廓的最后一節椎體轉化為帶有浮肋的第 1 節腰椎椎體；單側或雙側的肋骨缺失以及最后一節腰椎轉變成為第 1 節骶椎；這種腰骶椎的同源轉化現象同樣存在于 46% 的 microRNA-17-92 家簇雜合敲除小鼠，提示 microRNA-17-92 家簇在小鼠中軸骨和四肢骨正常發育過程中發揮重要作用[27]，其主要通過靶向結合生長分化因子 11、同源盒基因家族（Hoxa5、Hoxa6、Hoxb4）調控中軸骨的發育，靶向結合 T 形盒子基因、BMP 調控四肢骨發育。另一方面，microRNA-17-92 家簇雜合敲除的小鼠由于肺發育不良和心臟室間隔缺損，出生后存活時間縮短，存活的小鼠表現出類似于人類 Feingold 綜合征的表型，表現為小頭畸形及第 5 指中節指骨的明顯縮短[21]。
隨后，Han 等[27]通過分別和聯合敲除 microRNA-17-92 家簇中的各個同源 microRNA 基因，發現各個組分分別具有不同功能。例如，4 個同源 microRNA 基因—miR-17 同源基因（miR-17、miR-20a）、miR-18 同源基因（miR-18a）、miR-19 同源基因（miR-19a、miR-19b-1）、miR-92 同源基因（miR-92a-1）分別純合敲除的小鼠體質量和第 5 指中節指骨長度均小于性別、年齡相匹配的對照小鼠，且在 miR-17 同源基因純合敲除的小鼠該表型最為明顯，另外 miR-17 同源基因純合敲除小鼠出現近端腕骨融合；miR-17 和 miR-18 同源基因聯合純合、雜合敲除小鼠體質量下降更顯著，表型比單純 miR-17 同源基因純合敲除更顯著；miR-17、miR18 以及 miR-92 同源基因聯合雜合敲除小鼠的體質量與 microRNA-17-92 家簇雜合敲除的小鼠體質量相似，miR-17、miR18 以及 miR-92 同源基因聯合純合敲除小鼠表現出與 microRNA-17-92 家簇純合缺失相同的表型。上述研究表明，miR-17 是骨骼生長發育的主要調節組分，miR-18 和 miR-92 具有協同調節作用。相反，Penzkofer 等[28]發現 miR-92a 基因敲除的小鼠出現明顯體質量下降、體長和顱骨長度縮短，micro-CT 掃描發現其存在第 5 掌骨和指骨的顯著縮短，后肢骨骼沒有改變，骨密度亦無明顯變化；進一步研究發現 miR-92a 主要作用于調節骨骼發育的靶基因——BMP-7、Smad7 和抑癌基因 p53 的同源基因 p63 來調控骨骼發育[29]。
上述動物實驗研究表明，microRNA-17-92 家簇對骨骼生長發育具有重要調節作用，且對不同部位、不同階段的骨骼發育 microRNA-17-92 家簇的不同成員可能發揮不同的調控作用。
3 microRNA-17-92 家簇對骨代謝的調節作用
3.1 臨床應用
近來，越來越多研究表明，循環 microRNA 可能不只是疾病早期診斷和預后判斷的生物標記，其還參與了生物體組織生理的調節。骨質疏松性骨折后短期循環中特異 microRNA 變化的水平以及這種相對于正常水平的變化可能會對骨代謝和骨折愈合過程造成重大影響。課題組前期研究收集絕經后骨質疏松患者的血液標本，檢測發現其血漿成骨代謝指標骨鈣素與 hsa-miR-20a、hsa-miR-19b 和 hsa-miR-19a 表達成正相關，血漿破骨代謝指標Ⅰ型膠原羧基末端肽與 hsa-miR-20a、hsa-miR-19b、hsa-miR-17、hsa-miR-19a 和 hsa-miR-18a 表達成正相關，提示血液中 microRNA-17-92 家簇的表達水平可能與成骨和破骨活動密切相關[30-31]。另外，絕經后骨質疏松患者骨組織中 microRNA-17-92 家簇呈低表達。
