引用本文： 張金麗, 劉志河, 湯文彬, 熊喜峰, 張志, 曹雯娟, 李孝建. 大鼠脂肪來源干細胞對紫外線造成的軟骨細胞 DNA 損傷的修復作用研究. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(5): 600-606. doi: 10.7507/1002-1892.201610106 復制
各種原因造成的射線輻射是促使機體老化衰退的重要原因，照射生物體時可直接破壞機體內某些大分子結構，如使 DNA 分子鏈斷裂、與細胞生長相關的一些蛋白質和酶發生變性及破壞，從而引起細胞凋亡和機體老化。DNA 雙鏈斷裂（DNA double-strand breaks，DSBs）是 DNA 損傷中最嚴重的形式，若未能修復可致細胞死亡。DNA 發生損傷時，細胞會立即做出系列的 DNA 損傷應答反應（DNA damage response，DDR），其中組蛋白 2A 變異體（histone family 2A variant，H2AX）的磷酸化是激活 DDR 反應通路中的關鍵蛋白，是感應 DNA 損傷的標志蛋白。采用特異性抗體檢測磷酸化 H2AX（phosphorylated H2AX，γH2AX）是檢測 DSBs 的常用方法。研究表明，脂肪來源干細胞（adipose- derived stem cells，ADSCs）可通過旁分泌生長因子和直接參與方式促進血管生成及組織再生[1]，但關于 ADSCs 對射線輻射造成細胞損傷的修復作用研究較少。因此，本研究以紫外線照射軟骨細胞作為細胞損傷模型，觀察大鼠 ADSCs 對紫外線輻射造成的軟骨細胞損傷的修復作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
3～4 周齡健康 SD 大鼠 5 只，雌雄不限，體質量 100～120 g，購于廣東省實驗動物中心。
DMEM/F12 培養基、L-DMEM 培養基、FBS、胰蛋白酶、Ⅰ 型膠原酶、Ⅱ 型膠原酶、青鏈霉素（Life Technology 公司，美國）；CellTiter 96? A Queous 單溶液細胞增殖檢測試劑盒（Promega 公司，美國）；兔單克隆抗體 γH2AX 和 β-actin（Cell Signaling 公司，美國）；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素、吲哚美辛、維生素 C、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、茜素紅、油紅 O（Sigma 公司，美國）。Transwell 小室（Millipore 公司，美國）；紫外線交聯儀（Spec-tronics 公司，美國）；化學發光凝膠成像系統（Bio-Rad 公司，美國）；熒光顯微鏡（ZEISS 公司，德國）；CO2 培養箱（Thermo 公司，美國）；流式細胞儀（Beckman-Coulter 公司，美國）；酶標儀（Bio-Tec 公司，美國）。
1.2 細胞分離、培養及鑒定
1.2.1 ADSCs 取 SD 大鼠 3 只，無菌條件下取腹股溝脂肪，PBS 緩沖液反復沖洗，眼科剪剪碎至糊狀，加入 0.1%Ⅰ 型膠原酶后置于搖床中，37℃ 消化 60 min；經 100 目篩網過濾后，加入 DMEM/F12 培養液終止消化；180×g 離心 5 min，棄上清；取沉淀細胞，用含 10% FBS、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的 DMEM/F12 培養基重懸并接種至培養瓶中，置于 37℃、5% CO2 培養箱中培養并傳代，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態變化。
取第 3 代細胞進行鑒定：① 流式細胞儀檢測：流式細胞儀檢測細胞表面標志 CD29、CD34、CD44、CD106 表達。② 成骨誘導鑒定：采用成骨誘導液（含 100 nmol/L 地塞米松、50 μmol/L 維生素 C、20 mmol/L β-甘油磷酸鈉的 L-DMEM 培養基）誘導培養 3 周，行茜素紅染色觀察。③ 成脂誘導鑒定：采用成脂誘導液（含 1 μmol/L 地塞米松、50 μmol/L 吲哚美辛、0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、10 μg/mL 胰島素的 H-DMEM 培養基）誘導培養 3 周，行油紅 O 染色觀察。
