引用本文： 鄒剛, 李豫皖, 金瑛, 朱喜忠, 楊繼濱, 王勝民, 尤奇, 熊華章, 劉毅. TGF-β1 聯合 VEGF 對人羊膜間充質干細胞向韌帶成纖維細胞體外分化作用的研究 . 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(5): 582-593. doi: 10.7507/1002-1892.201612090 復制
人前交叉韌帶（human anterior cruciate liga-ment，hACL）為致密結締組織，主要功能為限制脛骨前移、膝關節過伸、內外旋等活動；由于其股骨附著點面積較大，故常發生撕裂或斷裂損傷；韌帶組織血供較差，損傷后自行修復能力較弱[1]。隨著韌帶組織工程的發展，許多新興技術被用于動物體內實驗[2]。種子細胞、細胞生長因子以及支架是構建組織工程韌帶的三大要素[3-5]。其中，用于構建組織工程韌帶的種子細胞主要為韌帶或肌腱來源的韌帶成纖維細胞，但成體細胞體外擴增速度慢，細胞分泌膠原能力不能滿足組織工程韌帶的需求[6-7]。另一重要的種子細胞是 MSCs，其具有增殖能力強、免疫原性低、能定向遷徙以及成骨、成軟骨及成脂等多向分化能力[8-10]。目前研究已成功從各種成熟組織中分離出多種 MSCs，如 BMSCs、脂肪來源 MSCs、外周血來源 MSCs等[11-14]。人羊膜間充質干細胞（human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs）取自胎盤表層羊膜，取材時對人體無額外損傷，無倫理問題，而且細胞增殖速度快[15]。研究表明，hAMSCs 不僅增殖能力較 BMSCs 強，而且具有高純度、高豐度、高活力等特點[16-17]，同時也具有低免疫原性和多向分化潛能等干細胞特性。TGF-β1 屬于調節細胞生長及分化的 TGF-β 超家族，可使正常成纖維細胞表型發生轉化[18]，其不僅能促進成纖維細胞增殖生長，還可促進細胞外基質生成，如膠原蛋白、纖維連接蛋白（Fibronectin）的表達，抑制細胞外基質降解[19]。VEGF 是內皮細胞特異性促有絲分裂原[20]，在與血管內皮細胞膜上的受體結合后，能夠特異性地作用于血管內皮細胞，具有促進新生血管生成、增加血管通透性等作用，是公認的功能最強大、特異性最高的血管生成調節因子，在血管再生和軟組織再生過程中起重要調節作用[21]。本研究擬采用 TGF-β1 聯合 VEGF 體外誘導 hAMSCs 向韌帶成纖維細胞分化，探討 hAMSCs 作為構建組織工程韌帶種子細胞的可行性。報告如下。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
L-DMEM/F12 培養液（GIBCO 公司，美國）；胰蛋白酶、Ⅱ 型膠原酶（HyClone 公司，美國）；TGF-β1、VEGF（Protein-Tec 公司，美國）；細胞角蛋白-19（cytokeratin-19，CK-19）、波形蛋白抗體（北京索萊寶科技有限公司）；成骨、成軟骨、成脂分化培養基以及 Ⅰ 型膠原、Ⅲ 型膠原、Fibrone-ctin、細胞連接素（Tenascin-C）抗體（Abcam 公司，美國）；RNAiso Plus、轉錄試劑盒、熒光定量 PCR 試劑盒（Takara 公司，日本）。
FACS Calibur 流式細胞儀（Beckman 公司，美國）；核酸蛋白測量 NanoDrop-1000 儀、CO2 恒溫箱（Thermoscientific 公司，美國）；冷凍離心機（Eppendorf 公司，德國）；倒置相差顯微鏡、倒置熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）。
1.2 hAMSCs 分離、培養及鑒定
1.2.1 hAMSCs 分離及培養 實驗所用 3 個胎盤由遵義醫學院附屬醫院產科足月產產婦自愿捐贈，無其他基礎疾病，符合遵義醫學院附屬醫院倫理委員會要求。無菌環境下剝離胎盤胎兒面羊膜后，置于含有 D-Hank 液的廣口瓶中，4℃ 條件下轉至實驗室，D-Hank 液反復沖洗羊膜并用鈍性物輕刮羊膜表面；D-Hank 液再次沖洗羊膜，無菌剪將羊膜剪成大小為 1 mm×1 mm 的碎片，加入 2～3 倍羊膜體積的 0.05% EDTA-胰蛋白酶分別消化 40 min 和 30 min；D-Hank 液清洗后，加入與羊膜組織等體積的 0.8 g/L Ⅱ 型膠原酶，置入 37℃ 水浴箱中震蕩消化 1～2 h，至肉眼觀察不到羊膜碎片；300 目濾網過濾，收集細胞濾液，以離心半徑 25 cm、1 500 r/min 離心 6 min。棄去上清液，加入含 10% FBS、1×105 U/L 青霉素、1×105 U/L 鏈霉素、1% 非必需氨基酸的 L-DMEM/F12 培養基重懸細胞，以（1～3）×108 個/mL 密度接種于 75 cm2 培養瓶中，37℃、5% CO2 及飽和濕度培養箱培養。每 2～3 天更換 1 次培養基。
待細胞融合約 80% 時加入 0.125% 胰蛋白酶，于 37℃、5% CO2 及飽和濕度細胞培養箱中消化 4 min，使貼壁細胞脫落、變圓；然后加入等體積含 10% FBS 的 L-DMEM/F12 培養基終止消化，同上法離心 6 min；棄上清液，加入 1 mL L-DMEM/F12 培養基吹打重懸細胞；最后以 1.5×108 個/mL 濃度接種于 75 cm2 培養瓶中，傳至第 3 代進行以下實驗。倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長、融合程度，判斷細胞活性和增殖情況。
1.2.2 hAMSCs 鑒定 ① 流式細胞術鑒定 hAMSCs 表面標志物表達：取融合達 80% 以上的第 3 代 hAMSCs，棄培養液，PBS 清洗 2 次，加入 0.125% 胰蛋白酶-0.02% EDTA 消化液，于 37℃、5% CO2 及飽和濕度細胞培養箱內消化 5 min 后，加入等體積含 10% FBS 的 L-DMEM 培養基終止消化；將消化的細胞吹打混勻，同上法離心 6 min；棄上清，PBS 吹打重懸細胞，同上法離心 6 min，重復 2 次后調整細胞濃度至 2×109 個/mL，裝入流式管中；每管加入 100 μL 細胞懸液，室溫下避光分別加入鼠抗人單克隆抗體 CD44-PE、CD90-FITC、CD105-PerCP-Cy、CD73-APC 和陰性對照混合液 CD34-PE、CD19-PE、CD45-PE、CD11b-PE、HLA-DR，室溫避光孵育 30 min；每管均加入 2 mL PBS，充分震蕩，同上法離心 6 min；棄上清，加入 250 μL PBS 重懸細胞后行流式細胞儀鑒定，計算細胞表面抗原陽性率。