骨肉瘤的細胞病理基礎為成骨細胞的異常增殖和凋亡，研究表明，microRNA-17-92 家簇成員 miR-19a/20a 在骨肉瘤細胞系和骨肉瘤組織中呈高表達。另外，多數高表達 miR-19a 的骨肉瘤患者與低表達患者相比，其腫瘤體積更大、臨床分期更晚、遠處轉移率更高，整體壽命和無病生存期顯著縮短[32]。miR-19a 被認為是骨肉瘤患者整體壽命和無病生存期的獨立預測因子。進一步對其機制研究發現，高表達的 miR-19a 導致數個調控細胞分化的基因——反義導向分子、富含亮氨酸的重復蛋白 17，調控細胞周期的基因——人 G1/S 特異性周期蛋白 E1，以及調控細胞凋亡的基因——LIMA1、Ca2+/CaM 依賴性激酶 2 抑制子 1 在骨肉瘤細胞異常表達，直接影響骨肉瘤的發生發展。近年研究表明，miR-19a 調節腫瘤抑制基因——B 細胞異位基因 1、細胞周期蛋白、10 號染色體缺失的同源性磷酸酶-張力蛋白和 MAX 二聚化蛋白 1 等，加速骨肉瘤的發生發展[33-36]。
另外，值得注意的是，Huang 等[37]報道骨肉瘤肺轉移也與 microRNA-17-92 家簇的高表達密切相關。與非轉移性、高 Fas 表達的骨肉瘤細胞系 SAOS-2 相比，miR-19a/20a 在轉移性、低 Fas 表達的骨肉瘤細胞系 LM7 中表達水平較高。骨肉瘤肺轉移能力與骨肉瘤細胞膜 Fas 表達量成負相關，肺組織高表達 Fas 配體，Fas 表達量低的骨肉瘤細胞能夠避免 Fas 介導的細胞凋亡而存活；進一步研究發現，miR-20a 通過減少骨肉瘤細胞膜 Fas 的表達，導致骨肉瘤細胞的肺轉移能力增強。
綜上，miR-19a/20a 的異常表達在人類骨肉瘤的發生發展過程中起著重要調控作用。miR-19a/20a 有望成為骨肉瘤患者新的預后標志物。
3.2 動物研究
研究表明，在小鼠成骨干細胞中敲除 DICER 會阻礙其分化并導致胚胎死亡，相反在已分化的成骨細胞中敲除 DICER 則增加成年小鼠的骨量[38]，提示 microRNA-17-92 家簇可能在成骨細胞分化的不同階段（干細胞狀態及分化狀態）發揮不同的生理病理作用。小鼠顱蓋骨缺損術后 4 周，micro-CT 掃描顯示 DICER-/- 組小鼠顱蓋骨缺損部位的新骨形成受到抑制，表明調節 DICER 表達在骨組織修復、代謝中具有潛在應用價值。另外，與 Runx2+/+ 和 Runx2+/- 小鼠的胚胎相比，Runx2-/- 小鼠的胚胎 DICER 表達下降，小鼠完全缺乏礦化骨[39]。
Runt 相關轉錄因子 2（Runt-related transcriptionfactor 2，Runx2）是調控 MSCs 向成骨細胞分化的主要基因[40-42]。在成骨分化過程中，DICER 和 Runx2 表達同步增加。DICER 是 Runx2 的下游靶基因，Runx2 與其啟動子區域相結合發揮調控作用，DICER 裂解 microRNA-17-92 家簇的前體基因形成成熟 microRNA，后者靶向下調 Dickkopf 基因家族成員 DKK1 和促凋亡因子 BIM 的水平，從而導致 Wnt/β-catenin 信號通路的激活，促進成骨分化。
這些結果揭示了 Runx2/DICER/microRNA-17-92 家簇通路在成骨分化和骨重塑、代謝中的核心作用。
3.3 細胞水平
骨是一個由成骨細胞介導的骨形成和破骨細胞介導的骨吸收共同維持的一個處于動態平衡狀態的內分泌器官[43-45]。BMSCs 可以分化為成骨細胞和脂肪細胞，其向成骨、成脂分化基于其所在部位、激素及刺激因子 VEGF、BMP、TGF-β、Wnts、FGF、IGF、1，25-羥基維生素 D、甲狀旁腺激素、糖皮質激素、胰島素、瘦素等對特異轉錄因子的激活。
