引用本文： 趙伯文, 張宏偉, 徐強, 葛權虎, 李伯龍, 彭心宇, 吳向未. 長時間不同強度負壓對兔 BMSCs 成骨分化及增殖的影響研究. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(5): 594-599. doi: 10.7507/1002-1892.201701095 復制
自 1993 年德國創傷外科醫生 Fleischmann 等[1]提出負壓技術以來，該技術已在臨床廣泛應用，并取得了良好療效。研究表明，負壓可促進創面局部微血管循環[2]、肉芽組織生長[3]、減輕組織水腫[4]，還可促進成纖維細胞、平滑肌細胞、單核細胞的增殖分化[5-6]。BMSCs 來源于中胚層，是一種具有多向分化潛能的未成熟細胞[7]，現已知 BMSCs 在特定條件下可分化為成骨細胞、軟骨細胞、肝細胞，從而參與創傷的修復[8-9]。有研究表明，短時間負壓誘導下可促進 BMSCs 成骨[10]，但目前負壓對干細胞成骨的研究多采用短時間、高強度負壓條件，對于長時間不同負壓對干細胞成骨的影響研究較少。本實驗通過研究長時間不同強度負壓對 BMSCs 誘導成骨分化的作用，為下一步將負壓用于治療骨缺損及加速骨折愈合研究提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4～6 月齡新西蘭大白兔 30 只，雌雄不限，體質量 1.5～2.0 kg，由石河子大學實驗動物中心提供。
L-DMEM 培養基、FBS、青/鏈霉素、胰蛋白酶（HyClone 公司，美國）；Ficoll 淋巴細胞分離液、2% 明膠（北京索萊寶科技有限公司）；鼠抗兔 CD34-FITC、CD44-PE、CD29-APC（Santa Cruze 公司，美國）；ALP 試劑盒（南京建成生物工程研究所）；抗Ⅰ型膠原抗體、抗骨鈣素（osteocalcin，OC）抗體（Abcam 公司，美國）；Trizol（Invitrogen 公司，美國）；First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo 公司，美國）；SYBR Green PCR Kit（Qiagen 公司，德國）。5% CO2 培養箱、酶標儀、實時熒光定量 PCR 儀（Thermo 公司，美國）；倒置顯微鏡（Leica 公司，德國）。
1.2 兔 BMSCs 分離、培養及鑒定
1.2.1 兔 BMSCs 分離、培養 取新西蘭大白兔 30 只，以 3% 戊巴比妥鈉（30 mg/kg）經耳緣靜脈注射麻醉，無菌條件下暴露一側股骨，用含 1 mL 肝素（3 000 U/mL）的 5 mL 注射器從股骨抽取 2～4 mL 骨髓，用無血清 DMEM 培養基懸浮；將細胞懸液緩慢加入 1.077 g/cm3 Ficoll 淋巴細胞分離液上部（細胞懸液與分離液比例為 2∶1），以離心半徑 14 cm、2 000 r/min 離心 20 min；小心吸取位于分離液中間的乳白色細胞層，移入另一離心管中，用無血清 DMEM 培養基重懸洗滌 2 次，以離心半徑 14 cm、1 500 r/min 離心 5 min 后用 3 mL 完全培養基（含 10%FBS 的 L-DMEM 培養液）接種于 60 mm 培養皿內，37℃、5%CO2 恒溫箱培養，每 48 小時換液 1 次。待細胞融合至 80%～90% 時，胰蛋白酶消化，倒置顯微鏡下觀察到細胞收縮、細胞間隙增大時終止消化，輕輕吹打細胞至細胞脫落；將細胞懸液移至另一無菌離心管內，以離心半徑 14 cm、800 r/min 離心 5 min；棄上清，加入完全培養基重懸細胞，按 1∶2 或 1∶3 比例接種于 60 mm 培養皿內，37℃、5%CO2 恒溫箱培養，每 48 小時換液 1 次，待細胞融合至 80%～90% 再次傳代培養。倒置顯微鏡觀察培養過程中細胞形態變化。
1.2.2 細胞鑒定 ① 流式細胞儀鑒定：取第 3 代細胞，胰蛋白酶消化后 PBS 洗 2 遍，用 PBS 調整細胞為 1×105～1×106 個，加入鼠抗兔 CD34-FITC、CD44-PE、CD29-APC，4℃ 避光孵育 20 min，PBS 洗 2 遍后，流式細胞儀檢測細胞表面標志物表達情況。② 成骨誘導鑒定：取第 3 代細胞，胰蛋白酶消化后，按 2×104 個/cm2 密度接種于包被 0.1% 明膠（將 2% 明膠用 PBS 稀釋至 0.1% 濃度）的 6 孔板中，每孔加入完全培養基，37℃、5%CO2 恒溫箱培養；當細胞融合達 60%～70% 時吸棄完全培養基，加入成骨誘導培養基（含 10%FBS、100 nmol/L 地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L 抗壞血酸的 L-DMEM 培養液）。誘導 14 d 后棄培養液，PBS 洗 3 遍，4% 多聚甲醛固定 30 min；吸棄多聚甲醛，PBS 洗 3 遍，加入茜素紅染液染色 5～10 min；吸棄茜素紅染液，PBS 洗 3 遍，倒置顯微鏡觀察。