② 免疫熒光檢測 hAMSCs 細胞質中 CK-19 及波形蛋白表達：取密度為 1.5×105 個/mL 的第 3 代細胞懸液，接種于 6 孔板中培養，并在孔板中置入直徑 25 mm 含有多聚賴氨酸的細胞爬片；培養 7 d 后取出細胞爬片，37℃ 預熱的 PBS 清洗 3 次，每次 10 min；37℃、4% 多聚甲醛固定 30 min，PBS 清洗 3 次，每次 10 min；0.1% TritionX-100 37℃ 下透膜 15 min，PBS 清洗 3 次，每次 10 min；5% 牛血清白蛋白 37℃ 下封閉 30 min，甩干不清洗；加入一抗鼠抗人 CK-19 和波形蛋白單克隆抗體 100 μL，4℃ 冰箱內孵育過夜；PBS 清洗 3 次，每次 10 min；滴加 FITC 標記的羊抗鼠二抗 100 μL，37℃ 下避光孵育 1 h；D-PBS 清洗 3 次，每次 10 min；DAPI 染液復染細胞核 10 min，PBS 清洗 3 次，每次 10 min；抗熒光淬滅劑封片處理后，倒置熒光顯微鏡觀察兩種蛋白在細胞中的表達情況。
③ hAMSCs 成骨、成軟骨及成脂誘導分化鑒定：取第 3 代 hAMSCs，待細胞融合率至 50% 左右時，棄去培養液及未貼壁細胞，PBS 清洗 3 次；分別更換培養液為成骨、成軟骨和成脂誘導培養基，每隔 3 d 換液 1 次；培養至 14 d 時，成骨分化行茜素紅染色，成軟骨分化行甲苯胺藍染色，成脂分化行油紅 O 染色，倒置相差顯微鏡觀察染色結果。
1.3 觀測指標
1.3.1 細胞增殖-毒性檢測試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）檢測細胞增殖能力 取細胞融合率為 85% 的第 3 代 hAMSCs 分為兩組，實驗組使用成韌帶或纖維細胞誘導培養基（含 10% FBS、1×105 U/L 青霉素、100 mg/L 鏈霉素、10 μg/L TGF-β1 和 15 μg/L VEGF 的 L-DMEM/F12 培養基）換液，對照組使用普通培養基（含 10% FBS、1×105 U/L 青霉素、100 mg/L 鏈霉素的 L-DMEM/F12 培養基）換液。將細胞培養板置于 37℃、5% CO2 及飽和濕度細胞培養箱中培養 24 h 后，向孔中小心加入 10 μL CCK-8 溶液，于細胞培養箱中孵育 3 h，酶標儀測定波長為 450 nm 處的吸光度（A）值，每隔 24 h 測 1 次，連續測量 13 d，記錄數據并繪制細胞增殖曲線。
1.3.2 免疫熒光染色檢測細胞內蛋白表達情況 取第 3 代 hAMSCs 調整成密度為 1.5×105 個/mL 的細胞懸液，接種于 6 孔板中培養，并在孔板中置入直徑 25 mm 含有多聚賴氨酸的細胞爬片。同 1.3.1 方法分組，分別培養 5、10、15 d 后取出細胞爬片，參照上述細胞免疫熒光染色步驟操作，倒置熒光顯微鏡觀察 Ⅰ 型膠原、Ⅲ 型膠原、Fibronectin、Tenascin-C 在細胞中的表達情況。
1.3.3 實時熒光定量 PCR 檢測韌帶及血管生成相關基因表達 取融合率達 85%的第 3 代 hAMSCs 同 1.3.1 方法分組，分別培養 5、10、15 d 后取出細胞，PBS 洗 3 次，使用 RNAiso plus 試劑提取細胞總 RNA，反轉錄獲得 cDNA，進行 RT-PCR 反應。按照 PCR 試劑盒說明配置 PCR 反應體系；擴增條件：預變性 95℃、30 s，變性 95℃、5 s，退火 60℃、30 s。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列及產物長度見表 1。以 GAPDH 作為內參，通過 2–ΔΔCt法計算 Ⅰ 型膠原、Ⅲ 型膠原、Fibronectin、α-肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和 VEGF mRNA 的相對表達量。
表1
實時熒光定量 PCR 基因引物序列及產物長度
Table1.
The primer sequence and product length for real-time fluorescence quantitative PCR
1.4 統計學方法
采用 SPSS14.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組內各時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 hAMSCs 形態學觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，原代 hAMSCs 呈多角形或不規則形態，貼壁生長；傳代后細胞多呈長梭形，部分可見漩渦狀、魚群狀生長細胞。見圖 1。
圖1
hAMSCs 形態學觀察（倒置相差顯微鏡×40） a. 原代細胞；b. 第 1 代細胞；c. 第 2 代細胞；d. 第 3 代細胞
Figure1.
Morphology observation of hAMSCs (Inverted phase contrast microscope×40) a. Primary hAMSCs; b. The 1st generation of hAMSCs; c. The 2nd generation of hAMSCs; d. The 3rd generation of hAMSCs
細胞鑒定：① 流式細胞術檢測示，第 3 代 hAMSCs 高表達 CD73、CD90、CD105、CD44，低表達 CD34、CD19、CD45、CD11b、HLA-DR。見圖 2。② 免疫熒光染色觀察示，第 3 代 hAMSCs 波形蛋白表達呈陽性，CK-19 表達呈陰性，見圖 3。③ 第 3 代 hAMSCs 成骨誘導分化 14 d，茜素紅染色示細胞形成多個小圓形致密礦化結節，透光性差；成軟骨誘導分化 14 d，甲苯胺藍染色示細胞變短、消散，核漿比降低；成脂誘導分化 14 d，油紅 O 染色示細胞排列狀態紊亂，細胞由長梭形變圓并開始出現脂滴樣物質。見圖 4。
圖2
流式細胞儀檢測第 3 代 hAMSCs 表面標志物表達 a. CD90；b. CD105；c. CD73；d. CD44；e. CD45+CD19+CD34+CD11b+ HLA-DR
Figure2.
Phenotype molecule expression of the 3rd generation of hAMSCs by flow cytometry a. CD90; b. CD105; c. CD73; d. CD44; e. CD45+CD19+CD34+CD11b+HLA-DR
圖3
免疫熒光染色檢測第 3 代 hAMSCs 波形蛋白及 CK-19 表達（倒置熒光顯微鏡×100） a. 依次為波形蛋白、DAPI 染色及波形蛋白與 DAPI 融合；b. 依次為 CK-19、DAPI 染色及 CK-19 與 DAPI 融合
Figure3.
