引用本文： 桑江瑋, 王素雅, 張杰, 丁微, 羅靜聰. 豬小腸黏膜下層細胞外基質促進肝細胞活力和功能基因表達的研究. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(5): 607-613. doi: 10.7507/1002-1892.201702072 復制
肝臟持續損傷導致的肝硬化、肝癌、肝衰竭是臨床面臨的較大挑戰。肝移植是目前治療晚期肝功能衰竭較有效的治療手段，但存在肝源短缺、免疫排斥、費用昂貴等缺點[1]。肝細胞移植被證實在恢復肝臟功能、提高動物存活率等方面有明顯優勢，在肝臟疾病治療中有較好應用前景[2-3]。但肝細胞在培養過程中會出現去分化、特異功能缺失、活力降低等問題，限制了其進一步研究應用[4-5]。目前研究證實細胞外基質在促進肝細胞黏附增殖、維持細胞功能等方面具有巨大潛力[6-9]。豬小腸黏膜下層細胞外基質（porcine small intestinal submucosa extracellular matrix，PSISM）富含多種生物活性因子，具有良好的生物相容性，可以為細胞提供類似于天然組織的微環境，進而促進多種細胞的增殖和功能基因表達[10-13]。本研究將大鼠源性肝細胞分別接種于含 PSISM 的完全培養基及 PSISM 凝膠表面進行培養，觀察 PSISM 對肝細胞成活、增殖和相關基因表達的影響，為 PSISM 應用于肝臟組織工程提供初步理論依據。
1 材料與方法
1.1 主要材料與試劑、儀器
PSISM 由本課題組自制[13]。大鼠肝細胞系（BRL）購自賽齊（上海）生物工程有限公司，使用含 10%FBS 的 H-DMEM 培養基培養，當細胞融合達 80% 后消化、傳代，取 3～4 代細胞進行實驗。Ⅰ型鼠尾膠原原溶液（Advanced BioMatrix 公司，美國），按照說明書制備Ⅰ型膠原凝膠；操作步驟：取原溶液 450 μL，加入 1 mol/L NaOH 90 μL 調節 pH 值至 7，加入 PBS 緩沖液 60 μL，混合均勻，置于 37℃ 孵箱中 1 h，制備Ⅰ型膠原凝膠。
H-DMEM 培養基、FBS（GIBCO 公司，美國）；鈣黃綠素、碘化丙啶（Sigma 公司，美國）；細胞增殖-毒性檢測試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8；DOJINDO 公司，美國）；Trizol（Invitrogen 公司，美國）；GoScriptTM 逆轉錄酶系統（Promega 公司，美國）、GoTaq? 高效熒光定量 PCR 試劑盒（GoTaq? qPCR Master Mix；Promega 公司，美國）。
CO2 細胞培養箱（SANYO 公司，日本）；光學顯微鏡（Nikon 公司，日本）；熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）；酶標儀（Leica 公司，德國）；臺式高速離心機（Hettch 公司，德國）；電泳儀、凝膠成像分析系統、DNA Engine PCR 儀（Bio-Rad 公司，美國）；LightCycler? 96 PCR 儀（Roche 公司，瑞士）。
1.2 實驗分組及方法
實驗分為兩部分。① 取 PSISM 添加至含 10%FBS 的 H-DMEM 培養基，制備終濃度為 50、100、200 μg/mL 的 PSISM 培養基。將 BRL 細胞分別置于以上濃度 PSISM 培養基進行培養（A1、B1、C1 組），以單純 H-DMEM 培養基培養作為對照（D1 組）。② 取 PSISM 溶解于含 0.1 mol/L NaOH 的 PBS 無菌溶液中，調整溶液濃度為 1%、2%、3% 以及 pH 值至 7，混合均勻后成預凝膠態，平鋪于孔板，37℃ 孵育 1 h 成膠。將 BRL 細胞分別接種于以上濃度 PSISM 凝膠進行培養（A2、B2、C2 組），以與鼠尾Ⅰ型膠原凝膠培養作為對照（D2 組）。