1.3 實驗分組及方法
取第 3 代 BMSCs，按 1.2.2 中成骨誘導方法加入成骨誘導培養基，置入自制的負壓細胞培養盒，將培養盒與微型負壓儀用導管相聯。調節負壓儀，根據負壓壓力不同將實驗分為 3 組，負壓壓力分別為 0、75、150 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）（分別為對照組、低負壓組、高負壓組）；負壓時間為 30 min/h；每 48 小時換液 1 次。
1.4 觀測指標
1.4.1 細胞生長觀測 取第 3 代 BMSCs 按 4×104 個/cm2 密度接種于 12 孔板中，按 1.3 方法成骨誘導及分組后，于誘導 1～7 d 每天消化 3 孔細胞，采用細胞計數板計數法計數細胞，并繪制細胞生長曲線。
1.4.2 ALP 活性檢測 取第 3 代 BMSCs，胰蛋白酶消化后，按 2×104 個/cm2 密度接種于包被 0.1% 明膠的 6 孔板中，按 1.3 方法成骨誘導及分組后，于誘導 3、7、14 d 分別收集細胞培養液（n=9），按 ALP 試劑盒方法測定 520 nm 波長處吸光度（A）值。
1.4.3 實時熒光定量 PCR 檢測成骨相關基因表達 取第 3 代 BMSCs，胰蛋白酶消化后，按 2×104 個/cm2 密度接種于包被 0.1% 明膠的 6 孔板中，按 1.3 方法成骨誘導及分組后，于誘導 14 d 時采用 Trizol 提取細胞總 RNA，測試 RNA 樣本濃度和純度，取 200 ng RNA 樣本采用逆轉錄試劑盒合成 cDNA，加入 PCR 儀中進行擴增。擴增條件：95℃ 預變性 2 min，95℃ 變性 5 s，55℃ 退火 30 s，60℃ 延伸 10 s，40 個循環。采用實時熒光定量 PCR 分析程序分析 Ct 值，計算成骨相關基因Ⅰ型膠原、OC mRNA 相對表達量（2–ΔΔCt），以 β-actin 作為參照。各基因引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列及產物長度見表 1。
表1
實時熒光定量 PCR 相關基因引物序列及產物長度
Table1.
Primer sequences and product length for real-time fluorescence quantitative PCR
1.4.4 Western blot 檢測成骨相關蛋白表達 取第 3 代 BMSCs，胰蛋白酶消化后，按 2×104 個/cm2 密度接種于包被 0.1% 明膠的 6 孔板中，按 1.3 方法成骨誘導及分組后，于誘導 14 d 時提取細胞蛋白，變性處理后 –80℃ 保存蛋白樣本。10%SDS-PAGE 電泳，電轉膜將蛋白轉移至聚偏氟乙烯膜，一抗、二抗孵育后加入化學發光試劑顯示條帶，壓片，顯影采圖后用 Image J 分析Ⅰ型膠原、OC 蛋白相對表達量。
1.5 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 Bonferroni 法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs 形態學觀察及鑒定
倒置顯微鏡觀察示，原代細胞接種時多為圓形或橢圓形，5～6 h 后細胞貼壁呈橢圓形，可見少量梭形細胞；48 h 后初期貼壁細胞開始變形呈棒狀或梭形，4～6 d 后細胞快速增殖，形成分散的細胞集落；8～10 d 后細胞融合至 80%～90%，細胞呈梭形，魚群樣或漩渦樣生長。成骨誘導 7 d 后可見高密度區細胞逐漸向圓形成骨細胞分化，14 d 肉眼可見白色鈣結節；14 d 時茜素紅染色可見鈣結節紅染。見圖 1。
圖1
倒置顯微鏡觀察 BMSCs 形態 a. 原代細胞培養 10 d（×100）；b. 第 3 代細胞常規培養 7 d（×100）；c. 第 3 代細胞成骨誘導 7 d（×100）；d. 第 3 代細胞成骨誘導 14 d 茜素紅染色（×25）
Figure1.