Expression of vimentin and CK-19 in the 3rd generation of hAMSCs by immunofluorescence staining (Inverted fluorescence microscope×100) a. In sequence of vimentin, DAPI staining, and merge of vimentin and DAPI; b. In sequence of CK-19, DPAI, and merge of CK-19 and DAPI
圖4
第 3 代 hAMSCs 成骨、成軟骨及成脂誘導分化 14 d 染色觀察（倒置熒光顯微鏡×100） a. 成骨誘導茜素紅染色；b. 成軟骨誘導甲苯胺藍染色；c. 成脂誘導油紅 O 染色
Figure4.
Morphology observation of the 3rd generation of hAMSCs after osteogenic, chondrogenic, and adipogenic induction (Inverted phase contrast microscope×100) a. Alizarin red staining after osteogenic induction; b. Toluidine blue staining after chondrogenic induction; c. Oil red O staining after adipogenic induction
2.2 CCK-8 法檢測細胞增殖能力
兩組細胞培養 7 d 時達對數增長期，9 d 時達增殖高峰，并基本維持增殖速率。實驗組培養 7 d 后各時間點A 值均顯著高于對照組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；且隨時間延長，增殖能力差異更明顯。見圖 5。
圖5
CCK-8 法檢測各組細胞增殖能力
Figure5.
Proliferation ability of cells in each group by CCK-8 method
2.3 免疫熒光染色檢測細胞內蛋白表達情況
2.3.1 Ⅰ 型膠原 對照組 Ⅰ 型膠原呈細胞質內分泌，蛋白表達相對較少；實驗組 Ⅰ 型膠原呈大片、網塊狀分布，熒光信號明顯。培養 5、10 d 時，兩組 Ⅰ 型膠原表達均無明顯改變，15 d 與 10 d 相比，對照組表達有一定程度增強，實驗組增強較明顯。實驗組培養 5、10、15 d 時 Ⅰ 型膠原表達染色均較對照組增強。見圖 6。
圖6
免疫熒光染色觀察各時間點各組細胞 Ⅰ 型膠原蛋白表達情況（倒置熒光顯微鏡×100） 從左至右依次為培養 5、10、15 d a. 對照組；b. 實驗組
Figure6.
Expression of collagen type I protein in each group at each time point by immunofluorescence staining (Inverted fluorescence microscope×100) From left to right for cells cultured for 5, 10, and 15 days a. Control group; b. Experimental group
2.3.2 Ⅲ 型膠原 對照組 Ⅲ 型膠原呈細胞質內分泌，蛋白表達水平較低；實驗組 Ⅲ 型膠原分泌呈現融合狀、片狀及網狀形態。對照組培養 10 d 時 Ⅲ 型膠原表達較 5 d 時增強，但 15 d 時無明顯改變；實驗組隨培養時間延長，Ⅲ 型膠原表達呈逐漸遞增趨勢。實驗組培養 5、10、15 d 時 Ⅲ 型膠原表達染色均較對照組增強。見圖 7。
圖7
免疫熒光染色觀察各時間點各組細胞 Ⅲ 型膠原蛋白表達情況（倒置熒光顯微鏡×100） 從左至右依次為培養 5、10、15 d a. 對照組；b. 實驗組
Figure7.
Expression of collagen type III protein in each group at each time point by immunofluorescence staining (Inverted fluorescence microscope×100) From left to right for cells cultured for 5, 10, and 15 days a. Control group; b. Experimental group
2.3.3 Fibronectin 對照組 Fibronectin 呈細胞質內分泌，少量蛋白分泌至細胞外，細胞之間蛋白連接較少；實驗組則觀察到融合呈片、塊狀及網狀的蛋白。對照組培養 10 d 時可觀察到 Fibronectin 表達較 5 d 時增強，但 15 d 時無明顯改變；實驗組隨培養時間延長，Fibronectin 蛋白表達呈逐漸遞增趨勢。實驗組培養 5、15 d 時 Fibronectin 蛋白表達染色明顯較對照組增強，但培養 10 d 時兩組無明顯差異。見圖 8。
圖8
免疫熒光染色觀察各時間點各組細胞 Fibronectin 蛋白表達情況（倒置熒光顯微鏡×100） 從左至右依次為培養 5、10、15 da. 對照組；b. 實驗組
Figure8.
Expression of Fibronectin protein in each group at each time point by immunofluorescence staining (Inverted fluorescence microscope×100) From left to right for cells cultured for 5, 10, and 15 days a. Control group; b. Experimental group
2.3.4 Tenascin-C 兩組細胞 Tenascin-C 均呈胞外分泌，對照組 Tenascin-C 分泌呈較小片狀分布、絲狀排列，且順序紊亂，細胞間蛋白連接程度較低，熒光強度較弱；實驗組 Tenascin-C 分泌呈云霧狀、大片狀，胞內、外均有分布。對照組培養 5、10 d Tenascin-C 表達無明顯變化；15 d 較 5、10 d 表達有明顯增強。實驗組培養 10 d 時 Tenascin-C 表達較 5 d 時明顯增強，但 15 d 時無明顯變化。實驗組培養 5、10、15 d 時 Tenascin-C 表達染色均較對照組增強。見圖 9。
圖9
免疫熒光染色觀察各時間點各組細胞 Tenascin-C 蛋白表達情況（倒置熒光顯微鏡×100） 從左至右依次為培養 5、10、15 d a. 對照組；b. 實驗組
Figure9.
Expression of Tenascin-C protein in each group at each time point by immunofluorescence staining (Inverted fluorescence microscope×100) From left to right for cells cultured for 5, 10, and 15 days a. Control group; b. Experimental group
2.4 實時熒光定量 PCR 檢測韌帶及血管生成相關基因表達
2.4.1 Ⅰ 型膠原 組內比較：對照組各時間點 Ⅰ 型膠原 mRNA 相對表達量比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；實驗組 Ⅰ 型膠原 mRNA 相對表達量隨時間延長逐漸上調，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。組間比較：培養 5 d 時實驗組 Ⅰ 型膠原 mRNA 相對表達量與對照組比較，差異無統計學意義（t=1.197，P=0.297）；10、15 d 時顯著高于對照組，比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表 2。
表2
培養各時間點各組
Ⅰ 型膠原 mRNA 相對表達量比較（n=3，
）
Table2.
Comparison of relative collagen type I mRNA expressions between groups at each time point (n=3,
)
2.4.2 Ⅲ 型膠原 組內比較：對照組各時間點 Ⅲ 型膠原 mRNA 相對表達量比較，差異均無統計學意義（P>0.05），15 d 時相對表達量略低于 10 d 時；實驗組 Ⅲ 型膠原 mRNA 相對表達量隨時間延長逐漸上調，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。組間比較：培養 5 d 時兩組 Ⅲ 型膠原 mRNA 相對表達量比較，差異無統計學意義（t=0.347，P=0.746）；10、15 d 時實驗組明顯高于對照組，比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表 3。
表3
培養各時間點各組
Ⅲ 型膠原 mRNA 相對表達量比較（n=3，
）
Table3.