1.2.2 軟骨細胞 取 SD 大鼠 2 只，無菌條件下取膝關節，用無菌剪刀剔除關節周圍附著的脂肪及韌帶組織，用眼科剪剪取關節軟骨組織，置入裝有無菌 PBS 緩沖液的培養皿中沖洗并剪碎；將剪碎的軟骨組織放入 0.2%Ⅱ 型膠原酶中消化，置振蕩器上 37℃ 震蕩消化 2 h，經 100 目篩網過濾后加入 DMEM/F12 培養液終止消化；180×g 離心 5 min，棄上清液，加入含 10% FBS、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的 DMEM/F12 培養基，置于 37℃、5% CO2 培養箱中培養并傳代，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態。取第 3 代細胞行甲苯胺藍染色鑒定。
1.3 觀測指標
1.3.1 MTS 法檢測 ADSCs 培養上清對紫外線照射的軟骨細胞增殖的影響 取第 3 代軟骨細胞以 5 000 個/孔接種于 96 孔板，用含 10% FBS 的 DMEM/F12 培養基培養。實驗分為 3 組：對照組細胞正常培養，不作任何處理；照射組細胞僅進行紫外線照射處理；ADSCs 上清組細胞行紫外線照射后，以加入 ADSCs 上清的培養基進行培養。將照射組和 ADSCs 上清組細胞放入紫外線交聯儀，選擇 40 J/m2 劑量進行照射，照射時間由機器自動調整。照射完畢，照射組繼續用含 10% FBS 的 DMEM/F12 培養基培養，ADSCs 上清組在上述培養基基礎上加入 20% ADSCs 培養上清（第 3 代 ADSCs 培養 48 h 的上清液）。繼續培養 24 h 后采用 CellTiter 96? A Queous 單溶液細胞增殖檢測試劑盒孵育 3 h，用酶標儀檢測 490 nm 波長下各孔吸光度（A）值。每組復 6 孔，取均值。
1.3.2 免疫熒光染色觀察 ADSCs 和 ADSCs 培養上清對紫外線照射軟骨細胞 γH2AX 蛋白的影響 取第 3 代 ADSCs，以 3×104 個/孔密度接種于 6 孔板 Transwell 小室上層，備用。同時取第 3 代軟骨細胞，以 5×104 個/孔接種于預先放有蓋玻片的 6 孔板中，用含 10% FBS 的 DMEM/F12 培養基培養。次日去上清，同上法行紫外線照射。照射完畢將軟骨細胞分成 3 組，分別為照射組、ADSCs 上清組、ADSCs 組，照射組繼續用含 10% FBS 的 DMEM/F12 培養基培養，ADSCs 上清組在上述培養基基礎上加入 20% ADSCs 培養上清，ADSCs 組將軟骨細胞放入接種有 ADSCs 的 Transwell 小室下層。以正常培養的軟骨細胞作為對照組。培養 24 h 后，取出蓋玻片，PBS 洗 3 次，采用 4% 多聚甲醛固定，經過透膜、封閉，加入抗大鼠 γH2AX 單克隆一抗（1∶100），4℃ 孵育過夜；次日，PBS 洗 3 次，加入羅丹明標記熒光二抗（1∶200），細胞核采用 DAPI 復染，熒光顯微鏡觀察。
1.3.3 Western blot 檢測 ADSCs 和 ADSCs 培養上清對紫外線照射軟骨細胞 γH2AX 蛋白的影響 實驗分為照射組、ADSCs 上清組、ADSCs 組和對照組，除軟骨細胞接種密度為 7×104 個/孔外，分組處理方法同 1.3.2。培養 24 h 后，收集細胞，用 RIPA 裂解液裂解細胞，收集細胞總蛋白。以 BCA 法測定蛋白濃度，每組取 20 μg 蛋白進行電泳轉膜，以 3% 牛血清白蛋白封閉 2 h，加入抗 γH2AX 兔單克隆一抗（1∶1 000）及抗 β-actin 兔單克隆一抗（1∶2 000），4℃ 孵育過夜；次日，PBS 洗 3 次，加入二抗抗兔辣根過氧化物酶標記多克隆抗體（1∶3 000）室溫孵育 1 h；以 β-actin 為內參蛋白。加入化學發光劑，凝膠成像系統拍照，并采用 Image Lab 4.0 軟件進行半定量分析。
1.4 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞形態觀察及鑒定
2.1.1 ADSCs 細胞接種 3 d 后首次換液，倒置相差顯微鏡觀察示細胞呈長梭形纖維細胞樣，散在生長，未形成集落；傳代后細胞呈纖維細胞樣，密集時呈漩渦樣排列。見圖 1。流式細胞儀檢測表面標志示 CD29（+）、CD44（+）、CD34（–）、CD106（–）。見圖 2。經成骨、成脂誘導分化 3 周后，茜素紅染色可見紅色結節樣鈣沉積，油紅 O 染色可見紅色圓形脂肪滴。見圖 3。
圖1
ADSCs 形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100） a. 原代細胞；b. 第 3 代細胞
Figure1.
ADSCs morphological observation (Inverted phase contrast microscope×100) a. Primary cell; b. ADSCs at passage 3
圖2
流式細胞儀檢測 ADSCs 表面標志 a. CD29；b. CD44；c. CD34；d. CD106
Figure2.