Morphological observation of BMSCs under inverted microscope a. Primary cells cultured for 10 days (×100); b. The third passage cells cultured for 7 days (×100); c. The third passage cells cultured for 7 days after osteogenic induction (×100); d. Alizarin red staining of the third passage cells at 14 days after osteogenic induction (×25)
流式細胞儀鑒定示，所培養細胞高表達 BMSCs 表面抗原 CD44、CD29，低表達或不表達骨髓成纖維細胞、造血干細胞表面抗原 CD34。見圖 2。
圖2
流式細胞儀鑒定 BMSCs 表面標志物表達 a. CD44；b. CD29；c. CD34
Figure2.
Identification of BMSCs surface markers by flow cytometry a. CD44; b. CD29; c. CD34
2.2 細胞生長觀測
誘導 4 d，高負壓組細胞顯著少于對照組和低負壓組，差異有統計學意義（P<0.05）；低負壓組與對照組比較差異無統計學意義（P>0.05）。誘導 5～7 d，3 組間細胞數比較差異均有統計學意義（P<0.05），負壓越大細胞增殖受抑制越明顯。見圖 3。
圖3
各組細胞生長曲線
Figure3.
Cell growth curve of each group
2.3 ALP 活性檢測
隨誘導時間延長，各組 ALP 活性均有不同程度升高，除對照組誘導 3、7 d 間比較差異無統計學意義（P>0.05）外，其余各組組內各時間點間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。誘導 3 d，各組間 ALP 活性比較差異無統計學意義（P>0.05）；7 d，僅高負壓組 ALP 活性與對照組比較差異有統計學意義（P<0.05）；14 d，3 組間 ALP 活性比較差異均有統計學意義（P<0.05），負壓越大 ALP 活性越高。見表 2。
表2
誘導各時間點各組 ALP 活性比較（n=9，金氏單位/mL，
）
Table2.
Comparison of ALP activity between groups at different time points (n=9, King unit/mL,
)
2.4 實時熒光定量 PCR 檢測成骨相關基因表達
誘導 14 d，對照組、低負壓組及高負壓組Ⅰ型膠原 mRNA 相對表達量分別為 1.00±0.00、2.02±0.11、2.57±0.15，OC mRNA 相對表達量分別為 1.00±0.00、1.49±0.19、2.14±0.17。低負壓組及高負壓組Ⅰ型膠原和 OC mRNA 相對表達量均顯著高于對照組，高負壓組高于低負壓組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.5 Western blot 檢測成骨相關蛋白表達
誘導 14 d，對照組、低負壓組及高負壓組Ⅰ型膠原蛋白表達量分別為 0.69±0.04、0.90±0.03、1.10±0.04，OC 蛋白表達量分別為 0.67±0.04、0.88±0.04、1.09±0.04。低負壓組及高負壓組Ⅰ型膠原和 OC 蛋白表達量均顯著高于對照組，高負壓組高于低負壓組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
誘導 14 d Western blot 檢測各組成骨相關蛋白表達1：對照組；2：低負壓組；3：高負壓組
Figure4.