Comparison of relative collagen type III mRNA expressions between groups at each time point (n=3,
)
2.4.3 Fibronectin 組內比較：對照組培養 10 d 時 Fibronectin mRNA 相對表達量較 5 d 時略有增加，15 d 時無明顯變化，各時間點間比較差異均無統計學意義（P>0.05）；實驗組 Fibronectin mRNA 相對表達量隨時間延長逐漸上調，各時間點間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。組間比較：培養各時間點實驗組 Fibronectin mRNA 相對表達量均明顯高于對照組，比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表 4。
表4
培養各時間點各組 Fibronectin mRNA 相對表達量比較（n=3，
）
Table4.
Comparison of relative Fibronectin mRNA expressions between groups at each time point (n=3,
)
2.4.4 α-SMA 組內比較：兩組 α-SMA mRNA 相對表達量隨培養時間延長均逐漸上調，但對照組各時間點間比較差異無統計學意義（P>0.05），實驗組各時間點間比較差異有統計學意義（P<0.05）。組間比較：培養各時間點，實驗組 α-SMA mRNA 相對表達量均明顯高于對照組，比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表 5。
表5
培養各時間點各組 α-SMA mRNA 相對表達量比較（n=3，
）
Table5.
Comparison of relative α-SMA mRNA expressions between groups at each time point (n=3,
)
2.4.5 VEGF 組內比較：對照組各時間點 VEGF mRNA 相對表達量比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；實驗組 VEGF mRNA 相對表達量隨培養時間延長逐漸上調，各時間點間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。組間比較：培養 5 d 時，對照組 VEGF mRNA 相對表達量高于實驗組，但差異無統計學意義（t=0.421，P=0.696）；但 10、15 d 時實驗組 VEGF mRNA 相對表達量顯著高于對照組，比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表 6。
表6
培養各時間點各組 VEGF mRNA 相對表達量比較（n=3，
）
Table6.
Comparison of relative VEGF mRNA expressions between groups at each time point (n=3,
)
3 討論
膝關節韌帶組織工程是以生物材料與再生醫學為基礎，目的在于種子細胞經生長因子作用后具有相應的生物活性及組織相容性，促進 ACL 的修復與再生，為膝關節 ACL 損傷提供了新型治療模式。構建組織工程韌帶的首要任務是篩選種子細胞[22]，目前種子細胞來源廣泛，其中成體干細胞中的 MSCs，尤其以 BMSCs 為代表，具有體外增殖能力強、經誘導后可向多種細胞分化的功能[23-24]，是目前極具有臨床應用前景的組織工程種子細胞[25]。hAMSCs 來源于中胚層，取自廢棄的羊膜，通過酶消化法獲得，hAMSCs 與 BMSCs 均具有類似的生物學特性[26-27]。獲取 hAMSCs 的方法對人體無額外創傷，不存在倫理道德方面爭議；既往研究顯示，hAMSCs 的增殖能力優于 BMSCs[28]。目前，hAMSCs 已普遍應用于人體結締組織相關損傷，如軟骨、骨、肌腱、韌帶、神經系統疾病及多種軟組織損傷疾病的體內外研究[29-32]。本研究按照國際細胞治療協會的 MSCs 鑒定標準[33]，對 hAMSCs 流式表型分子進行分析，結果顯示第 3 代 hAMSCs 高表達 CD44、CD90、CD105、CD73，且不表達 CD34、CD19、CD45、CD11b 及 HLA-DR，說明 hAMSCs 具有 MSCs 的表型特征。此外，hAMSCs 低表達免疫因子 CD14 及主要組織相容性 Ⅱ 類抗原 HLA-DR，說明 hAMSCs 免疫原性較低，不引起同種或異種淋巴細胞增殖反應，作為組織工程細胞來源或用于組織、器官損傷修復時引起免疫排斥反應風險低。由于在原代細胞獲取過程中容易混雜人羊膜上皮細胞，CK-19 和波形蛋白分別作為人羊膜上皮細胞和 hAMSCs 的特異性表達分子，所以我們選擇對 CK-19 和波形蛋白表達進行檢測，以評價分離培養細胞的純度。本研究結果顯示，第 3 代 hAMSCs 高表達波形蛋白，低表達 CK-19，說明培養的 hAMSCs 符合實驗對細胞的純度要求。
本研究結果提示，經 TGF-β1、VEGF 聯合誘導后，實驗組細胞增殖以及韌帶相關特異性蛋白 Ⅰ 型膠原、Ⅲ 型膠原、Fibronectin、Tenascin-C 的表達較對照組明顯增強；說明 TGF-β1 與 VEGF 聯合使用可誘導體外 hAMSCs 向韌帶成纖維細胞分化，并且在誘導分化過程中，TGF-β1 和 VEGF 對細胞形態、蛋白分泌方面起促進作用。近年研究顯示，TGF-β1 是一種屬于 TGF 家族的生長性多肽分子，除了在細胞增殖、凋亡和分化方面起調節作用，還可增加細胞外基質合成[34-37]。Hara 等[38]發現經活化后的 TGF-β1 可通過 Smad 信號通路刺激并動員 MSCs 向肌腱細胞分化。Farhat 等[39]研究表明 TGF-β1 促進屈肌肌腱愈合，它是通過誘導纖溶酶原激活物抑制劑 1，抑制纖溶酶介導的基質金屬蛋白酶 2 活性，來降低瘢痕組織粘連，促進瘢痕組織的修復和屈肌肌腱的再生。前交叉韌帶重建術后患者通常需要長時間恢復，由于支配韌帶的血管叢較少，因此 VEGF 在移植后血管重建中起重要作用。Chen 等[40]研究觀察了透明質酸鈉載 VEGF165 藥物對兔膝關節前交叉韌帶移植重建術后血管重建的作用，結果顯示使用 VEGF 組重建術后韌帶微血管密度明顯高于對照組，并且韌帶最大拉伸負荷也顯著升高。說明 VEGF 可提高前交叉韌帶重建術后早期血運重建及生物力學特性的恢復。本研究實時熒光定量 PCR 結果顯示，實驗組培養 10、15 d 時 Ⅰ 型膠原、Ⅲ 型膠原、Fibronectin、α-SMA 和 VEGF mRNA 相對表達量均高于對照組（P<0.05）。因此我們認為 hAMSCs 經 TGF-β1 和 VEGF 聯合誘導后可向韌帶成纖維細胞分化，且在 VEGF 作用下，韌帶細胞的血管修復能力得到一定程度提高。