成骨分化是由信號通路及信號分子網絡精細調控的復雜過程，BMP-2/Smad5 信號通路在其中發揮重要作用。miR-17 負向調控 Smad5 的表達，從而抑制 C2C12 和 MC3T3-E1 細胞系的成骨分化，miR-17 和 Smad5 的相互作用在成骨細胞分化和骨代謝過程中發揮關鍵作用。
microRNA-17-92 家簇對骨代謝的調節主要是通過其對成骨細胞功能的調控來實現的。課題組前期研究發現，成骨細胞特異敲除 microRNA-17-92 家簇的小鼠骨量下降、皮質骨和松質骨骨密度減低、骨小梁數目顯著下降，成骨細胞增殖率下降、ALP活性降低、礦化能力減低[46-47]，成骨細胞內 Runx2 和Ⅰ型膠原的表達量亦明顯下調[48]；相反，破骨細胞 microRNA-17-92 家簇特異敲除的小鼠骨量及骨密度增加、破骨細胞功能減弱、成骨細胞功能增強[30-31]。骨組織高表達 miR-17（最高）、miR-20a 和 miR-92a，隨著成骨細胞的分化成熟，其表達進行性下降，成熟的成骨細胞中 miR-17、miR-20a 和 miR-92a 表達量最低。miR-17 直接作用于 BMP-2，下調成骨靶基因——轉錄共激活子、同源盒基因和 Runx2，上調成脂靶基因——轉錄因子 CCAAT/增強子結合蛋白 α 和過氧化物酶體增殖物激活受體 γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）來調節人類脂肪來源干細胞的成骨和成脂分化。另外，成骨分化伴隨著內源性 miR-20a 的表達增高。與此同時，成骨細胞標志物及調節子 BMP-2、BMP-4、Runx2、成骨細胞特異性轉錄因子、骨鈣素以及骨橋蛋白表達上調，而脂肪細胞標志物 PPARγ 和成骨細胞拮抗劑 Bambi、Crim1 表達下調。研究表明，miR-20a 直接結合特異性調節成骨細胞分化的、BMP/Runx2 信號通路的負性調節子 PPARγ（促進成脂分化抑制成骨分化）、Bambi 和 Crim1，發揮促進人 MSCs 向成骨細胞分化的作用[49]。
成熟的 microRNA-17-92 家簇成員靶向抑制 DKK1 激活 Wnt/β-catenin 信號通路，從而促進成骨分化，DKK1 主要通過抑制 Wnt 信號通路、成骨分化以及促凋亡因子 BIM 的水平維持骨代謝穩態。另外，成骨細胞特異性敲除 DICER 導致骨量增高。進一步研究發現，條件性敲除小鼠的骨膜組織中 microRNA-17-92 家簇的下游靶基因 Runx2 和骨膜蛋白表達水平顯著增加，表明 DICER/microRNA-17-92 家簇/Runx2、骨膜蛋白信號通路在骨代謝過程中發揮重要作用[39]。
本課題組研究發現破骨細胞中 miR-17、miR-19a（最高）高表達，研究表明 miR-17/20a 顯著下調 NF-κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL）的表達，阻斷 RANK/RANKL/骨保護素（osteoprotegerin，OPG）信號通路，從而抑制破骨細胞的形成及其骨吸收功能[50-51]。RANKL 是表達于人類成骨細胞和間充質細胞表面介導破骨細胞分化的重要調節因子，其與 RANK 相結合刺激破骨細胞形成維持骨穩態，RANKL 與 RANK 的結合受 OPG 的調控。
綜上，microRNA-17-92 家簇的不同成員作用于骨代謝過程中的不同細胞組分，通過復雜的信號通路發揮對骨代謝的調節作用。
4 展望
近年來，隨著對 microRNA-17-92 家簇的研究逐步深入，對于其對骨骼系統的生長發育、重塑及代謝的調節作用有了更清晰的認識，在一定程度上為先天性骨骼發育畸形以及代謝性骨病的早期診斷、靶向治療及預后判斷等方面提供了新的思路和方法，但仍需進一步深入研究。