Osteogenic related protein expression in each group at 14 days after osteogenic induction by Western blot 1: Control group; 2: Low negative pressure group; 3: High negative pressure group
3 討論
負壓技術具有封閉創面、減輕水腫、減少細菌、增加血供、促進細胞增殖、促進肉芽組織生長等作用，從而促進創面愈合。目前對于負壓技術在骨外科的應用，尤其是骨折不愈合、先天性骨不連、良性骨腫瘤等伴有骨缺損疾病的報道較少見。BMSCs 作為一種成體干細胞，具有較強的自我復制能力和多向分化能力，是一種良好的組織工程種子細胞，為修復骨缺損提供了可能。有研究顯示高強度、短時間負壓可促進 MSCs 成骨分化[10]。我們推測當負壓強度與誘導時間在一定范圍內增加，細胞的成骨能力會增強。故基于既往相關研究[10-12]，本實驗旨在觀察長時間不同強度負壓對 BMSCs 成骨能力的影響，為將負壓技術用于骨外科提供一定理論依據。
本實驗以 BMSCs 誘導成骨為前提條件，在 3 種不同強度負壓下（0、75、150 mm Hg，30 min/h）進行成骨誘導培養，觀察 BMSCs 的生長、分化及誘導后成骨細胞的表型表達情況。結果顯示，在實驗設定的負壓下，隨負壓增高，BMSCs 的成骨活性及細胞增殖的抑制作用均增強。Zhang 等[12]的實驗結果顯示，在 –50 kPa、30 min/次、每天 2 次條件下，MSCs 的增殖受抑制，本實驗結果與其一致，其原因可能是負壓誘導造成了相對缺氧的培養環境。但 Zhu 等[13]研究發現在 –125 mm Hg 負壓條件下誘導 72 h 可促進 MSCs 增殖。我們認為造成這種差異的原因可能是負壓值、負壓誘導時間以及負壓吸入模式不同所致。
在成骨細胞生長分化的基質形成及成熟期以 ALP 活性升高和Ⅰ型膠原分泌為特征，ALP 是成骨細胞分化時所分泌的酶，被普遍認為是成骨細胞分化和功能的標志，能夠反映成骨細胞合成Ⅰ型膠原、形成骨基質的能力；OC 是由分化成熟的成骨細胞分泌的一種非膠原骨基質蛋白，在基質礦化期開始分泌，合成高峰與 ALP 活性高峰一致。故本實驗選擇Ⅰ型膠原、OC 及 ALP 作為檢測細胞成骨的指標。結果顯示，Ⅰ型膠原、OC 及 ALP 的表達隨負壓升高呈逐漸升高趨勢，說明 MSCs 的成骨活性隨負壓增高而逐漸增強。我們認為其原因主要有兩方面：其一為負壓條件下壓力作用于液面，從而對細胞產生的機械刺激；其二為負壓產生的相對缺氧環境。有學者認為機械力、細胞骨架和整合素三者相互作用可改變細胞形態，影響細胞增殖分化[14]。Gong 等[15]將 MSCs 置于動態可調的表面微槽中，研究發現機械應力能明顯影響細胞形狀；雷曉華等[16]認為改變機械應力會改變細胞生長和分化，從而影響細胞的形態和功能；Han 等[17]對細胞施加機械刺激后，發現其可促進細胞的骨向分化；高鶯等[18]對 MSCs 施加機械牽張力后，細胞 ALP 活性顯著增高，但不影響細胞增殖。而低氧條件也可促進 MSCs 成骨分化，Ding 等[19]研究發現，在低氧條件下短時間培養 MSCs 可抑制 Runx2 在 MSCs 的表達，但可使 MSCs 中 ALP 的表達增加，說明低氧可促進 MSCs 的成骨分化；Prado-Lòpez 等[20]也發現，在低氧環境下培養 MSCs 可促進 MSCs 的成骨與細胞基質的礦化。因而在負壓條件下對 MSCs 誘導成骨起主要作用的因素還有待進一步研究。
綜上述，負壓能夠促進 BMSCs 的成骨分化能力，在本實驗設定的 3 個負壓條件下，隨著壓力增高，BMSCs 成骨能力逐漸增強。這為今后將干細胞種植于具有良好組織相容性的生物支架材料并聯合負壓技術修復組織缺損提供了一種新的研究思路，也為臨床運用負壓技術治療骨折不愈合、先天性骨不連、良性骨腫瘤等骨缺損疾病提供了理論依據。另外，根據本實驗結果，我們認為當壓力在合適范圍內，MSCs 的成骨能力可逐漸增強；而當壓力過高或超出這一范圍，成骨能力可能會逐漸降低，但該結論是否準確以及其壓力范圍均有待進一步研究明確。