綜上述，hAMSCs 表達 MSCs 特異性分子，具有低免疫原性和較高增殖能力，可作為組織工程韌帶種子細胞來源。經 TGF-β1 聯合 VEGF 體外誘導后，韌帶成纖維細胞相關特異性基因表達上調、蛋白合成增高，同時血管生成相關基因表達也顯著增加。但 hAMSCs 搭載于支架材料后的生物相容性以及植入體內后的生物力學、成韌帶能力等，有待進一步實驗研究。
人前交叉韌帶（human anterior cruciate liga-ment，hACL）為致密結締組織，主要功能為限制脛骨前移、膝關節過伸、內外旋等活動；由于其股骨附著點面積較大，故常發生撕裂或斷裂損傷；韌帶組織血供較差，損傷后自行修復能力較弱[1]。隨著韌帶組織工程的發展，許多新興技術被用于動物體內實驗[2]。種子細胞、細胞生長因子以及支架是構建組織工程韌帶的三大要素[3-5]。其中，用于構建組織工程韌帶的種子細胞主要為韌帶或肌腱來源的韌帶成纖維細胞，但成體細胞體外擴增速度慢，細胞分泌膠原能力不能滿足組織工程韌帶的需求[6-7]。另一重要的種子細胞是 MSCs，其具有增殖能力強、免疫原性低、能定向遷徙以及成骨、成軟骨及成脂等多向分化能力[8-10]。目前研究已成功從各種成熟組織中分離出多種 MSCs，如 BMSCs、脂肪來源 MSCs、外周血來源 MSCs等[11-14]。人羊膜間充質干細胞（human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs）取自胎盤表層羊膜，取材時對人體無額外損傷，無倫理問題，而且細胞增殖速度快[15]。研究表明，hAMSCs 不僅增殖能力較 BMSCs 強，而且具有高純度、高豐度、高活力等特點[16-17]，同時也具有低免疫原性和多向分化潛能等干細胞特性。TGF-β1 屬于調節細胞生長及分化的 TGF-β 超家族，可使正常成纖維細胞表型發生轉化[18]，其不僅能促進成纖維細胞增殖生長，還可促進細胞外基質生成，如膠原蛋白、纖維連接蛋白（Fibronectin）的表達，抑制細胞外基質降解[19]。VEGF 是內皮細胞特異性促有絲分裂原[20]，在與血管內皮細胞膜上的受體結合后，能夠特異性地作用于血管內皮細胞，具有促進新生血管生成、增加血管通透性等作用，是公認的功能最強大、特異性最高的血管生成調節因子，在血管再生和軟組織再生過程中起重要調節作用[21]。本研究擬采用 TGF-β1 聯合 VEGF 體外誘導 hAMSCs 向韌帶成纖維細胞分化，探討 hAMSCs 作為構建組織工程韌帶種子細胞的可行性。報告如下。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
L-DMEM/F12 培養液（GIBCO 公司，美國）；胰蛋白酶、Ⅱ 型膠原酶（HyClone 公司，美國）；TGF-β1、VEGF（Protein-Tec 公司，美國）；細胞角蛋白-19（cytokeratin-19，CK-19）、波形蛋白抗體（北京索萊寶科技有限公司）；成骨、成軟骨、成脂分化培養基以及 Ⅰ 型膠原、Ⅲ 型膠原、Fibrone-ctin、細胞連接素（Tenascin-C）抗體（Abcam 公司，美國）；RNAiso Plus、轉錄試劑盒、熒光定量 PCR 試劑盒（Takara 公司，日本）。
FACS Calibur 流式細胞儀（Beckman 公司，美國）；核酸蛋白測量 NanoDrop-1000 儀、CO2 恒溫箱（Thermoscientific 公司，美國）；冷凍離心機（Eppendorf 公司，德國）；倒置相差顯微鏡、倒置熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）。
1.2 hAMSCs 分離、培養及鑒定
1.2.1 hAMSCs 分離及培養 實驗所用 3 個胎盤由遵義醫學院附屬醫院產科足月產產婦自愿捐贈，無其他基礎疾病，符合遵義醫學院附屬醫院倫理委員會要求。無菌環境下剝離胎盤胎兒面羊膜后，置于含有 D-Hank 液的廣口瓶中，4℃ 條件下轉至實驗室，D-Hank 液反復沖洗羊膜并用鈍性物輕刮羊膜表面；D-Hank 液再次沖洗羊膜，無菌剪將羊膜剪成大小為 1 mm×1 mm 的碎片，加入 2～3 倍羊膜體積的 0.05% EDTA-胰蛋白酶分別消化 40 min 和 30 min；D-Hank 液清洗后，加入與羊膜組織等體積的 0.8 g/L Ⅱ 型膠原酶，置入 37℃ 水浴箱中震蕩消化 1～2 h，至肉眼觀察不到羊膜碎片；300 目濾網過濾，收集細胞濾液，以離心半徑 25 cm、1 500 r/min 離心 6 min。棄去上清液，加入含 10% FBS、1×105 U/L 青霉素、1×105 U/L 鏈霉素、1% 非必需氨基酸的 L-DMEM/F12 培養基重懸細胞，以（1～3）×108 個/mL 密度接種于 75 cm2 培養瓶中，37℃、5% CO2 及飽和濕度培養箱培養。每 2～3 天更換 1 次培養基。
待細胞融合約 80% 時加入 0.125% 胰蛋白酶，于 37℃、5% CO2 及飽和濕度細胞培養箱中消化 4 min，使貼壁細胞脫落、變圓；然后加入等體積含 10% FBS 的 L-DMEM/F12 培養基終止消化，同上法離心 6 min；棄上清液，加入 1 mL L-DMEM/F12 培養基吹打重懸細胞；最后以 1.5×108 個/mL 濃度接種于 75 cm2 培養瓶中，傳至第 3 代進行以下實驗。倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長、融合程度，判斷細胞活性和增殖情況。
1.2.2 hAMSCs 鑒定 ① 流式細胞術鑒定 hAMSCs 表面標志物表達：取融合達 80% 以上的第 3 代 hAMSCs，棄培養液，PBS 清洗 2 次，加入 0.125% 胰蛋白酶-0.02% EDTA 消化液，于 37℃、5% CO2 及飽和濕度細胞培養箱內消化 5 min 后，加入等體積含 10% FBS 的 L-DMEM 培養基終止消化；將消化的細胞吹打混勻，同上法離心 6 min；棄上清，PBS 吹打重懸細胞，同上法離心 6 min，重復 2 次后調整細胞濃度至 2×109 個/mL，裝入流式管中；每管加入 100 μL 細胞懸液，室溫下避光分別加入鼠抗人單克隆抗體 CD44-PE、CD90-FITC、CD105-PerCP-Cy、CD73-APC 和陰性對照混合液 CD34-PE、CD19-PE、CD45-PE、CD11b-PE、HLA-DR，室溫避光孵育 30 min；每管均加入 2 mL PBS，充分震蕩，同上法離心 6 min；棄上清，加入 250 μL PBS 重懸細胞后行流式細胞儀鑒定，計算細胞表面抗原陽性率。
② 免疫熒光檢測 hAMSCs 細胞質中 CK-19 及波形蛋白表達：取密度為 1.5×105 個/mL 的第 3 代細胞懸液，接種于 6 孔板中培養，并在孔板中置入直徑 25 mm 含有多聚賴氨酸的細胞爬片；培養 7 d 后取出細胞爬片，37℃ 預熱的 PBS 清洗 3 次，每次 10 min；37℃、4% 多聚甲醛固定 30 min，PBS 清洗 3 次，每次 10 min；0.1% TritionX-100 37℃ 下透膜 15 min，PBS 清洗 3 次，每次 10 min；5% 牛血清白蛋白 37℃ 下封閉 30 min，甩干不清洗；加入一抗鼠抗人 CK-19 和波形蛋白單克隆抗體 100 μL，4℃ 冰箱內孵育過夜；PBS 清洗 3 次，每次 10 min；滴加 FITC 標記的羊抗鼠二抗 100 μL，37℃ 下避光孵育 1 h；D-PBS 清洗 3 次，每次 10 min；DAPI 染液復染細胞核 10 min，PBS 清洗 3 次，每次 10 min；抗熒光淬滅劑封片處理后，倒置熒光顯微鏡觀察兩種蛋白在細胞中的表達情況。