骨細胞、成骨細胞、破骨細胞和軟骨細胞及其組成的復雜分子信號網絡精確調控骨骼的生長發育和重塑，該分子信號網絡失衡會造成骨骼先天發育異常出現畸形。骨質疏松癥是一種臨床最常見的代謝性骨病，各種原因引起骨代謝異常，進而導致骨強度下降和骨折風險增加。骨骼先天發育畸形和骨質疏松癥是由成骨和/或破骨功能異常和/或兩者之間的偶聯失衡所致。microRNA 是近年發現的、在轉錄后水平調控基因表達的新型 RNA 分子，其廣泛參與生物體的生命活動。microRNA-17-92 家簇是近來研究較多的 microRNA 家簇之一，其在骨骼生長發育、重塑以及成骨細胞分化成熟和骨代謝過程中發揮重要調控作用。現就 microRNA-17-92 家簇對骨骼系統的調控作用作一綜述。
1 microRNA-17-92 家簇的組成及其生理病理作用
1.1 microRNA-17-92 家簇基因結構概述
在人類基因組，microRNA-17-92 家簇是由位于 13q31.3、長約 7 000 bp 的氨基酸序列的 MIR17HG 基因所編碼[1]。MIR17HG 基因轉錄后形成 6 個串聯的頸環結構，經進一步加工、剪切最終形成 7 個成熟的 microRNA：miR-17（miR-17-5p）、miR-17（miR-17-3p）、miR-18a（miR-18a-5p）、miR-19a（miR-19a-3p）、miR-20a（miR-20a-5p）、miR-19b（miR-19b-3p）、miR-92a（miR-92a-3p），這些成熟的 microRNA 統稱為 microRNA-17-92 家簇。成熟 microRNA 在脊椎動物間高度保守，表明其在正常生命活動中不可或缺，但目前對其作用及機制尚未明確。
microRNA-17-92 家簇與其上游轉錄因子、下游靶蛋白組成錯綜復雜的信號網絡，該網絡精細調控 microRNA-17-92 家簇的時空表達特異性，從而對正常生命活動進行調控；相反，該分子網絡的失調則導致器官發育異常及腫瘤發生發展。已經證實的 microRNA-17-92 家簇的上游轉錄因子包括原癌基因（MYC、MYCN）、信號轉導和轉錄激活因子 3、轉錄因子（E2F1-3）等[2-3]，下游的靶基因涉及細胞周期調控、細胞增殖與凋亡、骨發育與骨重塑等的關鍵調節因子[4-5]。
1.2 microRNA-17-92 家簇在正常器官發育中的生理作用
microRNA-17-92 家簇參與生物體正常心臟、肺、淋巴系統、生殖系統等的發育，具體表現為以下方面：全身純合敲除 microRNA-17-92 家簇的小鼠胚胎不能正常發育存活。全身雜合敲除 microRNA-17-92 家簇的小鼠出現胚胎發育不良及圍產期死亡，肺發育不良及心臟室間隔缺損是其主要死亡原因[6]；microRNA-17-92 家簇可能通過靶向作用于 T 形盒子基因、細胞信號轉導分子（Smad6）、Heg1、Kruppel 樣因子 2、10 號染色體缺失的同源性磷酸酶-張力蛋白和連接蛋白（Connxin43）等調控心臟發育，靶向作用于視網膜母細胞瘤樣蛋白 2、信號轉導和轉錄激活因子 3 以及絲裂原活化蛋白激酶等調節肺的發育[7]。相反，在心臟、肺中特異性過表達 microRNA-17-92 家簇則導致小鼠出現心肺發育異常，生命周期縮短[8]。另外，研究發現 microRNA-17-92 家簇調節正常 B 淋巴細胞的發育，microRNA-17-92 家簇特異性缺失會導致 B 淋巴細胞分化發育障礙，過表達則導致淋巴增生性疾病[6, 9]，microRNA-17-92 家簇可能是作為核糖核酸內切酶 DICER 的下游靶基因來調節淋巴系統的發育。
上述研究結果表明，microRNA-17-92 家簇作為重要的調節因子廣泛參與生物體正常器官的發育、成熟。
1.3 microRNA-17-92 家簇在腫瘤發生發展轉移中的病理作用