自 1993 年德國創傷外科醫生 Fleischmann 等[1]提出負壓技術以來，該技術已在臨床廣泛應用，并取得了良好療效。研究表明，負壓可促進創面局部微血管循環[2]、肉芽組織生長[3]、減輕組織水腫[4]，還可促進成纖維細胞、平滑肌細胞、單核細胞的增殖分化[5-6]。BMSCs 來源于中胚層，是一種具有多向分化潛能的未成熟細胞[7]，現已知 BMSCs 在特定條件下可分化為成骨細胞、軟骨細胞、肝細胞，從而參與創傷的修復[8-9]。有研究表明，短時間負壓誘導下可促進 BMSCs 成骨[10]，但目前負壓對干細胞成骨的研究多采用短時間、高強度負壓條件，對于長時間不同負壓對干細胞成骨的影響研究較少。本實驗通過研究長時間不同強度負壓對 BMSCs 誘導成骨分化的作用，為下一步將負壓用于治療骨缺損及加速骨折愈合研究提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4～6 月齡新西蘭大白兔 30 只，雌雄不限，體質量 1.5～2.0 kg，由石河子大學實驗動物中心提供。
L-DMEM 培養基、FBS、青/鏈霉素、胰蛋白酶（HyClone 公司，美國）；Ficoll 淋巴細胞分離液、2% 明膠（北京索萊寶科技有限公司）；鼠抗兔 CD34-FITC、CD44-PE、CD29-APC（Santa Cruze 公司，美國）；ALP 試劑盒（南京建成生物工程研究所）；抗Ⅰ型膠原抗體、抗骨鈣素（osteocalcin，OC）抗體（Abcam 公司，美國）；Trizol（Invitrogen 公司，美國）；First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo 公司，美國）；SYBR Green PCR Kit（Qiagen 公司，德國）。5% CO2 培養箱、酶標儀、實時熒光定量 PCR 儀（Thermo 公司，美國）；倒置顯微鏡（Leica 公司，德國）。
1.2 兔 BMSCs 分離、培養及鑒定
1.2.1 兔 BMSCs 分離、培養 取新西蘭大白兔 30 只，以 3% 戊巴比妥鈉（30 mg/kg）經耳緣靜脈注射麻醉，無菌條件下暴露一側股骨，用含 1 mL 肝素（3 000 U/mL）的 5 mL 注射器從股骨抽取 2～4 mL 骨髓，用無血清 DMEM 培養基懸浮；將細胞懸液緩慢加入 1.077 g/cm3 Ficoll 淋巴細胞分離液上部（細胞懸液與分離液比例為 2∶1），以離心半徑 14 cm、2 000 r/min 離心 20 min；小心吸取位于分離液中間的乳白色細胞層，移入另一離心管中，用無血清 DMEM 培養基重懸洗滌 2 次，以離心半徑 14 cm、1 500 r/min 離心 5 min 后用 3 mL 完全培養基（含 10%FBS 的 L-DMEM 培養液）接種于 60 mm 培養皿內，37℃、5%CO2 恒溫箱培養，每 48 小時換液 1 次。待細胞融合至 80%～90% 時，胰蛋白酶消化，倒置顯微鏡下觀察到細胞收縮、細胞間隙增大時終止消化，輕輕吹打細胞至細胞脫落；將細胞懸液移至另一無菌離心管內，以離心半徑 14 cm、800 r/min 離心 5 min；棄上清，加入完全培養基重懸細胞，按 1∶2 或 1∶3 比例接種于 60 mm 培養皿內，37℃、5%CO2 恒溫箱培養，每 48 小時換液 1 次，待細胞融合至 80%～90% 再次傳代培養。倒置顯微鏡觀察培養過程中細胞形態變化。
1.2.2 細胞鑒定 ① 流式細胞儀鑒定：取第 3 代細胞，胰蛋白酶消化后 PBS 洗 2 遍，用 PBS 調整細胞為 1×105～1×106 個，加入鼠抗兔 CD34-FITC、CD44-PE、CD29-APC，4℃ 避光孵育 20 min，PBS 洗 2 遍后，流式細胞儀檢測細胞表面標志物表達情況。② 成骨誘導鑒定：取第 3 代細胞，胰蛋白酶消化后，按 2×104 個/cm2 密度接種于包被 0.1% 明膠（將 2% 明膠用 PBS 稀釋至 0.1% 濃度）的 6 孔板中，每孔加入完全培養基，37℃、5%CO2 恒溫箱培養；當細胞融合達 60%～70% 時吸棄完全培養基，加入成骨誘導培養基（含 10%FBS、100 nmol/L 地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L 抗壞血酸的 L-DMEM 培養液）。誘導 14 d 后棄培養液，PBS 洗 3 遍，4% 多聚甲醛固定 30 min；吸棄多聚甲醛，PBS 洗 3 遍，加入茜素紅染液染色 5～10 min；吸棄茜素紅染液，PBS 洗 3 遍，倒置顯微鏡觀察。