1.3 觀測指標
1.3.1 Live/Dead 熒光染色觀察 取 BRL 細胞以 2×104 個/孔密度接種于 24 孔板，按照 1.2 方法進行分組培養，每孔平鋪 100 μL PSISM 凝膠或加入 1 mL PSISM 培養基。于培養后第 1、3、5 天行 Live/Dead 熒光染色。染色步驟如下：吸棄培養基，PBS 清洗，加入熒光染料試劑（每 1 毫升 PBS 溶液加入 1 mmol/L 鈣黃綠素、1 mmol/L 碘化丙啶），37℃ 孵箱中避光孵育 20 min，吸棄表面染液，PBS 清洗 2 次，熒光顯微鏡下觀察，綠色熒光標示活細胞，紅色熒光標示死細胞。
1.3.2 細胞活力檢測 取 BRL 細胞以 1×103 個/孔密度接種于 96 孔板，按照 1.2 方法進行分組培養，每孔平鋪 40 μL PSISM 凝膠或加入 150 μL PSISM 培養基。于培養后第 1、3、5 天，吸棄培養基，每孔加入含 10% CCK-8 檢測液的培養基，37℃ 孵育 2 h，每孔吸出等量培養基轉至空白孔板，用酶標儀在波長 450 nm 處測定吸光度（A）值。
1.3.3 實時熒光定量 PCR 檢測 采用實時熒光定量 PCR 檢測肝細胞特異基因白蛋白（albumin，ALB）、細胞角蛋白 18（cytokeratin 18，CK18）和甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）的表達。取BRL細胞以 2×105 個/孔密度接種于 12 孔板，按照 1.2 方法進行分組培養，每孔平鋪 200 μL PSISM 凝膠或加入 1.5 mL PSISM 培養基。于培養后第 5 天，采用 Trizol 法提取細胞 RNA，制備 1% 瓊脂糖凝膠，RNA 樣品與上樣緩沖液預混后上樣，在 110 V 電壓下電泳 10 min，觀察核酸分子條帶完整性。將 RNA 逆轉錄合成 cDNA，RT 反應體系 20 μL，反應條件：25℃、5 min，42℃、15 min，70℃、15 min，4℃ 冷卻，cDNA 置于 –20℃ 備用。使用 Primer Premier 5.0 設計 PCR 引物序列，由上海生工生物工程股份有限公司合成，見表 1。qPCR 反應體系 20 μL：上游引物 0.4 μL、下游引物 0.4 μL、GoTaq? qPCR Master Mix 2× 10 μL、cDNA 2 μL、無酶水 7.2 μL。反應條件：CK18：95℃、120 s，95℃、10 s，60℃、10 s，72℃、10 s，45 個循環；95℃、10 s，65℃、60 s，97℃、1 s；ALB、AFP：95℃、120 s；95℃、10 s，59℃、10 s，72℃、10 s，45 個循環；95℃、10 s，65℃、60 s，97℃、1 s。以 GAPDH 作為參照。使用 LightCycler96 分析軟件采用 2–ΔΔCt 法計算目的基因相對表達量。
表1
實時熒光定量 PCR 引物序列
Table1.
Primer sequence for RT-qPCR
1.4 統計學方法
采用 SPSS16.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 Live/Dead 熒光染色觀察
熒光顯微鏡下觀察，各組細胞情況一致。各組 BRL 細胞形態多樣，呈圓形、橢圓形、多邊形等，均邊界清晰，活力良好；且隨培養時間延長，細胞增加，少見死細胞。見圖 1、2。
圖1
PSISM 培養基培養后各組細胞 Live/Dead 熒光染色觀察（×200） 從左至右分別為培養第 1、3、5 天 a. A1 組；b. B1 組；c. C1 組；d. D1 組
Figure1.