近年來，有關 microRNA-17-92 家簇的研究主要集中于其在腫瘤發生發展中的作用。在胃癌、結腸癌、胰腺癌及前列腺癌等多種腫瘤組織中，microRNA-17-92 家簇呈高表達[10-12]，而在乳腺癌和卵巢癌中呈低表達[3, 13]，提示 microRNA-17-92 家簇可能在不同類型腫瘤中發揮相反的調節作用。另外，在多種人類腫瘤動物模型中均發現 microRNA-17-92 家簇的異位表達能夠促進或啟動腫瘤的發生發展。其可能機制主要包括以下方面：① microRNA-17-92 家簇直接作用于調控細胞周期和細胞增殖的轉錄因子，如細胞周期蛋白、細胞周期蛋白依靠性激酶抑制劑、10 號染色體缺失的同源性磷酸酶-張力蛋白、轉錄因子 E2F 家族、跨膜受體蛋白 2、跨膜受體蛋白配體以及 Delta 樣配體 1、3 等，使細胞有絲分裂障礙，細胞周期紊亂，導致細胞增殖異常而發生癌變[2-3, 14]。② miR-17、miR-20a、miR-92a 等可靶向抑制凋亡前體蛋白（Bcl2/Bim）的表達，減少凋亡蛋白的表達，進而抑制細胞的正常凋亡[15]。③ miR-18a/19a 特異性抑制腫瘤細胞中結締組織生長因子和連接組織生長因子的表達，通過旁分泌途徑調控腫瘤細胞附近內皮細胞功能，促進癌變組織血管生成，從而促進腫瘤發生發展和轉移[16]。
2 microRNA-17-92 家簇對骨發育的調控作用
2.1 臨床遺傳表型
近年來，越來越多研究表明 microRNA-17-92 家簇不僅在腫瘤的發生發展中發揮重要作用，其在骨骼系統的正常生長發育過程中亦具有重要調控作用。Feingold 綜合征是一種常染色體顯性遺傳病，大部分患者是由于 MYCN 基因突變或缺失所致；其特征是多發骨骼發育異常，包括手指（特別是第 2、5 指中節指骨短縮）畸形、腳趾畸形、體格矮小、顱面部畸形、小頭畸形及胃腸道閉鎖，部分患者存在不同程度的認知和學習障礙[17-20]；而 de Pontual 等[21]在 3 個家系中發現伴隨 microRNA-17-92 家簇的編碼基因 MIR17HG 單倍體缺失的患者亦表現為 Feingold 綜合征，為 Feingold 綜合征的基因診療提供了新的方向和思路。相反，Hemmat 等[22]在 1 個家系中發現，microRNA-17-92 家簇的微小重復突變導致骨骼發育延遲、身材矮小、中度大頭畸形、短肢畸形及顱面部異常。此外，Kannu 等[23]報道了更大拷貝的 microRNA-17-92 家簇的重復突變導致 A 型軸后多指（趾）畸形及過度生長，其表型與 Feingold 綜合征部分類似（短肢畸形及身材矮小），但也有相反之處（大頭畸形和過度生長）。進一步研究發現，microRNA-17-92 家簇靶向作用于 TGF-β 信號通路（調控骨骼發育最重要的信號通路）調節骨骼發育，且 miR-17/20a 可直接靶向結合 TGF-β 受體 Ⅱ，miR-18a 則是靶向作用于 TGF-β 的下游信號蛋白 Smad2 和 Smad4[24]。此外，microRNA-17-92 家簇還可間接與 Sonic Hedgehog（Shh）軸相互作用來調控骨骼生長發育[25-26]。
上述研究表明，microRNA-17-92 家簇在人類骨骼系統發育過程中發揮重要調控作用，且這種作用與該家簇的含量有著密切關系。不論該家簇的缺失或重復突變都會阻斷正常骨骼生長發育的通路，導致生長阻滯或過度生長，但其確切機制有待進一步研究。
2.2 動物實驗