③ hAMSCs 成骨、成軟骨及成脂誘導分化鑒定：取第 3 代 hAMSCs，待細胞融合率至 50% 左右時，棄去培養液及未貼壁細胞，PBS 清洗 3 次；分別更換培養液為成骨、成軟骨和成脂誘導培養基，每隔 3 d 換液 1 次；培養至 14 d 時，成骨分化行茜素紅染色，成軟骨分化行甲苯胺藍染色，成脂分化行油紅 O 染色，倒置相差顯微鏡觀察染色結果。
1.3 觀測指標
1.3.1 細胞增殖-毒性檢測試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）檢測細胞增殖能力 取細胞融合率為 85% 的第 3 代 hAMSCs 分為兩組，實驗組使用成韌帶或纖維細胞誘導培養基（含 10% FBS、1×105 U/L 青霉素、100 mg/L 鏈霉素、10 μg/L TGF-β1 和 15 μg/L VEGF 的 L-DMEM/F12 培養基）換液，對照組使用普通培養基（含 10% FBS、1×105 U/L 青霉素、100 mg/L 鏈霉素的 L-DMEM/F12 培養基）換液。將細胞培養板置于 37℃、5% CO2 及飽和濕度細胞培養箱中培養 24 h 后，向孔中小心加入 10 μL CCK-8 溶液，于細胞培養箱中孵育 3 h，酶標儀測定波長為 450 nm 處的吸光度（A）值，每隔 24 h 測 1 次，連續測量 13 d，記錄數據并繪制細胞增殖曲線。
1.3.2 免疫熒光染色檢測細胞內蛋白表達情況 取第 3 代 hAMSCs 調整成密度為 1.5×105 個/mL 的細胞懸液，接種于 6 孔板中培養，并在孔板中置入直徑 25 mm 含有多聚賴氨酸的細胞爬片。同 1.3.1 方法分組，分別培養 5、10、15 d 后取出細胞爬片，參照上述細胞免疫熒光染色步驟操作，倒置熒光顯微鏡觀察 Ⅰ 型膠原、Ⅲ 型膠原、Fibronectin、Tenascin-C 在細胞中的表達情況。
1.3.3 實時熒光定量 PCR 檢測韌帶及血管生成相關基因表達 取融合率達 85%的第 3 代 hAMSCs 同 1.3.1 方法分組，分別培養 5、10、15 d 后取出細胞，PBS 洗 3 次，使用 RNAiso plus 試劑提取細胞總 RNA，反轉錄獲得 cDNA，進行 RT-PCR 反應。按照 PCR 試劑盒說明配置 PCR 反應體系；擴增條件：預變性 95℃、30 s，變性 95℃、5 s，退火 60℃、30 s。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列及產物長度見表 1。以 GAPDH 作為內參，通過 2–ΔΔCt法計算 Ⅰ 型膠原、Ⅲ 型膠原、Fibronectin、α-肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和 VEGF mRNA 的相對表達量。
表1
實時熒光定量 PCR 基因引物序列及產物長度
Table1.
The primer sequence and product length for real-time fluorescence quantitative PCR
1.4 統計學方法
采用 SPSS14.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組內各時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 hAMSCs 形態學觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，原代 hAMSCs 呈多角形或不規則形態，貼壁生長；傳代后細胞多呈長梭形，部分可見漩渦狀、魚群狀生長細胞。見圖 1。
圖1
hAMSCs 形態學觀察（倒置相差顯微鏡×40） a. 原代細胞；b. 第 1 代細胞；c. 第 2 代細胞；d. 第 3 代細胞
Figure1.
Morphology observation of hAMSCs (Inverted phase contrast microscope×40) a. Primary hAMSCs; b. The 1st generation of hAMSCs; c. The 2nd generation of hAMSCs; d. The 3rd generation of hAMSCs
細胞鑒定：① 流式細胞術檢測示，第 3 代 hAMSCs 高表達 CD73、CD90、CD105、CD44，低表達 CD34、CD19、CD45、CD11b、HLA-DR。見圖 2。② 免疫熒光染色觀察示，第 3 代 hAMSCs 波形蛋白表達呈陽性，CK-19 表達呈陰性，見圖 3。③ 第 3 代 hAMSCs 成骨誘導分化 14 d，茜素紅染色示細胞形成多個小圓形致密礦化結節，透光性差；成軟骨誘導分化 14 d，甲苯胺藍染色示細胞變短、消散，核漿比降低；成脂誘導分化 14 d，油紅 O 染色示細胞排列狀態紊亂，細胞由長梭形變圓并開始出現脂滴樣物質。見圖 4。
圖2
流式細胞儀檢測第 3 代 hAMSCs 表面標志物表達 a. CD90；b. CD105；c. CD73；d. CD44；e. CD45+CD19+CD34+CD11b+ HLA-DR
Figure2.
Phenotype molecule expression of the 3rd generation of hAMSCs by flow cytometry a. CD90; b. CD105; c. CD73; d. CD44; e. CD45+CD19+CD34+CD11b+HLA-DR
圖3
免疫熒光染色檢測第 3 代 hAMSCs 波形蛋白及 CK-19 表達（倒置熒光顯微鏡×100） a. 依次為波形蛋白、DAPI 染色及波形蛋白與 DAPI 融合；b. 依次為 CK-19、DAPI 染色及 CK-19 與 DAPI 融合
Figure3.
Expression of vimentin and CK-19 in the 3rd generation of hAMSCs by immunofluorescence staining (Inverted fluorescence microscope×100) a. In sequence of vimentin, DAPI staining, and merge of vimentin and DAPI; b. In sequence of CK-19, DPAI, and merge of CK-19 and DAPI
圖4
第 3 代 hAMSCs 成骨、成軟骨及成脂誘導分化 14 d 染色觀察（倒置熒光顯微鏡×100） a. 成骨誘導茜素紅染色；b. 成軟骨誘導甲苯胺藍染色；c. 成脂誘導油紅 O 染色
Figure4.