1.3 實驗分組及方法
取第 3 代 BMSCs，按 1.2.2 中成骨誘導方法加入成骨誘導培養基，置入自制的負壓細胞培養盒，將培養盒與微型負壓儀用導管相聯。調節負壓儀，根據負壓壓力不同將實驗分為 3 組，負壓壓力分別為 0、75、150 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）（分別為對照組、低負壓組、高負壓組）；負壓時間為 30 min/h；每 48 小時換液 1 次。
1.4 觀測指標
1.4.1 細胞生長觀測 取第 3 代 BMSCs 按 4×104 個/cm2 密度接種于 12 孔板中，按 1.3 方法成骨誘導及分組后，于誘導 1～7 d 每天消化 3 孔細胞，采用細胞計數板計數法計數細胞，并繪制細胞生長曲線。
1.4.2 ALP 活性檢測 取第 3 代 BMSCs，胰蛋白酶消化后，按 2×104 個/cm2 密度接種于包被 0.1% 明膠的 6 孔板中，按 1.3 方法成骨誘導及分組后，于誘導 3、7、14 d 分別收集細胞培養液（n=9），按 ALP 試劑盒方法測定 520 nm 波長處吸光度（A）值。
1.4.3 實時熒光定量 PCR 檢測成骨相關基因表達 取第 3 代 BMSCs，胰蛋白酶消化后，按 2×104 個/cm2 密度接種于包被 0.1% 明膠的 6 孔板中，按 1.3 方法成骨誘導及分組后，于誘導 14 d 時采用 Trizol 提取細胞總 RNA，測試 RNA 樣本濃度和純度，取 200 ng RNA 樣本采用逆轉錄試劑盒合成 cDNA，加入 PCR 儀中進行擴增。擴增條件：95℃ 預變性 2 min，95℃ 變性 5 s，55℃ 退火 30 s，60℃ 延伸 10 s，40 個循環。采用實時熒光定量 PCR 分析程序分析 Ct 值，計算成骨相關基因Ⅰ型膠原、OC mRNA 相對表達量（2–ΔΔCt），以 β-actin 作為參照。各基因引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列及產物長度見表 1。
表1
實時熒光定量 PCR 相關基因引物序列及產物長度
Table1.
Primer sequences and product length for real-time fluorescence quantitative PCR
1.4.4 Western blot 檢測成骨相關蛋白表達 取第 3 代 BMSCs，胰蛋白酶消化后，按 2×104 個/cm2 密度接種于包被 0.1% 明膠的 6 孔板中，按 1.3 方法成骨誘導及分組后，于誘導 14 d 時提取細胞蛋白，變性處理后 –80℃ 保存蛋白樣本。10%SDS-PAGE 電泳，電轉膜將蛋白轉移至聚偏氟乙烯膜，一抗、二抗孵育后加入化學發光試劑顯示條帶，壓片，顯影采圖后用 Image J 分析Ⅰ型膠原、OC 蛋白相對表達量。
1.5 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 Bonferroni 法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs 形態學觀察及鑒定
倒置顯微鏡觀察示，原代細胞接種時多為圓形或橢圓形，5～6 h 后細胞貼壁呈橢圓形，可見少量梭形細胞；48 h 后初期貼壁細胞開始變形呈棒狀或梭形，4～6 d 后細胞快速增殖，形成分散的細胞集落；8～10 d 后細胞融合至 80%～90%，細胞呈梭形，魚群樣或漩渦樣生長。成骨誘導 7 d 后可見高密度區細胞逐漸向圓形成骨細胞分化，14 d 肉眼可見白色鈣結節；14 d 時茜素紅染色可見鈣結節紅染。見圖 1。
圖1
倒置顯微鏡觀察 BMSCs 形態 a. 原代細胞培養 10 d（×100）；b. 第 3 代細胞常規培養 7 d（×100）；c. 第 3 代細胞成骨誘導 7 d（×100）；d. 第 3 代細胞成骨誘導 14 d 茜素紅染色（×25）
Figure1.