Live/Dead staining observation of cells in each group after cultured with PSISM-medium (×200) From left to right for at 1, 3, and 5 days after culture, respectively a. Group A1; b. Group B1; c. Group C1; d. Group D1
圖2
PSISM 凝膠培養后各組細胞 Live/Dead 熒光染色觀察（×200） 從左至右分別為培養第 1、3、5 天 a. A2 組；b. B2 組；c. C2 組；d. D2 組
Figure2.
Live/Dead staining observation in each group after cultured with PSISM hydrogel (×200) From left to right for at 1, 3, and 5 days after culture, respectively a. Group A2; b. Group B2; c. Group C2; d. Group D2
2.2 細胞活力檢測
2.2.1 PSISM 培養基培養 第 1、3 天，各組A 值比較差異均無統計學意義（P>0.05）。第 5 天，除 C1 組A 值顯著高于 D1 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）外，其余各組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 3a。
圖3
培養各時間點細胞活力檢測 a. PSISM 培養基培養；b. PSISM 凝膠培養
Figure3.
The cell viability at each time point after culture a. Cells cultured with PSISM-medium; b. Cells cultured on PSISM hydrogel
2.2.2 PSISM 凝膠培養 第 1 天，各組A 值比較差異均無統計學意義（P>0.05）。第 3 天，D2 組A 值顯著低于 A2、B2、C2 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A2、B2、C2 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。第 5 天，D2 組A 值顯著低于 A2、B2、C2 組，B2、C2 組顯著低于 A2 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；B2、C2 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 3b。
2.3 實時熒光定量PCR檢測
2.3.1 PSISM 培養基培養 ALB：D1 組 ALB 基因相對表達量較 A1、B1、C1 組顯著降低，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A1、B1、C1 組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。CK18：D1 組 CK18 基因相對表達量較 A1、B1、C1 組顯著降低，C1 組較 A1、B1 組顯著降低，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A1、B1 組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。AFP：D1 組 AFP 基因相對表達量顯著高于 A1、B1、C1 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A1、B1、C1 組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 4a。
圖4
實時熒光定量 PCR 檢測各組肝細胞特異基因表達 a. PSISM 培養基培養；b. PSISM 凝膠培養
Figure4.
Expression of hepatocyte genes in each group by RT-qPCR a. Cells cultured with PSISM-medium; b. Cells cultured on PSISM hydrogel