Surface markers identification of ADSCs by flow cytometry a. CD29; b. CD44; c. CD34; d. CD106
圖3
第 3 代 ADSCs 成骨、成脂誘導分化鑒定（倒置相差顯微鏡×100） a. 成骨誘導 3 周茜素紅染色；b. 成脂誘導 3 周油紅 O 染色
Figure3.
Multiple differentiation identification of ADSCs (Inverted phase contrast microscope×100) a. Alizarin red staining after osteogenic induction for 3 weeks; b. Oil red O staining after adipogenic induction for 3 weeks
2.1.2 軟骨細胞 細胞接種 3 d 后首次換液，倒置相差顯微鏡示原代軟骨細胞貼壁生長，呈多角形、星形，7 d 左右鋪滿；細胞形態隨傳代次數增加變得較規則，呈鋪路石樣。甲苯胺藍染色觀察示，細胞外基質可見藍色異染顆粒，細胞核染成深藍色，提示培養的細胞符合軟骨細胞生長特性。見圖 4。
圖4
軟骨細胞形態學觀察及鑒定（倒置相差顯微鏡×100） a. 第 3 代細胞形態觀察；b. 甲苯胺藍染色觀察
Figure4.
Morphological observation of chondrocytes (Inverted phase contrast microscope×100) a. Morphological observation of cells at passage 3; b. Toluidine blue staining observation
2.2 MTS 法檢測 ADSCs 培養上清對紫外線照射軟骨細胞增殖的影響
對照組、照射組及 ADSCs 上清組A 值分別為 2.20±0.10、1.34±0.04、1.57±0.06，照射組及 ADSCs 上清組顯著低于對照組，照射組顯著低于 ADSCs 上清組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.3 免疫熒光染色檢測 ADSCs 和 ADSCs 培養上清對紫外線照射軟骨細胞 γH2AX 蛋白的影響
與對照組相比，照射組、ADSCs 上清組及 ADSCs 組 γH2AX 蛋白熒光強度明顯升高，但 ADSCs 上清組及 ADSCs 組 γH2AX 蛋白熒光強度明顯弱于照射組，ADSCs 組和 ADSCs 上清組無區別。見圖 5。
圖5
免疫熒光染色觀察各組 γH2AX 蛋白熒光表達（熒光顯微鏡×600） 從左至右依次為 γH2AX 染色、DAPI 染色及合圖 a. 對照組；b. 照射組；c. ADSCs 上清組；d. ADSCs 組
Figure5.
Immunofluorescence staining of the γH2AX protein expression in each group (Fluorescence microscopy×600) From left to right for γH2AX, DAPI, and merge of γH2AX and DAPI a. Control group; b. Irradiated group; c. ADSCs supernatant goup; d. ADSCs group
2.4 Western blot 檢測 ADSCs 和 ADSCs 培養上清對紫外線照射軟骨細胞 γH2AX 蛋白的影響
對照組、照射組、ADSCs 上清組及 ADSCs 組 γH2AX 蛋白相對表達量分別為 0.10±0.02、2.57±0.15、1.91±0.16、1.70±0.17。與對照組相比，照射組、ADSCs 上清組及 ADSCs 組 γH2AX 蛋白相對表達量均明顯升高，但 ADSCs 上清組及 ADSCs 組顯著低于照射組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；ADSCs 組和 ADSCs 上清組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 6。
圖6
Western blot 檢測各組軟骨細胞 γH2AX 蛋白表達 1：對照組；2：照射組；3：ADSCs 上清組；4：ADSCs 組
Figure6.