Morphological observation of BMSCs under inverted microscope a. Primary cells cultured for 10 days (×100); b. The third passage cells cultured for 7 days (×100); c. The third passage cells cultured for 7 days after osteogenic induction (×100); d. Alizarin red staining of the third passage cells at 14 days after osteogenic induction (×25)
流式細胞儀鑒定示，所培養細胞高表達 BMSCs 表面抗原 CD44、CD29，低表達或不表達骨髓成纖維細胞、造血干細胞表面抗原 CD34。見圖 2。
圖2
流式細胞儀鑒定 BMSCs 表面標志物表達 a. CD44；b. CD29；c. CD34
Figure2.
Identification of BMSCs surface markers by flow cytometry a. CD44; b. CD29; c. CD34
2.2 細胞生長觀測
誘導 4 d，高負壓組細胞顯著少于對照組和低負壓組，差異有統計學意義（P<0.05）；低負壓組與對照組比較差異無統計學意義（P>0.05）。誘導 5～7 d，3 組間細胞數比較差異均有統計學意義（P<0.05），負壓越大細胞增殖受抑制越明顯。見圖 3。
圖3
各組細胞生長曲線
Figure3.
Cell growth curve of each group
2.3 ALP 活性檢測
隨誘導時間延長，各組 ALP 活性均有不同程度升高，除對照組誘導 3、7 d 間比較差異無統計學意義（P>0.05）外，其余各組組內各時間點間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。誘導 3 d，各組間 ALP 活性比較差異無統計學意義（P>0.05）；7 d，僅高負壓組 ALP 活性與對照組比較差異有統計學意義（P<0.05）；14 d，3 組間 ALP 活性比較差異均有統計學意義（P<0.05），負壓越大 ALP 活性越高。見表 2。
表2
誘導各時間點各組 ALP 活性比較（n=9，金氏單位/mL，
）
Table2.
Comparison of ALP activity between groups at different time points (n=9, King unit/mL,
)
2.4 實時熒光定量 PCR 檢測成骨相關基因表達
誘導 14 d，對照組、低負壓組及高負壓組Ⅰ型膠原 mRNA 相對表達量分別為 1.00±0.00、2.02±0.11、2.57±0.15，OC mRNA 相對表達量分別為 1.00±0.00、1.49±0.19、2.14±0.17。低負壓組及高負壓組Ⅰ型膠原和 OC mRNA 相對表達量均顯著高于對照組，高負壓組高于低負壓組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.5 Western blot 檢測成骨相關蛋白表達
誘導 14 d，對照組、低負壓組及高負壓組Ⅰ型膠原蛋白表達量分別為 0.69±0.04、0.90±0.03、1.10±0.04，OC 蛋白表達量分別為 0.67±0.04、0.88±0.04、1.09±0.04。低負壓組及高負壓組Ⅰ型膠原和 OC 蛋白表達量均顯著高于對照組，高負壓組高于低負壓組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
誘導 14 d Western blot 檢測各組成骨相關蛋白表達1：對照組；2：低負壓組；3：高負壓組
Figure4.