2.3.2 PSISM 凝膠培養 ALB：D2 組 ALB 基因相對表達量較 A2、B2、C2 組顯著降低，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A2、B2、C2 組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。CK18：D2 組 CK18 基因相對表達量較 A2、B2、C2 組顯著降低，A2 組顯著高于 B2 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；B2、C2 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。AFP：D2 組 AFP 基因相對表達量顯著高于 A2、B2、C2 組，C2 組顯著高于 A2 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；B2、C2 組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 4b。
3 討論
肝細胞體外培養往往伴隨著細胞活力和特異功能的消失，為解決這一問題，大量研究利用具有生物活性的細胞外基質作為培養基添加物或細胞生長增殖的支架材料進行細胞培養[5-9]。目前，有關 PSISM 對肝細胞的調控作用罕見報道。本研究旨在觀察不同濃度 PSISM 培養基和 PSISM 凝膠對肝細胞活力和功能的影響。
我們利用 Live/Dead 熒光染色和 CCK-8 技術檢測了肝細胞的活力和增殖[14-15]。結果表明：各組細胞活力及增殖良好，隨著培養時間延長，細胞數量增加。有研究報道，不同的細胞外基質成分對肝細胞增殖和功能表達的作用也不同，如纖連蛋白能更好地促進細胞增殖和特異基因的表達[16-17]。使用 PSISM 培養基培養后，第 5 天時 C1 組細胞增殖明顯優于其他各組，其中與D1組比較差異有統計學意義，分析原因可能是 PSISM 濃度越高，所含纖連蛋白成分也越多，能夠更好的促進 DNA 合成。而使用 PSISM 凝膠培養后，A2、B2、C2 組細胞增殖在第 3 天和第 5 天均顯著高于 D2 組，這可能也與 PSISM 凝膠中含有纖連蛋白有關；而且，第 5 天時 A2 組 PSISM 凝膠對細胞增殖的促進作用優于 B2、C2 組，分析原因為凝膠依靠水解和酶解作用釋放內部的生物活性因子是一個持續且穩定的過程[13]，PSISM 凝膠濃度越高，細胞外基質成分越致密，其降解較慢，短時間內釋放出活性蛋白較少所致。Wang 等[18]的研究發現，細胞外基質蛋白，如膠原蛋白、纖連蛋白等，能夠促進細胞特異基因和功能基因的表達。本實驗發現無論是 PSISM 培養基培養（A1、B1、C1 組），還是 PSISM 凝膠培養（A2、B2、C2 組），相比于對照組（D1、D2 組），均能促進肝細胞功能基因 ALB 和 CK18 的表達，與 Wang 等[18]的研究結論一致。AFP 是幼稚肝細胞的標志物，在肝細胞趨于成熟時其表達量降低[19]；同時也是一種腫瘤標志物，肝細胞受損時 AFP 含量增加[20]。本研究實時熒光定量 PCR 檢測顯示 D1、D2 組 AFP 基因相對表達量顯著高于對應實驗組，PSISM 的使用降低了 AFP 的表達，說明 PSISM 促進了肝細胞成熟，對肝細胞有一定保護作用。
本研究結果表明 PSISM 可促進肝細胞的增殖、成熟和特異基因表達，為 PSISM 應用于肝臟組織工程及肝病治療提供了實驗依據。但本研究仍存在一定缺陷。首先，實驗采用大鼠來源肝細胞系（BRL），其與正常肝實質細胞有一定差異；其次，僅在基因水平檢測了 PSISM 對肝細胞的影響，未對其相應蛋白表達進行檢測。下一步我們將利用 Western blot、ELISA、免疫熒光等技術對相應基因蛋白水平表達進行探討，并通過體內研究進一步明確 PSISM 對肝細胞的調控。
肝臟持續損傷導致的肝硬化、肝癌、肝衰竭是臨床面臨的較大挑戰。肝移植是目前治療晚期肝功能衰竭較有效的治療手段，但存在肝源短缺、免疫排斥、費用昂貴等缺點[1]。肝細胞移植被證實在恢復肝臟功能、提高動物存活率等方面有明顯優勢，在肝臟疾病治療中有較好應用前景[2-3]。但肝細胞在培養過程中會出現去分化、特異功能缺失、活力降低等問題，限制了其進一步研究應用[4-5]。目前研究證實細胞外基質在促進肝細胞黏附增殖、維持細胞功能等方面具有巨大潛力[6-9]。豬小腸黏膜下層細胞外基質（porcine small intestinal submucosa extracellular matrix，PSISM）富含多種生物活性因子，具有良好的生物相容性，可以為細胞提供類似于天然組織的微環境，進而促進多種細胞的增殖和功能基因表達[10-13]。本研究將大鼠源性肝細胞分別接種于含 PSISM 的完全培養基及 PSISM 凝膠表面進行培養，觀察 PSISM 對肝細胞成活、增殖和相關基因表達的影響，為 PSISM 應用于肝臟組織工程提供初步理論依據。
1 材料與方法
1.1 主要材料與試劑、儀器
PSISM 由本課題組自制[13]。大鼠肝細胞系（BRL）購自賽齊（上海）生物工程有限公司，使用含 10%FBS 的 H-DMEM 培養基培養，當細胞融合達 80% 后消化、傳代，取 3～4 代細胞進行實驗。Ⅰ型鼠尾膠原原溶液（Advanced BioMatrix 公司，美國），按照說明書制備Ⅰ型膠原凝膠；操作步驟：取原溶液 450 μL，加入 1 mol/L NaOH 90 μL 調節 pH 值至 7，加入 PBS 緩沖液 60 μL，混合均勻，置于 37℃ 孵箱中 1 h，制備Ⅰ型膠原凝膠。