動物實驗發現，microRNA-17-92 家簇純合缺失的小鼠胚胎不能正常發育成熟而出現圍產期死亡；對孕 18.5 d 的上述小鼠胚胎進一步研究發現，其存在廣泛的膜內成骨和軟骨內成骨延遲，表現出嚴重的骨骼發育畸形，包括小頭畸形、第 5 指中節指骨完全缺失、第 2 指中節指骨短縮、拇指發育不良以及頸椎和近端腕骨的異常融合[27]。另外，在 microRNA-17-92 家簇純合缺失的小鼠骨骼發育過程中廣泛存在同源轉化現象。例如，條件性敲除小鼠胸廓的最后一節椎體轉化為帶有浮肋的第 1 節腰椎椎體；單側或雙側的肋骨缺失以及最后一節腰椎轉變成為第 1 節骶椎；這種腰骶椎的同源轉化現象同樣存在于 46% 的 microRNA-17-92 家簇雜合敲除小鼠，提示 microRNA-17-92 家簇在小鼠中軸骨和四肢骨正常發育過程中發揮重要作用[27]，其主要通過靶向結合生長分化因子 11、同源盒基因家族（Hoxa5、Hoxa6、Hoxb4）調控中軸骨的發育，靶向結合 T 形盒子基因、BMP 調控四肢骨發育。另一方面，microRNA-17-92 家簇雜合敲除的小鼠由于肺發育不良和心臟室間隔缺損，出生后存活時間縮短，存活的小鼠表現出類似于人類 Feingold 綜合征的表型，表現為小頭畸形及第 5 指中節指骨的明顯縮短[21]。
隨后，Han 等[27]通過分別和聯合敲除 microRNA-17-92 家簇中的各個同源 microRNA 基因，發現各個組分分別具有不同功能。例如，4 個同源 microRNA 基因—miR-17 同源基因（miR-17、miR-20a）、miR-18 同源基因（miR-18a）、miR-19 同源基因（miR-19a、miR-19b-1）、miR-92 同源基因（miR-92a-1）分別純合敲除的小鼠體質量和第 5 指中節指骨長度均小于性別、年齡相匹配的對照小鼠，且在 miR-17 同源基因純合敲除的小鼠該表型最為明顯，另外 miR-17 同源基因純合敲除小鼠出現近端腕骨融合；miR-17 和 miR-18 同源基因聯合純合、雜合敲除小鼠體質量下降更顯著，表型比單純 miR-17 同源基因純合敲除更顯著；miR-17、miR18 以及 miR-92 同源基因聯合雜合敲除小鼠的體質量與 microRNA-17-92 家簇雜合敲除的小鼠體質量相似，miR-17、miR18 以及 miR-92 同源基因聯合純合敲除小鼠表現出與 microRNA-17-92 家簇純合缺失相同的表型。上述研究表明，miR-17 是骨骼生長發育的主要調節組分，miR-18 和 miR-92 具有協同調節作用。相反，Penzkofer 等[28]發現 miR-92a 基因敲除的小鼠出現明顯體質量下降、體長和顱骨長度縮短，micro-CT 掃描發現其存在第 5 掌骨和指骨的顯著縮短，后肢骨骼沒有改變，骨密度亦無明顯變化；進一步研究發現 miR-92a 主要作用于調節骨骼發育的靶基因——BMP-7、Smad7 和抑癌基因 p53 的同源基因 p63 來調控骨骼發育[29]。
上述動物實驗研究表明，microRNA-17-92 家簇對骨骼生長發育具有重要調節作用，且對不同部位、不同階段的骨骼發育 microRNA-17-92 家簇的不同成員可能發揮不同的調控作用。
3 microRNA-17-92 家簇對骨代謝的調節作用
3.1 臨床應用
近來，越來越多研究表明，循環 microRNA 可能不只是疾病早期診斷和預后判斷的生物標記，其還參與了生物體組織生理的調節。骨質疏松性骨折后短期循環中特異 microRNA 變化的水平以及這種相對于正常水平的變化可能會對骨代謝和骨折愈合過程造成重大影響。課題組前期研究收集絕經后骨質疏松患者的血液標本，檢測發現其血漿成骨代謝指標骨鈣素與 hsa-miR-20a、hsa-miR-19b 和 hsa-miR-19a 表達成正相關，血漿破骨代謝指標Ⅰ型膠原羧基末端肽與 hsa-miR-20a、hsa-miR-19b、hsa-miR-17、hsa-miR-19a 和 hsa-miR-18a 表達成正相關，提示血液中 microRNA-17-92 家簇的表達水平可能與成骨和破骨活動密切相關[30-31]。另外，絕經后骨質疏松患者骨組織中 microRNA-17-92 家簇呈低表達。