Morphology observation of the 3rd generation of hAMSCs after osteogenic, chondrogenic, and adipogenic induction (Inverted phase contrast microscope×100) a. Alizarin red staining after osteogenic induction; b. Toluidine blue staining after chondrogenic induction; c. Oil red O staining after adipogenic induction
2.2 CCK-8 法檢測細胞增殖能力
兩組細胞培養 7 d 時達對數增長期，9 d 時達增殖高峰，并基本維持增殖速率。實驗組培養 7 d 后各時間點A 值均顯著高于對照組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；且隨時間延長，增殖能力差異更明顯。見圖 5。
圖5
CCK-8 法檢測各組細胞增殖能力
Figure5.
Proliferation ability of cells in each group by CCK-8 method
2.3 免疫熒光染色檢測細胞內蛋白表達情況
2.3.1 Ⅰ 型膠原 對照組 Ⅰ 型膠原呈細胞質內分泌，蛋白表達相對較少；實驗組 Ⅰ 型膠原呈大片、網塊狀分布，熒光信號明顯。培養 5、10 d 時，兩組 Ⅰ 型膠原表達均無明顯改變，15 d 與 10 d 相比，對照組表達有一定程度增強，實驗組增強較明顯。實驗組培養 5、10、15 d 時 Ⅰ 型膠原表達染色均較對照組增強。見圖 6。
圖6
免疫熒光染色觀察各時間點各組細胞 Ⅰ 型膠原蛋白表達情況（倒置熒光顯微鏡×100） 從左至右依次為培養 5、10、15 d a. 對照組；b. 實驗組
Figure6.
Expression of collagen type I protein in each group at each time point by immunofluorescence staining (Inverted fluorescence microscope×100) From left to right for cells cultured for 5, 10, and 15 days a. Control group; b. Experimental group
2.3.2 Ⅲ 型膠原 對照組 Ⅲ 型膠原呈細胞質內分泌，蛋白表達水平較低；實驗組 Ⅲ 型膠原分泌呈現融合狀、片狀及網狀形態。對照組培養 10 d 時 Ⅲ 型膠原表達較 5 d 時增強，但 15 d 時無明顯改變；實驗組隨培養時間延長，Ⅲ 型膠原表達呈逐漸遞增趨勢。實驗組培養 5、10、15 d 時 Ⅲ 型膠原表達染色均較對照組增強。見圖 7。
圖7
免疫熒光染色觀察各時間點各組細胞 Ⅲ 型膠原蛋白表達情況（倒置熒光顯微鏡×100） 從左至右依次為培養 5、10、15 d a. 對照組；b. 實驗組
Figure7.
Expression of collagen type III protein in each group at each time point by immunofluorescence staining (Inverted fluorescence microscope×100) From left to right for cells cultured for 5, 10, and 15 days a. Control group; b. Experimental group
2.3.3 Fibronectin 對照組 Fibronectin 呈細胞質內分泌，少量蛋白分泌至細胞外，細胞之間蛋白連接較少；實驗組則觀察到融合呈片、塊狀及網狀的蛋白。對照組培養 10 d 時可觀察到 Fibronectin 表達較 5 d 時增強，但 15 d 時無明顯改變；實驗組隨培養時間延長，Fibronectin 蛋白表達呈逐漸遞增趨勢。實驗組培養 5、15 d 時 Fibronectin 蛋白表達染色明顯較對照組增強，但培養 10 d 時兩組無明顯差異。見圖 8。
圖8
免疫熒光染色觀察各時間點各組細胞 Fibronectin 蛋白表達情況（倒置熒光顯微鏡×100） 從左至右依次為培養 5、10、15 da. 對照組；b. 實驗組
Figure8.
Expression of Fibronectin protein in each group at each time point by immunofluorescence staining (Inverted fluorescence microscope×100) From left to right for cells cultured for 5, 10, and 15 days a. Control group; b. Experimental group
2.3.4 Tenascin-C 兩組細胞 Tenascin-C 均呈胞外分泌，對照組 Tenascin-C 分泌呈較小片狀分布、絲狀排列，且順序紊亂，細胞間蛋白連接程度較低，熒光強度較弱；實驗組 Tenascin-C 分泌呈云霧狀、大片狀，胞內、外均有分布。對照組培養 5、10 d Tenascin-C 表達無明顯變化；15 d 較 5、10 d 表達有明顯增強。實驗組培養 10 d 時 Tenascin-C 表達較 5 d 時明顯增強，但 15 d 時無明顯變化。實驗組培養 5、10、15 d 時 Tenascin-C 表達染色均較對照組增強。見圖 9。
圖9
免疫熒光染色觀察各時間點各組細胞 Tenascin-C 蛋白表達情況（倒置熒光顯微鏡×100） 從左至右依次為培養 5、10、15 d a. 對照組；b. 實驗組
Figure9.
Expression of Tenascin-C protein in each group at each time point by immunofluorescence staining (Inverted fluorescence microscope×100) From left to right for cells cultured for 5, 10, and 15 days a. Control group; b. Experimental group
2.4 實時熒光定量 PCR 檢測韌帶及血管生成相關基因表達
2.4.1 Ⅰ 型膠原 組內比較：對照組各時間點 Ⅰ 型膠原 mRNA 相對表達量比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；實驗組 Ⅰ 型膠原 mRNA 相對表達量隨時間延長逐漸上調，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。組間比較：培養 5 d 時實驗組 Ⅰ 型膠原 mRNA 相對表達量與對照組比較，差異無統計學意義（t=1.197，P=0.297）；10、15 d 時顯著高于對照組，比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表 2。
表2
培養各時間點各組
Ⅰ 型膠原 mRNA 相對表達量比較（n=3，
）
Table2.
Comparison of relative collagen type I mRNA expressions between groups at each time point (n=3,
)
2.4.2 Ⅲ 型膠原 組內比較：對照組各時間點 Ⅲ 型膠原 mRNA 相對表達量比較，差異均無統計學意義（P>0.05），15 d 時相對表達量略低于 10 d 時；實驗組 Ⅲ 型膠原 mRNA 相對表達量隨時間延長逐漸上調，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。組間比較：培養 5 d 時兩組 Ⅲ 型膠原 mRNA 相對表達量比較，差異無統計學意義（t=0.347，P=0.746）；10、15 d 時實驗組明顯高于對照組，比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表 3。
表3
培養各時間點各組
Ⅲ 型膠原 mRNA 相對表達量比較（n=3，
）
Table3.