H-DMEM 培養基、FBS（GIBCO 公司，美國）；鈣黃綠素、碘化丙啶（Sigma 公司，美國）；細胞增殖-毒性檢測試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8；DOJINDO 公司，美國）；Trizol（Invitrogen 公司，美國）；GoScriptTM 逆轉錄酶系統（Promega 公司，美國）、GoTaq? 高效熒光定量 PCR 試劑盒（GoTaq? qPCR Master Mix；Promega 公司，美國）。
CO2 細胞培養箱（SANYO 公司，日本）；光學顯微鏡（Nikon 公司，日本）；熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）；酶標儀（Leica 公司，德國）；臺式高速離心機（Hettch 公司，德國）；電泳儀、凝膠成像分析系統、DNA Engine PCR 儀（Bio-Rad 公司，美國）；LightCycler? 96 PCR 儀（Roche 公司，瑞士）。
1.2 實驗分組及方法
實驗分為兩部分。① 取 PSISM 添加至含 10%FBS 的 H-DMEM 培養基，制備終濃度為 50、100、200 μg/mL 的 PSISM 培養基。將 BRL 細胞分別置于以上濃度 PSISM 培養基進行培養（A1、B1、C1 組），以單純 H-DMEM 培養基培養作為對照（D1 組）。② 取 PSISM 溶解于含 0.1 mol/L NaOH 的 PBS 無菌溶液中，調整溶液濃度為 1%、2%、3% 以及 pH 值至 7，混合均勻后成預凝膠態，平鋪于孔板，37℃ 孵育 1 h 成膠。將 BRL 細胞分別接種于以上濃度 PSISM 凝膠進行培養（A2、B2、C2 組），以與鼠尾Ⅰ型膠原凝膠培養作為對照（D2 組）。
1.3 觀測指標
1.3.1 Live/Dead 熒光染色觀察 取 BRL 細胞以 2×104 個/孔密度接種于 24 孔板，按照 1.2 方法進行分組培養，每孔平鋪 100 μL PSISM 凝膠或加入 1 mL PSISM 培養基。于培養后第 1、3、5 天行 Live/Dead 熒光染色。染色步驟如下：吸棄培養基，PBS 清洗，加入熒光染料試劑（每 1 毫升 PBS 溶液加入 1 mmol/L 鈣黃綠素、1 mmol/L 碘化丙啶），37℃ 孵箱中避光孵育 20 min，吸棄表面染液，PBS 清洗 2 次，熒光顯微鏡下觀察，綠色熒光標示活細胞，紅色熒光標示死細胞。
1.3.2 細胞活力檢測 取 BRL 細胞以 1×103 個/孔密度接種于 96 孔板，按照 1.2 方法進行分組培養，每孔平鋪 40 μL PSISM 凝膠或加入 150 μL PSISM 培養基。于培養后第 1、3、5 天，吸棄培養基，每孔加入含 10% CCK-8 檢測液的培養基，37℃ 孵育 2 h，每孔吸出等量培養基轉至空白孔板，用酶標儀在波長 450 nm 處測定吸光度（A）值。
1.3.3 實時熒光定量 PCR 檢測 采用實時熒光定量 PCR 檢測肝細胞特異基因白蛋白（albumin，ALB）、細胞角蛋白 18（cytokeratin 18，CK18）和甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）的表達。取BRL細胞以 2×105 個/孔密度接種于 12 孔板，按照 1.2 方法進行分組培養，每孔平鋪 200 μL PSISM 凝膠或加入 1.5 mL PSISM 培養基。于培養后第 5 天，采用 Trizol 法提取細胞 RNA，制備 1% 瓊脂糖凝膠，RNA 樣品與上樣緩沖液預混后上樣，在 110 V 電壓下電泳 10 min，觀察核酸分子條帶完整性。將 RNA 逆轉錄合成 cDNA，RT 反應體系 20 μL，反應條件：25℃、5 min，42℃、15 min，70℃、15 min，4℃ 冷卻，cDNA 置于 –20℃ 備用。使用 Primer Premier 5.0 設計 PCR 引物序列，由上海生工生物工程股份有限公司合成，見表 1。qPCR 反應體系 20 μL：上游引物 0.4 μL、下游引物 0.4 μL、GoTaq? qPCR Master Mix 2× 10 μL、cDNA 2 μL、無酶水 7.2 μL。反應條件：CK18：95℃、120 s，95℃、10 s，60℃、10 s，72℃、10 s，45 個循環；95℃、10 s，65℃、60 s，97℃、1 s；ALB、AFP：95℃、120 s；95℃、10 s，59℃、10 s，72℃、10 s，45 個循環；95℃、10 s，65℃、60 s，97℃、1 s。以 GAPDH 作為參照。使用 LightCycler96 分析軟件采用 2–ΔΔCt 法計算目的基因相對表達量。
表1
實時熒光定量 PCR 引物序列
Table1.