γH2AX protein expression in each group by Western blot 1: Control group; 2: Irradiated group; 3: ADSCs supernatant group; 4: ADSCs group
3 討論
電離輻射、遺傳毒性化學物質、化療藥物等均可導致 DSBs，它是 DNA 損傷中最嚴重的形式，若未能修復可致細胞死亡[2]。DSBs 無效修復或錯誤修復可導致基因組不穩定，表現為染色體重排或染色體缺失，最終導致腫瘤及其他年齡相關性疾病的發生[3]。電離輻射對骨和軟骨的影響主要表現在骨生長障礙、變性作用和惡變。特別是發育中的骨和軟骨組織對輻射極為敏感，小劑量即可引起形態學、酶學甚至生物力學特征的改變，這與電離輻射干擾了有絲分裂、引起細胞增殖障礙、細胞變性及代謝改變有關[4]。而電離輻射引起骨生長障礙的主要病理基礎就是對骨骺增殖軟骨細胞的損傷。本研究中，我們采用 CellTiter 96? A Queous 單溶液細胞增殖檢測試劑盒來檢測電離輻射對軟骨細胞增殖的影響。此試劑盒是 MTS 的改良版，是由 MTS 和化學穩定性已得到增強的 PES 混合組成的單溶液，原理與 MTS 類似，但使用更簡單，該單溶液試劑直接加入至培養孔中，A 值與培養物中活細胞的數量成正比。結果顯示，電離輻射抑制了軟骨細胞的增殖；而照射后采用含 ADSCs 上清的培養基培養的細胞與照射后采用未添加 ADSCs 上清培養基培養的細胞相比，增殖恢復明顯加快。提示 ADSCs 促進軟骨細胞損傷后恢復的作用可能與其分泌的促生長因子有關。
ADSCs 于 2001 年被成功分離，其具有多向分化潛能，可分化為脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、平滑肌細胞、心肌細胞和神經細胞等[5-12]。多項實驗表明，ADSCs 可表達和分泌多種生長因子，如 IGF、肝細胞生長因子、TGF 和 VEGF 等[13-17]，能夠促進多種組織與細胞的生長。而且相同體積的脂肪組織所含干細胞數量是骨髓組織中的 1 000 倍[18]。因此，ADSCs 在組織修復或再生中的應用非常廣泛，包括心血管組織再生、骨/軟骨修復、尿道重建、椎間盤修復和外周神經修復等。
關于 ADSCs 對軟骨組織的修復，一般認為是通過直接分化為軟骨細胞或分泌抗炎因子來實現的，過度的紫外線照射也是一種損傷刺激，會引起軟骨細胞一系列炎性反應。因此，ADSCs 分泌抗炎因子可能是促進軟骨細胞修復的途徑之一。但 ADSCs 對電離輻射引起的 DNA 損傷是否具有修復作用，目前研究較少。DNA 損傷有多種形式，如 DNA 單鏈斷裂、DNA 與 DNA 的交聯、DNA 與蛋白質的交聯、DSBs 等。其中，DSBs 會影響 DNA 雙螺旋結構，被認為是 DNA 損傷最嚴重形式。在 DSBs 發生后幾分鐘內，H2AX 分子在絲氨酸 139 被快速磷酸化形成 γH2AX；γH2AX 在 DSBs 的損傷修復過程中發揮重要作用，它將一系列 DNA 損傷反應蛋白募集到 DNA 損傷位點，形成 DNA 損傷反應功能復合物，啟動激活 DNA 修復、細胞周期檢查點等細胞 DNA 損傷反應。這種 DNA 損傷應激反應在幾分鐘內就能出現，因此它被認為是一種早期檢測 DSBs 的最有效生物學標志物[19]。在 DNA 損傷修復結束后，γH2AX 的及時去磷酸化，對于修復蛋白復合物從所結合的 DNA 上解離以及細胞周期檢查點的釋放，都是至關重要的。然而，關于 γH2AX 和其他修復蛋白是如何從染色體上解離從而使細胞進入正常分裂周期，以及 γH2AX 是如何恢復成 H2AX 的動力學機制，目前尚未明確。有關研究人員提出了兩種可能機制：γH2AX 通過組蛋白交換的方式從染色體上解離[20]，或者 γH2AX 通過被磷酸酶去磷酸化而恢復成 H2AX。目前已證實的 γH2AX 的去磷酸化酶包括蛋白磷酸酶 2、蛋白磷酸酶 4、蛋白磷酸酶 6、野生型 p53 誘導性磷酸酶 1（wild-type p53-induced phosphatase1，Wip1）[21]。Wip1 是 DNA 損傷應答網絡中的關鍵分子之一，在 DNA 損傷應答中由 p53 誘導，對 DNA 損傷應答發揮抑制作用。通過去磷酸化 p38 絲裂原活化蛋白激酶、p53、ATM、Chk1、Chk2、MDM2 和 MDM4，使停滯的細胞周期繼續進行。本研究中，我們分別通過免疫熒光染色和 Western blot 檢測了 γH2AX 的表達，結果發現 ADSCs 上清能降低 γH2AX 的表達，促進損傷軟骨的修復；而且無論是提前制備的上清還是 Transwell 培養上清，均具有修復作用，并且無明顯差別。因此，我們認為 ADSCs 對輻射損傷軟骨細胞的修復作用可能是通過分泌的各種生長因子促進磷酸酶去磷酸化 γH2AX 實現的。然而，對于這些去磷酸化反應的分子機制的研究尚處于初級階段，而 ADSC 分泌的上清成分又比較復雜，因此還有許多問題需要深入研究和探討。比如，ADSC 上清中哪些成分能夠激活哪些磷酸酶的表達，DNA 損傷修復完成后這些磷酸酶是被哪些蛋白激活而發揮作用，均是未來研究的方向。