骨肉瘤的細胞病理基礎為成骨細胞的異常增殖和凋亡，研究表明，microRNA-17-92 家簇成員 miR-19a/20a 在骨肉瘤細胞系和骨肉瘤組織中呈高表達。另外，多數高表達 miR-19a 的骨肉瘤患者與低表達患者相比，其腫瘤體積更大、臨床分期更晚、遠處轉移率更高，整體壽命和無病生存期顯著縮短[32]。miR-19a 被認為是骨肉瘤患者整體壽命和無病生存期的獨立預測因子。進一步對其機制研究發現，高表達的 miR-19a 導致數個調控細胞分化的基因——反義導向分子、富含亮氨酸的重復蛋白 17，調控細胞周期的基因——人 G1/S 特異性周期蛋白 E1，以及調控細胞凋亡的基因——LIMA1、Ca2+/CaM 依賴性激酶 2 抑制子 1 在骨肉瘤細胞異常表達，直接影響骨肉瘤的發生發展。近年研究表明，miR-19a 調節腫瘤抑制基因——B 細胞異位基因 1、細胞周期蛋白、10 號染色體缺失的同源性磷酸酶-張力蛋白和 MAX 二聚化蛋白 1 等，加速骨肉瘤的發生發展[33-36]。
另外，值得注意的是，Huang 等[37]報道骨肉瘤肺轉移也與 microRNA-17-92 家簇的高表達密切相關。與非轉移性、高 Fas 表達的骨肉瘤細胞系 SAOS-2 相比，miR-19a/20a 在轉移性、低 Fas 表達的骨肉瘤細胞系 LM7 中表達水平較高。骨肉瘤肺轉移能力與骨肉瘤細胞膜 Fas 表達量成負相關，肺組織高表達 Fas 配體，Fas 表達量低的骨肉瘤細胞能夠避免 Fas 介導的細胞凋亡而存活；進一步研究發現，miR-20a 通過減少骨肉瘤細胞膜 Fas 的表達，導致骨肉瘤細胞的肺轉移能力增強。
綜上，miR-19a/20a 的異常表達在人類骨肉瘤的發生發展過程中起著重要調控作用。miR-19a/20a 有望成為骨肉瘤患者新的預后標志物。
3.2 動物研究
研究表明，在小鼠成骨干細胞中敲除 DICER 會阻礙其分化并導致胚胎死亡，相反在已分化的成骨細胞中敲除 DICER 則增加成年小鼠的骨量[38]，提示 microRNA-17-92 家簇可能在成骨細胞分化的不同階段（干細胞狀態及分化狀態）發揮不同的生理病理作用。小鼠顱蓋骨缺損術后 4 周，micro-CT 掃描顯示 DICER-/- 組小鼠顱蓋骨缺損部位的新骨形成受到抑制，表明調節 DICER 表達在骨組織修復、代謝中具有潛在應用價值。另外，與 Runx2+/+ 和 Runx2+/- 小鼠的胚胎相比，Runx2-/- 小鼠的胚胎 DICER 表達下降，小鼠完全缺乏礦化骨[39]。
Runt 相關轉錄因子 2（Runt-related transcriptionfactor 2，Runx2）是調控 MSCs 向成骨細胞分化的主要基因[40-42]。在成骨分化過程中，DICER 和 Runx2 表達同步增加。DICER 是 Runx2 的下游靶基因，Runx2 與其啟動子區域相結合發揮調控作用，DICER 裂解 microRNA-17-92 家簇的前體基因形成成熟 microRNA，后者靶向下調 Dickkopf 基因家族成員 DKK1 和促凋亡因子 BIM 的水平，從而導致 Wnt/β-catenin 信號通路的激活，促進成骨分化。
這些結果揭示了 Runx2/DICER/microRNA-17-92 家簇通路在成骨分化和骨重塑、代謝中的核心作用。
3.3 細胞水平
骨是一個由成骨細胞介導的骨形成和破骨細胞介導的骨吸收共同維持的一個處于動態平衡狀態的內分泌器官[43-45]。BMSCs 可以分化為成骨細胞和脂肪細胞，其向成骨、成脂分化基于其所在部位、激素及刺激因子 VEGF、BMP、TGF-β、Wnts、FGF、IGF、1，25-羥基維生素 D、甲狀旁腺激素、糖皮質激素、胰島素、瘦素等對特異轉錄因子的激活。