Primer sequence for RT-qPCR
1.4 統計學方法
采用 SPSS16.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 Live/Dead 熒光染色觀察
熒光顯微鏡下觀察，各組細胞情況一致。各組 BRL 細胞形態多樣，呈圓形、橢圓形、多邊形等，均邊界清晰，活力良好；且隨培養時間延長，細胞增加，少見死細胞。見圖 1、2。
圖1
PSISM 培養基培養后各組細胞 Live/Dead 熒光染色觀察（×200） 從左至右分別為培養第 1、3、5 天 a. A1 組；b. B1 組；c. C1 組；d. D1 組
Figure1.
Live/Dead staining observation of cells in each group after cultured with PSISM-medium (×200) From left to right for at 1, 3, and 5 days after culture, respectively a. Group A1; b. Group B1; c. Group C1; d. Group D1
圖2
PSISM 凝膠培養后各組細胞 Live/Dead 熒光染色觀察（×200） 從左至右分別為培養第 1、3、5 天 a. A2 組；b. B2 組；c. C2 組；d. D2 組
Figure2.
Live/Dead staining observation in each group after cultured with PSISM hydrogel (×200) From left to right for at 1, 3, and 5 days after culture, respectively a. Group A2; b. Group B2; c. Group C2; d. Group D2
2.2 細胞活力檢測
2.2.1 PSISM 培養基培養 第 1、3 天，各組A 值比較差異均無統計學意義（P>0.05）。第 5 天，除 C1 組A 值顯著高于 D1 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）外，其余各組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 3a。
圖3
培養各時間點細胞活力檢測 a. PSISM 培養基培養；b. PSISM 凝膠培養
Figure3.
The cell viability at each time point after culture a. Cells cultured with PSISM-medium; b. Cells cultured on PSISM hydrogel
2.2.2 PSISM 凝膠培養 第 1 天，各組A 值比較差異均無統計學意義（P>0.05）。第 3 天，D2 組A 值顯著低于 A2、B2、C2 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A2、B2、C2 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。第 5 天，D2 組A 值顯著低于 A2、B2、C2 組，B2、C2 組顯著低于 A2 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；B2、C2 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 3b。
2.3 實時熒光定量PCR檢測
2.3.1 PSISM 培養基培養 ALB：D1 組 ALB 基因相對表達量較 A1、B1、C1 組顯著降低，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A1、B1、C1 組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。CK18：D1 組 CK18 基因相對表達量較 A1、B1、C1 組顯著降低，C1 組較 A1、B1 組顯著降低，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A1、B1 組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。AFP：D1 組 AFP 基因相對表達量顯著高于 A1、B1、C1 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A1、B1、C1 組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 4a。
圖4
實時熒光定量 PCR 檢測各組肝細胞特異基因表達 a. PSISM 培養基培養；b. PSISM 凝膠培養
Figure4.