各種原因造成的射線輻射是促使機體老化衰退的重要原因，照射生物體時可直接破壞機體內某些大分子結構，如使 DNA 分子鏈斷裂、與細胞生長相關的一些蛋白質和酶發生變性及破壞，從而引起細胞凋亡和機體老化。DNA 雙鏈斷裂（DNA double-strand breaks，DSBs）是 DNA 損傷中最嚴重的形式，若未能修復可致細胞死亡。DNA 發生損傷時，細胞會立即做出系列的 DNA 損傷應答反應（DNA damage response，DDR），其中組蛋白 2A 變異體（histone family 2A variant，H2AX）的磷酸化是激活 DDR 反應通路中的關鍵蛋白，是感應 DNA 損傷的標志蛋白。采用特異性抗體檢測磷酸化 H2AX（phosphorylated H2AX，γH2AX）是檢測 DSBs 的常用方法。研究表明，脂肪來源干細胞（adipose- derived stem cells，ADSCs）可通過旁分泌生長因子和直接參與方式促進血管生成及組織再生[1]，但關于 ADSCs 對射線輻射造成細胞損傷的修復作用研究較少。因此，本研究以紫外線照射軟骨細胞作為細胞損傷模型，觀察大鼠 ADSCs 對紫外線輻射造成的軟骨細胞損傷的修復作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
3～4 周齡健康 SD 大鼠 5 只，雌雄不限，體質量 100～120 g，購于廣東省實驗動物中心。
DMEM/F12 培養基、L-DMEM 培養基、FBS、胰蛋白酶、Ⅰ 型膠原酶、Ⅱ 型膠原酶、青鏈霉素（Life Technology 公司，美國）；CellTiter 96? A Queous 單溶液細胞增殖檢測試劑盒（Promega 公司，美國）；兔單克隆抗體 γH2AX 和 β-actin（Cell Signaling 公司，美國）；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素、吲哚美辛、維生素 C、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、茜素紅、油紅 O（Sigma 公司，美國）。Transwell 小室（Millipore 公司，美國）；紫外線交聯儀（Spec-tronics 公司，美國）；化學發光凝膠成像系統（Bio-Rad 公司，美國）；熒光顯微鏡（ZEISS 公司，德國）；CO2 培養箱（Thermo 公司，美國）；流式細胞儀（Beckman-Coulter 公司，美國）；酶標儀（Bio-Tec 公司，美國）。
1.2 細胞分離、培養及鑒定
1.2.1 ADSCs 取 SD 大鼠 3 只，無菌條件下取腹股溝脂肪，PBS 緩沖液反復沖洗，眼科剪剪碎至糊狀，加入 0.1%Ⅰ 型膠原酶后置于搖床中，37℃ 消化 60 min；經 100 目篩網過濾后，加入 DMEM/F12 培養液終止消化；180×g 離心 5 min，棄上清；取沉淀細胞，用含 10% FBS、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的 DMEM/F12 培養基重懸并接種至培養瓶中，置于 37℃、5% CO2 培養箱中培養并傳代，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態變化。
取第 3 代細胞進行鑒定：① 流式細胞儀檢測：流式細胞儀檢測細胞表面標志 CD29、CD34、CD44、CD106 表達。② 成骨誘導鑒定：采用成骨誘導液（含 100 nmol/L 地塞米松、50 μmol/L 維生素 C、20 mmol/L β-甘油磷酸鈉的 L-DMEM 培養基）誘導培養 3 周，行茜素紅染色觀察。③ 成脂誘導鑒定：采用成脂誘導液（含 1 μmol/L 地塞米松、50 μmol/L 吲哚美辛、0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、10 μg/mL 胰島素的 H-DMEM 培養基）誘導培養 3 周，行油紅 O 染色觀察。