Comparison of relative collagen type III mRNA expressions between groups at each time point (n=3,
)
2.4.3 Fibronectin 組內比較：對照組培養 10 d 時 Fibronectin mRNA 相對表達量較 5 d 時略有增加，15 d 時無明顯變化，各時間點間比較差異均無統計學意義（P>0.05）；實驗組 Fibronectin mRNA 相對表達量隨時間延長逐漸上調，各時間點間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。組間比較：培養各時間點實驗組 Fibronectin mRNA 相對表達量均明顯高于對照組，比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表 4。
表4
培養各時間點各組 Fibronectin mRNA 相對表達量比較（n=3，
）
Table4.
Comparison of relative Fibronectin mRNA expressions between groups at each time point (n=3,
)
2.4.4 α-SMA 組內比較：兩組 α-SMA mRNA 相對表達量隨培養時間延長均逐漸上調，但對照組各時間點間比較差異無統計學意義（P>0.05），實驗組各時間點間比較差異有統計學意義（P<0.05）。組間比較：培養各時間點，實驗組 α-SMA mRNA 相對表達量均明顯高于對照組，比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表 5。
表5
培養各時間點各組 α-SMA mRNA 相對表達量比較（n=3，
）
Table5.
Comparison of relative α-SMA mRNA expressions between groups at each time point (n=3,
)
2.4.5 VEGF 組內比較：對照組各時間點 VEGF mRNA 相對表達量比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；實驗組 VEGF mRNA 相對表達量隨培養時間延長逐漸上調，各時間點間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。組間比較：培養 5 d 時，對照組 VEGF mRNA 相對表達量高于實驗組，但差異無統計學意義（t=0.421，P=0.696）；但 10、15 d 時實驗組 VEGF mRNA 相對表達量顯著高于對照組，比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表 6。
表6
培養各時間點各組 VEGF mRNA 相對表達量比較（n=3，
）
Table6.
Comparison of relative VEGF mRNA expressions between groups at each time point (n=3,
)
3 討論
膝關節韌帶組織工程是以生物材料與再生醫學為基礎，目的在于種子細胞經生長因子作用后具有相應的生物活性及組織相容性，促進 ACL 的修復與再生，為膝關節 ACL 損傷提供了新型治療模式。構建組織工程韌帶的首要任務是篩選種子細胞[22]，目前種子細胞來源廣泛，其中成體干細胞中的 MSCs，尤其以 BMSCs 為代表，具有體外增殖能力強、經誘導后可向多種細胞分化的功能[23-24]，是目前極具有臨床應用前景的組織工程種子細胞[25]。hAMSCs 來源于中胚層，取自廢棄的羊膜，通過酶消化法獲得，hAMSCs 與 BMSCs 均具有類似的生物學特性[26-27]。獲取 hAMSCs 的方法對人體無額外創傷，不存在倫理道德方面爭議；既往研究顯示，hAMSCs 的增殖能力優于 BMSCs[28]。目前，hAMSCs 已普遍應用于人體結締組織相關損傷，如軟骨、骨、肌腱、韌帶、神經系統疾病及多種軟組織損傷疾病的體內外研究[29-32]。本研究按照國際細胞治療協會的 MSCs 鑒定標準[33]，對 hAMSCs 流式表型分子進行分析，結果顯示第 3 代 hAMSCs 高表達 CD44、CD90、CD105、CD73，且不表達 CD34、CD19、CD45、CD11b 及 HLA-DR，說明 hAMSCs 具有 MSCs 的表型特征。此外，hAMSCs 低表達免疫因子 CD14 及主要組織相容性 Ⅱ 類抗原 HLA-DR，說明 hAMSCs 免疫原性較低，不引起同種或異種淋巴細胞增殖反應，作為組織工程細胞來源或用于組織、器官損傷修復時引起免疫排斥反應風險低。由于在原代細胞獲取過程中容易混雜人羊膜上皮細胞，CK-19 和波形蛋白分別作為人羊膜上皮細胞和 hAMSCs 的特異性表達分子，所以我們選擇對 CK-19 和波形蛋白表達進行檢測，以評價分離培養細胞的純度。本研究結果顯示，第 3 代 hAMSCs 高表達波形蛋白，低表達 CK-19，說明培養的 hAMSCs 符合實驗對細胞的純度要求。
本研究結果提示，經 TGF-β1、VEGF 聯合誘導后，實驗組細胞增殖以及韌帶相關特異性蛋白 Ⅰ 型膠原、Ⅲ 型膠原、Fibronectin、Tenascin-C 的表達較對照組明顯增強；說明 TGF-β1 與 VEGF 聯合使用可誘導體外 hAMSCs 向韌帶成纖維細胞分化，并且在誘導分化過程中，TGF-β1 和 VEGF 對細胞形態、蛋白分泌方面起促進作用。近年研究顯示，TGF-β1 是一種屬于 TGF 家族的生長性多肽分子，除了在細胞增殖、凋亡和分化方面起調節作用，還可增加細胞外基質合成[34-37]。Hara 等[38]發現經活化后的 TGF-β1 可通過 Smad 信號通路刺激并動員 MSCs 向肌腱細胞分化。Farhat 等[39]研究表明 TGF-β1 促進屈肌肌腱愈合，它是通過誘導纖溶酶原激活物抑制劑 1，抑制纖溶酶介導的基質金屬蛋白酶 2 活性，來降低瘢痕組織粘連，促進瘢痕組織的修復和屈肌肌腱的再生。前交叉韌帶重建術后患者通常需要長時間恢復，由于支配韌帶的血管叢較少，因此 VEGF 在移植后血管重建中起重要作用。Chen 等[40]研究觀察了透明質酸鈉載 VEGF165 藥物對兔膝關節前交叉韌帶移植重建術后血管重建的作用，結果顯示使用 VEGF 組重建術后韌帶微血管密度明顯高于對照組，并且韌帶最大拉伸負荷也顯著升高。說明 VEGF 可提高前交叉韌帶重建術后早期血運重建及生物力學特性的恢復。本研究實時熒光定量 PCR 結果顯示，實驗組培養 10、15 d 時 Ⅰ 型膠原、Ⅲ 型膠原、Fibronectin、α-SMA 和 VEGF mRNA 相對表達量均高于對照組（P<0.05）。因此我們認為 hAMSCs 經 TGF-β1 和 VEGF 聯合誘導后可向韌帶成纖維細胞分化，且在 VEGF 作用下，韌帶細胞的血管修復能力得到一定程度提高。
綜上述，hAMSCs 表達 MSCs 特異性分子，具有低免疫原性和較高增殖能力，可作為組織工程韌帶種子細胞來源。經 TGF-β1 聯合 VEGF 體外誘導后，韌帶成纖維細胞相關特異性基因表達上調、蛋白合成增高，同時血管生成相關基因表達也顯著增加。但 hAMSCs 搭載于支架材料后的生物相容性以及植入體內后的生物力學、成韌帶能力等，有待進一步實驗研究。