Expression of hepatocyte genes in each group by RT-qPCR a. Cells cultured with PSISM-medium; b. Cells cultured on PSISM hydrogel
2.3.2 PSISM 凝膠培養 ALB：D2 組 ALB 基因相對表達量較 A2、B2、C2 組顯著降低，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A2、B2、C2 組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。CK18：D2 組 CK18 基因相對表達量較 A2、B2、C2 組顯著降低，A2 組顯著高于 B2 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；B2、C2 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。AFP：D2 組 AFP 基因相對表達量顯著高于 A2、B2、C2 組，C2 組顯著高于 A2 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；B2、C2 組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 4b。
3 討論
肝細胞體外培養往往伴隨著細胞活力和特異功能的消失，為解決這一問題，大量研究利用具有生物活性的細胞外基質作為培養基添加物或細胞生長增殖的支架材料進行細胞培養[5-9]。目前，有關 PSISM 對肝細胞的調控作用罕見報道。本研究旨在觀察不同濃度 PSISM 培養基和 PSISM 凝膠對肝細胞活力和功能的影響。
我們利用 Live/Dead 熒光染色和 CCK-8 技術檢測了肝細胞的活力和增殖[14-15]。結果表明：各組細胞活力及增殖良好，隨著培養時間延長，細胞數量增加。有研究報道，不同的細胞外基質成分對肝細胞增殖和功能表達的作用也不同，如纖連蛋白能更好地促進細胞增殖和特異基因的表達[16-17]。使用 PSISM 培養基培養后，第 5 天時 C1 組細胞增殖明顯優于其他各組，其中與D1組比較差異有統計學意義，分析原因可能是 PSISM 濃度越高，所含纖連蛋白成分也越多，能夠更好的促進 DNA 合成。而使用 PSISM 凝膠培養后，A2、B2、C2 組細胞增殖在第 3 天和第 5 天均顯著高于 D2 組，這可能也與 PSISM 凝膠中含有纖連蛋白有關；而且，第 5 天時 A2 組 PSISM 凝膠對細胞增殖的促進作用優于 B2、C2 組，分析原因為凝膠依靠水解和酶解作用釋放內部的生物活性因子是一個持續且穩定的過程[13]，PSISM 凝膠濃度越高，細胞外基質成分越致密，其降解較慢，短時間內釋放出活性蛋白較少所致。Wang 等[18]的研究發現，細胞外基質蛋白，如膠原蛋白、纖連蛋白等，能夠促進細胞特異基因和功能基因的表達。本實驗發現無論是 PSISM 培養基培養（A1、B1、C1 組），還是 PSISM 凝膠培養（A2、B2、C2 組），相比于對照組（D1、D2 組），均能促進肝細胞功能基因 ALB 和 CK18 的表達，與 Wang 等[18]的研究結論一致。AFP 是幼稚肝細胞的標志物，在肝細胞趨于成熟時其表達量降低[19]；同時也是一種腫瘤標志物，肝細胞受損時 AFP 含量增加[20]。本研究實時熒光定量 PCR 檢測顯示 D1、D2 組 AFP 基因相對表達量顯著高于對應實驗組，PSISM 的使用降低了 AFP 的表達，說明 PSISM 促進了肝細胞成熟，對肝細胞有一定保護作用。
本研究結果表明 PSISM 可促進肝細胞的增殖、成熟和特異基因表達，為 PSISM 應用于肝臟組織工程及肝病治療提供了實驗依據。但本研究仍存在一定缺陷。首先，實驗采用大鼠來源肝細胞系（BRL），其與正常肝實質細胞有一定差異；其次，僅在基因水平檢測了 PSISM 對肝細胞的影響，未對其相應蛋白表達進行檢測。下一步我們將利用 Western blot、ELISA、免疫熒光等技術對相應基因蛋白水平表達進行探討，并通過體內研究進一步明確 PSISM 對肝細胞的調控。