1.2.2 軟骨細胞 取 SD 大鼠 2 只，無菌條件下取膝關節，用無菌剪刀剔除關節周圍附著的脂肪及韌帶組織，用眼科剪剪取關節軟骨組織，置入裝有無菌 PBS 緩沖液的培養皿中沖洗并剪碎；將剪碎的軟骨組織放入 0.2%Ⅱ 型膠原酶中消化，置振蕩器上 37℃ 震蕩消化 2 h，經 100 目篩網過濾后加入 DMEM/F12 培養液終止消化；180×g 離心 5 min，棄上清液，加入含 10% FBS、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的 DMEM/F12 培養基，置于 37℃、5% CO2 培養箱中培養并傳代，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態。取第 3 代細胞行甲苯胺藍染色鑒定。
1.3 觀測指標
1.3.1 MTS 法檢測 ADSCs 培養上清對紫外線照射的軟骨細胞增殖的影響 取第 3 代軟骨細胞以 5 000 個/孔接種于 96 孔板，用含 10% FBS 的 DMEM/F12 培養基培養。實驗分為 3 組：對照組細胞正常培養，不作任何處理；照射組細胞僅進行紫外線照射處理；ADSCs 上清組細胞行紫外線照射后，以加入 ADSCs 上清的培養基進行培養。將照射組和 ADSCs 上清組細胞放入紫外線交聯儀，選擇 40 J/m2 劑量進行照射，照射時間由機器自動調整。照射完畢，照射組繼續用含 10% FBS 的 DMEM/F12 培養基培養，ADSCs 上清組在上述培養基基礎上加入 20% ADSCs 培養上清（第 3 代 ADSCs 培養 48 h 的上清液）。繼續培養 24 h 后采用 CellTiter 96? A Queous 單溶液細胞增殖檢測試劑盒孵育 3 h，用酶標儀檢測 490 nm 波長下各孔吸光度（A）值。每組復 6 孔，取均值。
1.3.2 免疫熒光染色觀察 ADSCs 和 ADSCs 培養上清對紫外線照射軟骨細胞 γH2AX 蛋白的影響 取第 3 代 ADSCs，以 3×104 個/孔密度接種于 6 孔板 Transwell 小室上層，備用。同時取第 3 代軟骨細胞，以 5×104 個/孔接種于預先放有蓋玻片的 6 孔板中，用含 10% FBS 的 DMEM/F12 培養基培養。次日去上清，同上法行紫外線照射。照射完畢將軟骨細胞分成 3 組，分別為照射組、ADSCs 上清組、ADSCs 組，照射組繼續用含 10% FBS 的 DMEM/F12 培養基培養，ADSCs 上清組在上述培養基基礎上加入 20% ADSCs 培養上清，ADSCs 組將軟骨細胞放入接種有 ADSCs 的 Transwell 小室下層。以正常培養的軟骨細胞作為對照組。培養 24 h 后，取出蓋玻片，PBS 洗 3 次，采用 4% 多聚甲醛固定，經過透膜、封閉，加入抗大鼠 γH2AX 單克隆一抗（1∶100），4℃ 孵育過夜；次日，PBS 洗 3 次，加入羅丹明標記熒光二抗（1∶200），細胞核采用 DAPI 復染，熒光顯微鏡觀察。
1.3.3 Western blot 檢測 ADSCs 和 ADSCs 培養上清對紫外線照射軟骨細胞 γH2AX 蛋白的影響 實驗分為照射組、ADSCs 上清組、ADSCs 組和對照組，除軟骨細胞接種密度為 7×104 個/孔外，分組處理方法同 1.3.2。培養 24 h 后，收集細胞，用 RIPA 裂解液裂解細胞，收集細胞總蛋白。以 BCA 法測定蛋白濃度，每組取 20 μg 蛋白進行電泳轉膜，以 3% 牛血清白蛋白封閉 2 h，加入抗 γH2AX 兔單克隆一抗（1∶1 000）及抗 β-actin 兔單克隆一抗（1∶2 000），4℃ 孵育過夜；次日，PBS 洗 3 次，加入二抗抗兔辣根過氧化物酶標記多克隆抗體（1∶3 000）室溫孵育 1 h；以 β-actin 為內參蛋白。加入化學發光劑，凝膠成像系統拍照，并采用 Image Lab 4.0 軟件進行半定量分析。
1.4 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞形態觀察及鑒定
2.1.1 ADSCs 細胞接種 3 d 后首次換液，倒置相差顯微鏡觀察示細胞呈長梭形纖維細胞樣，散在生長，未形成集落；傳代后細胞呈纖維細胞樣，密集時呈漩渦樣排列。見圖 1。流式細胞儀檢測表面標志示 CD29（+）、CD44（+）、CD34（–）、CD106（–）。見圖 2。經成骨、成脂誘導分化 3 周后，茜素紅染色可見紅色結節樣鈣沉積，油紅 O 染色可見紅色圓形脂肪滴。見圖 3。
圖1
ADSCs 形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100） a. 原代細胞；b. 第 3 代細胞
Figure1.
ADSCs morphological observation (Inverted phase contrast microscope×100) a. Primary cell; b. ADSCs at passage 3
圖2
流式細胞儀檢測 ADSCs 表面標志 a. CD29；b. CD44；c. CD34；d. CD106
Figure2.