Osteogenic related protein expression in each group at 14 days after osteogenic induction by Western blot 1: Control group; 2: Low negative pressure group; 3: High negative pressure group
3 討論
負壓技術具有封閉創面、減輕水腫、減少細菌、增加血供、促進細胞增殖、促進肉芽組織生長等作用，從而促進創面愈合。目前對于負壓技術在骨外科的應用，尤其是骨折不愈合、先天性骨不連、良性骨腫瘤等伴有骨缺損疾病的報道較少見。BMSCs 作為一種成體干細胞，具有較強的自我復制能力和多向分化能力，是一種良好的組織工程種子細胞，為修復骨缺損提供了可能。有研究顯示高強度、短時間負壓可促進 MSCs 成骨分化[10]。我們推測當負壓強度與誘導時間在一定范圍內增加，細胞的成骨能力會增強。故基于既往相關研究[10-12]，本實驗旨在觀察長時間不同強度負壓對 BMSCs 成骨能力的影響，為將負壓技術用于骨外科提供一定理論依據。
本實驗以 BMSCs 誘導成骨為前提條件，在 3 種不同強度負壓下（0、75、150 mm Hg，30 min/h）進行成骨誘導培養，觀察 BMSCs 的生長、分化及誘導后成骨細胞的表型表達情況。結果顯示，在實驗設定的負壓下，隨負壓增高，BMSCs 的成骨活性及細胞增殖的抑制作用均增強。Zhang 等[12]的實驗結果顯示，在 –50 kPa、30 min/次、每天 2 次條件下，MSCs 的增殖受抑制，本實驗結果與其一致，其原因可能是負壓誘導造成了相對缺氧的培養環境。但 Zhu 等[13]研究發現在 –125 mm Hg 負壓條件下誘導 72 h 可促進 MSCs 增殖。我們認為造成這種差異的原因可能是負壓值、負壓誘導時間以及負壓吸入模式不同所致。
在成骨細胞生長分化的基質形成及成熟期以 ALP 活性升高和Ⅰ型膠原分泌為特征，ALP 是成骨細胞分化時所分泌的酶，被普遍認為是成骨細胞分化和功能的標志，能夠反映成骨細胞合成Ⅰ型膠原、形成骨基質的能力；OC 是由分化成熟的成骨細胞分泌的一種非膠原骨基質蛋白，在基質礦化期開始分泌，合成高峰與 ALP 活性高峰一致。故本實驗選擇Ⅰ型膠原、OC 及 ALP 作為檢測細胞成骨的指標。結果顯示，Ⅰ型膠原、OC 及 ALP 的表達隨負壓升高呈逐漸升高趨勢，說明 MSCs 的成骨活性隨負壓增高而逐漸增強。我們認為其原因主要有兩方面：其一為負壓條件下壓力作用于液面，從而對細胞產生的機械刺激；其二為負壓產生的相對缺氧環境。有學者認為機械力、細胞骨架和整合素三者相互作用可改變細胞形態，影響細胞增殖分化[14]。Gong 等[15]將 MSCs 置于動態可調的表面微槽中，研究發現機械應力能明顯影響細胞形狀；雷曉華等[16]認為改變機械應力會改變細胞生長和分化，從而影響細胞的形態和功能；Han 等[17]對細胞施加機械刺激后，發現其可促進細胞的骨向分化；高鶯等[18]對 MSCs 施加機械牽張力后，細胞 ALP 活性顯著增高，但不影響細胞增殖。而低氧條件也可促進 MSCs 成骨分化，Ding 等[19]研究發現，在低氧條件下短時間培養 MSCs 可抑制 Runx2 在 MSCs 的表達，但可使 MSCs 中 ALP 的表達增加，說明低氧可促進 MSCs 的成骨分化；Prado-Lòpez 等[20]也發現，在低氧環境下培養 MSCs 可促進 MSCs 的成骨與細胞基質的礦化。因而在負壓條件下對 MSCs 誘導成骨起主要作用的因素還有待進一步研究。
綜上述，負壓能夠促進 BMSCs 的成骨分化能力，在本實驗設定的 3 個負壓條件下，隨著壓力增高，BMSCs 成骨能力逐漸增強。這為今后將干細胞種植于具有良好組織相容性的生物支架材料并聯合負壓技術修復組織缺損提供了一種新的研究思路，也為臨床運用負壓技術治療骨折不愈合、先天性骨不連、良性骨腫瘤等骨缺損疾病提供了理論依據。另外，根據本實驗結果，我們認為當壓力在合適范圍內，MSCs 的成骨能力可逐漸增強；而當壓力過高或超出這一范圍，成骨能力可能會逐漸降低，但該結論是否準確以及其壓力范圍均有待進一步研究明確。