成骨分化是由信號通路及信號分子網絡精細調控的復雜過程，BMP-2/Smad5 信號通路在其中發揮重要作用。miR-17 負向調控 Smad5 的表達，從而抑制 C2C12 和 MC3T3-E1 細胞系的成骨分化，miR-17 和 Smad5 的相互作用在成骨細胞分化和骨代謝過程中發揮關鍵作用。
microRNA-17-92 家簇對骨代謝的調節主要是通過其對成骨細胞功能的調控來實現的。課題組前期研究發現，成骨細胞特異敲除 microRNA-17-92 家簇的小鼠骨量下降、皮質骨和松質骨骨密度減低、骨小梁數目顯著下降，成骨細胞增殖率下降、ALP活性降低、礦化能力減低[46-47]，成骨細胞內 Runx2 和Ⅰ型膠原的表達量亦明顯下調[48]；相反，破骨細胞 microRNA-17-92 家簇特異敲除的小鼠骨量及骨密度增加、破骨細胞功能減弱、成骨細胞功能增強[30-31]。骨組織高表達 miR-17（最高）、miR-20a 和 miR-92a，隨著成骨細胞的分化成熟，其表達進行性下降，成熟的成骨細胞中 miR-17、miR-20a 和 miR-92a 表達量最低。miR-17 直接作用于 BMP-2，下調成骨靶基因——轉錄共激活子、同源盒基因和 Runx2，上調成脂靶基因——轉錄因子 CCAAT/增強子結合蛋白 α 和過氧化物酶體增殖物激活受體 γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）來調節人類脂肪來源干細胞的成骨和成脂分化。另外，成骨分化伴隨著內源性 miR-20a 的表達增高。與此同時，成骨細胞標志物及調節子 BMP-2、BMP-4、Runx2、成骨細胞特異性轉錄因子、骨鈣素以及骨橋蛋白表達上調，而脂肪細胞標志物 PPARγ 和成骨細胞拮抗劑 Bambi、Crim1 表達下調。研究表明，miR-20a 直接結合特異性調節成骨細胞分化的、BMP/Runx2 信號通路的負性調節子 PPARγ（促進成脂分化抑制成骨分化）、Bambi 和 Crim1，發揮促進人 MSCs 向成骨細胞分化的作用[49]。
成熟的 microRNA-17-92 家簇成員靶向抑制 DKK1 激活 Wnt/β-catenin 信號通路，從而促進成骨分化，DKK1 主要通過抑制 Wnt 信號通路、成骨分化以及促凋亡因子 BIM 的水平維持骨代謝穩態。另外，成骨細胞特異性敲除 DICER 導致骨量增高。進一步研究發現，條件性敲除小鼠的骨膜組織中 microRNA-17-92 家簇的下游靶基因 Runx2 和骨膜蛋白表達水平顯著增加，表明 DICER/microRNA-17-92 家簇/Runx2、骨膜蛋白信號通路在骨代謝過程中發揮重要作用[39]。
本課題組研究發現破骨細胞中 miR-17、miR-19a（最高）高表達，研究表明 miR-17/20a 顯著下調 NF-κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL）的表達，阻斷 RANK/RANKL/骨保護素（osteoprotegerin，OPG）信號通路，從而抑制破骨細胞的形成及其骨吸收功能[50-51]。RANKL 是表達于人類成骨細胞和間充質細胞表面介導破骨細胞分化的重要調節因子，其與 RANK 相結合刺激破骨細胞形成維持骨穩態，RANKL 與 RANK 的結合受 OPG 的調控。
綜上，microRNA-17-92 家簇的不同成員作用于骨代謝過程中的不同細胞組分，通過復雜的信號通路發揮對骨代謝的調節作用。
4 展望
近年來，隨著對 microRNA-17-92 家簇的研究逐步深入，對于其對骨骼系統的生長發育、重塑及代謝的調節作用有了更清晰的認識，在一定程度上為先天性骨骼發育畸形以及代謝性骨病的早期診斷、靶向治療及預后判斷等方面提供了新的思路和方法，但仍需進一步深入研究。