Surface markers identification of ADSCs by flow cytometry a. CD29; b. CD44; c. CD34; d. CD106
圖3
第 3 代 ADSCs 成骨、成脂誘導分化鑒定（倒置相差顯微鏡×100） a. 成骨誘導 3 周茜素紅染色；b. 成脂誘導 3 周油紅 O 染色
Figure3.
Multiple differentiation identification of ADSCs (Inverted phase contrast microscope×100) a. Alizarin red staining after osteogenic induction for 3 weeks; b. Oil red O staining after adipogenic induction for 3 weeks
2.1.2 軟骨細胞 細胞接種 3 d 后首次換液，倒置相差顯微鏡示原代軟骨細胞貼壁生長，呈多角形、星形，7 d 左右鋪滿；細胞形態隨傳代次數增加變得較規則，呈鋪路石樣。甲苯胺藍染色觀察示，細胞外基質可見藍色異染顆粒，細胞核染成深藍色，提示培養的細胞符合軟骨細胞生長特性。見圖 4。
圖4
軟骨細胞形態學觀察及鑒定（倒置相差顯微鏡×100） a. 第 3 代細胞形態觀察；b. 甲苯胺藍染色觀察
Figure4.
Morphological observation of chondrocytes (Inverted phase contrast microscope×100) a. Morphological observation of cells at passage 3; b. Toluidine blue staining observation
2.2 MTS 法檢測 ADSCs 培養上清對紫外線照射軟骨細胞增殖的影響
對照組、照射組及 ADSCs 上清組A 值分別為 2.20±0.10、1.34±0.04、1.57±0.06，照射組及 ADSCs 上清組顯著低于對照組，照射組顯著低于 ADSCs 上清組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.3 免疫熒光染色檢測 ADSCs 和 ADSCs 培養上清對紫外線照射軟骨細胞 γH2AX 蛋白的影響
與對照組相比，照射組、ADSCs 上清組及 ADSCs 組 γH2AX 蛋白熒光強度明顯升高，但 ADSCs 上清組及 ADSCs 組 γH2AX 蛋白熒光強度明顯弱于照射組，ADSCs 組和 ADSCs 上清組無區別。見圖 5。
圖5
免疫熒光染色觀察各組 γH2AX 蛋白熒光表達（熒光顯微鏡×600） 從左至右依次為 γH2AX 染色、DAPI 染色及合圖 a. 對照組；b. 照射組；c. ADSCs 上清組；d. ADSCs 組
Figure5.
Immunofluorescence staining of the γH2AX protein expression in each group (Fluorescence microscopy×600) From left to right for γH2AX, DAPI, and merge of γH2AX and DAPI a. Control group; b. Irradiated group; c. ADSCs supernatant goup; d. ADSCs group
2.4 Western blot 檢測 ADSCs 和 ADSCs 培養上清對紫外線照射軟骨細胞 γH2AX 蛋白的影響
對照組、照射組、ADSCs 上清組及 ADSCs 組 γH2AX 蛋白相對表達量分別為 0.10±0.02、2.57±0.15、1.91±0.16、1.70±0.17。與對照組相比，照射組、ADSCs 上清組及 ADSCs 組 γH2AX 蛋白相對表達量均明顯升高，但 ADSCs 上清組及 ADSCs 組顯著低于照射組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；ADSCs 組和 ADSCs 上清組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 6。
圖6
Western blot 檢測各組軟骨細胞 γH2AX 蛋白表達 1：對照組；2：照射組；3：ADSCs 上清組；4：ADSCs 組
Figure6.
γH2AX protein expression in each group by Western blot 1: Control group; 2: Irradiated group; 3: ADSCs supernatant group; 4: ADSCs group
3 討論
電離輻射、遺傳毒性化學物質、化療藥物等均可導致 DSBs，它是 DNA 損傷中最嚴重的形式，若未能修復可致細胞死亡[2]。DSBs 無效修復或錯誤修復可導致基因組不穩定，表現為染色體重排或染色體缺失，最終導致腫瘤及其他年齡相關性疾病的發生[3]。電離輻射對骨和軟骨的影響主要表現在骨生長障礙、變性作用和惡變。特別是發育中的骨和軟骨組織對輻射極為敏感，小劑量即可引起形態學、酶學甚至生物力學特征的改變，這與電離輻射干擾了有絲分裂、引起細胞增殖障礙、細胞變性及代謝改變有關[4]。而電離輻射引起骨生長障礙的主要病理基礎就是對骨骺增殖軟骨細胞的損傷。本研究中，我們采用 CellTiter 96? A Queous 單溶液細胞增殖檢測試劑盒來檢測電離輻射對軟骨細胞增殖的影響。此試劑盒是 MTS 的改良版，是由 MTS 和化學穩定性已得到增強的 PES 混合組成的單溶液，原理與 MTS 類似，但使用更簡單，該單溶液試劑直接加入至培養孔中，A 值與培養物中活細胞的數量成正比。結果顯示，電離輻射抑制了軟骨細胞的增殖；而照射后采用含 ADSCs 上清的培養基培養的細胞與照射后采用未添加 ADSCs 上清培養基培養的細胞相比，增殖恢復明顯加快。提示 ADSCs 促進軟骨細胞損傷后恢復的作用可能與其分泌的促生長因子有關。
ADSCs 于 2001 年被成功分離，其具有多向分化潛能，可分化為脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、平滑肌細胞、心肌細胞和神經細胞等[5-12]。多項實驗表明，ADSCs 可表達和分泌多種生長因子，如 IGF、肝細胞生長因子、TGF 和 VEGF 等[13-17]，能夠促進多種組織與細胞的生長。而且相同體積的脂肪組織所含干細胞數量是骨髓組織中的 1 000 倍[18]。因此，ADSCs 在組織修復或再生中的應用非常廣泛，包括心血管組織再生、骨/軟骨修復、尿道重建、椎間盤修復和外周神經修復等。
關于 ADSCs 對軟骨組織的修復，一般認為是通過直接分化為軟骨細胞或分泌抗炎因子來實現的，過度的紫外線照射也是一種損傷刺激，會引起軟骨細胞一系列炎性反應。因此，ADSCs 分泌抗炎因子可能是促進軟骨細胞修復的途徑之一。但 ADSCs 對電離輻射引起的 DNA 損傷是否具有修復作用，目前研究較少。DNA 損傷有多種形式，如 DNA 單鏈斷裂、DNA 與 DNA 的交聯、DNA 與蛋白質的交聯、DSBs 等。其中，DSBs 會影響 DNA 雙螺旋結構，被認為是 DNA 損傷最嚴重形式。在 DSBs 發生后幾分鐘內，H2AX 分子在絲氨酸 139 被快速磷酸化形成 γH2AX；γH2AX 在 DSBs 的損傷修復過程中發揮重要作用，它將一系列 DNA 損傷反應蛋白募集到 DNA 損傷位點，形成 DNA 損傷反應功能復合物，啟動激活 DNA 修復、細胞周期檢查點等細胞 DNA 損傷反應。這種 DNA 損傷應激反應在幾分鐘內就能出現，因此它被認為是一種早期檢測 DSBs 的最有效生物學標志物[19]。在 DNA 損傷修復結束后，γH2AX 的及時去磷酸化，對于修復蛋白復合物從所結合的 DNA 上解離以及細胞周期檢查點的釋放，都是至關重要的。然而，關于 γH2AX 和其他修復蛋白是如何從染色體上解離從而使細胞進入正常分裂周期，以及 γH2AX 是如何恢復成 H2AX 的動力學機制，目前尚未明確。有關研究人員提出了兩種可能機制：γH2AX 通過組蛋白交換的方式從染色體上解離[20]，或者 γH2AX 通過被磷酸酶去磷酸化而恢復成 H2AX。目前已證實的 γH2AX 的去磷酸化酶包括蛋白磷酸酶 2、蛋白磷酸酶 4、蛋白磷酸酶 6、野生型 p53 誘導性磷酸酶 1（wild-type p53-induced phosphatase1，Wip1）[21]。Wip1 是 DNA 損傷應答網絡中的關鍵分子之一，在 DNA 損傷應答中由 p53 誘導，對 DNA 損傷應答發揮抑制作用。通過去磷酸化 p38 絲裂原活化蛋白激酶、p53、ATM、Chk1、Chk2、MDM2 和 MDM4，使停滯的細胞周期繼續進行。本研究中，我們分別通過免疫熒光染色和 Western blot 檢測了 γH2AX 的表達，結果發現 ADSCs 上清能降低 γH2AX 的表達，促進損傷軟骨的修復；而且無論是提前制備的上清還是 Transwell 培養上清，均具有修復作用，并且無明顯差別。因此，我們認為 ADSCs 對輻射損傷軟骨細胞的修復作用可能是通過分泌的各種生長因子促進磷酸酶去磷酸化 γH2AX 實現的。然而，對于這些去磷酸化反應的分子機制的研究尚處于初級階段，而 ADSC 分泌的上清成分又比較復雜，因此還有許多問題需要深入研究和探討。比如，ADSC 上清中哪些成分能夠激活哪些磷酸酶的表達，DNA 損傷修復完成后這些磷酸酶是被哪些蛋白激活而發揮作用，均是未來研究的方向。
