引用本文： 高尚, 唐康來, 張吉強, 李跑, 楊志金, 崔海峰, 楊明宇, 唐紅, 周梅. 不同強度跑臺訓練對大鼠跟腱微損傷修復影響的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(5): 574-581. doi: 10.7507/1002-1892.201611054 復制
肌腱微損傷是肌腱微觀結構的破壞，表現為肌腱纖維變形、分離、斷裂，常由反復過度牽拉引起[1-2]。由于細胞外基質等因素改變，肌腱微損傷后得不到有效修復，最終出現局部腫痛、功能障礙等肌腱病表現[3]。目前臨床上采用的促進肌腱修復方法主要包括非甾體類抗炎藥物治療、離心性牽伸訓練、生物工程治療以及超聲、沖擊波理療等[4-8]，但是由于肌腱損傷修復機制尚不清楚，各種治療手段均有其局限性。
運動作為一種促進肌腱修復的方法，其有效性已在大量研究中得到了證實[8-11]。與其他治療方法相比，運動療法具有簡單易行、創傷小、成本低等優點。但目前有關運動強度對肌腱修復影響的研究較少。為此，本研究通過組織學和生物力學觀察不同強度運動對大鼠跟腱微損傷修復的影響，為闡明運動促進肌腱損傷修復的機制提供實驗依據。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
8 周齡雄性 SD 大鼠 72 只，體質量 200～250 g，由第三軍醫大學實驗動物中心提供；實驗前所有大鼠均進行為期 1 周的適應性跑臺訓練。Ⅰ型膠原酶（Sigma 公司，美國），采用 PBS 配制成濃度為 10 mg/mL 的溶液。計算機控制動物實驗跑臺（安徽正華生物儀器設備有限公司）；微機控制電子萬能試驗機（深圳瑞格爾儀器有限公司）；光學顯微鏡（Olympus 公司，日本）；游標卡尺（精確度 0.02 mm；哈爾濱量具刃具有限公司）。
1.2 大鼠跟腱微損傷模型制備
參照 Dirks 等[12]的方法制備大鼠跟腱微損傷模型。72 只大鼠經吸入麻醉后，用 5 號針頭經皮在距離腱-骨連接部 2 mm 處的雙側跟腱內，注射濃度為 10 mg/mL 的Ⅰ型膠原酶溶液 30 μL。注射后飼養 1 周，待急性炎性反應期結束后[12-13]進行分組干預。
為驗證模型制備方法有效性，本研究進行了預實驗。分別于大鼠右側跟腱注射濃度為 10 mg/mL 的Ⅰ型膠原酶溶液 30 μL（實驗側），左側注射等量 PBS 溶液（對照側）。注射后 1 周，大體觀察見與對照側相比，實驗側跟腱腱旁組織增生明顯，跟腱缺乏光澤；HE 染色示實驗側跟腱纖維排列紊亂、斷裂，異常形態細胞增生明顯。實驗側符合肌腱微損傷特征，提示模型制備成功。見圖 1、2。
圖1
預實驗跟腱大體觀察 左側：對照側；右側：實驗側
Figure1.
Gross observation of Achilles tendons in pre-experiment Leftside: control side; Right side: experimental side
圖2
預實驗跟腱 HE 染色觀察 a. 對照側（×100）；b. 對照側（×200）；c. 實驗側（×100）；d. 實驗側（×200）
Figure2.
HE staining of Achilles tendons in pre-experiment a. Control side (×100); b. Control side (×200); c. Experimental side (×100); d. Experimental side (×200)
1.3 實驗分組及方法
模型制備后，將 72 只大鼠隨機分為 3 組，分別為對照組、低強度組、高強度組，每組 24 只。對照組大鼠正常飼養，可自由活動。低、高強度組采用計算機控制動物實驗跑臺對大鼠進行被動跑臺訓練；低強度組跑臺強度為 13 m/min、20 min/d[14]，高強度組跑臺強度為 17 m/min、60 min/d[15-16]。于被動跑臺訓練開始即刻及 1、4 周[17]，每組各取 8 只大鼠，給予 CO2 處死后完整取出雙側跟腱；其中，3 只大鼠跟腱行組織學觀察，5 只大鼠跟腱行生物力學測試。
1.4 觀測指標
1.4.1 一般情況 觀察各組大鼠存活以及肢體運動情況。
1.4.2 大體觀察 各時間點處死大鼠后，作雙側跟腱正中縱切口，肉眼觀察跟腱光澤度以及腱旁組織增生情況。
1.4.3 組織學觀察 將跟腱標本置于 4% 多聚甲醛溶液固定 24 h，石蠟包埋，于腱-骨聯合近端 2 mm 處沿跟腱縱軸切片，片厚 5 μm，HE 染色，鏡下觀察組織學變化。采用 Dirks 等[12]的半定量評分方法：在偏光鏡下選擇病理表現最嚴重區域，對以下參數進行評分：① 纖維排列（100 倍鏡下觀察 1 個區域）；② 細胞形態（200 倍鏡下觀察 4 個區域）；③ 細胞異常增多（100 倍鏡下觀察 1 個區域）；④ 新生血管量（400 倍鏡下觀察 10 個區域）。每個參數采用 4 級評分：0 分，正常；1 分，輕度異常；2 分，中度異常；3 分，重度異常。以上 4 個參數評分總和為 0～12 分，其中 0 分代表正常肌腱組織，12 分代表最嚴重的異常肌腱組織。每個樣本均由 2 名獨立實驗員進行評分，取均值。
1.4.4 生物力學測試 取標本切斷跟骨及比目魚肌-腓腸肌中段，保留完整跟腱組織。去除跖肌腱及跟腱周圍組織后，用游標卡尺測量跟腱寬度和厚度，并通過橢圓形公式計算其橫截面積。將標本固定于電子萬能試驗機上，樣本兩端應用定制夾具固定，夾具表面具有橫行突起以防止標本滑脫。以 20 mm/min 速度牽拉跟腱，至跟腱斷裂停止。記錄整個過程中負荷值變化、最終應力，并繪制應力-應變曲線。計算抗拉強度（最終應力/橫截面積）以及彈性模量（由應力-應變曲線初始點對應的切線斜率計算得出[18]）。
1.5 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
所有大鼠均存活至實驗結束。注射后各組大鼠后肢均有跛行，1 周后步態異常明顯減輕。在跑臺訓練過程中，各組大鼠均可自由活動，組間肢體活動頻率和活動幅度未見明顯差異。
2.2 大體觀察
訓練開始即刻及 1 周時，各組跟腱標本均表現為腱旁結締組織增生、肌腱組織顏色暗淡缺乏光澤，組間無明顯差異。4 周時，低強度組腱旁增生組織較對照組明顯減少；高強度組腱旁結締組織較低強度組多，并且有大量新生血管形成。見圖 3。
圖3
各組跟腱大體觀察 從左至右分別為對照組、低強度組、高強度組 a. 被動跑臺訓練 1 周；b. 被動跑臺訓練 4 周
Figure3.
The gross observations of Achilles tendons in each group From left to right for the control group, the low-intensity group, and the high-intensity group, respectively a. Passive treadmill training for 1 week; b. Passive treadmill training for 4 weeks
2.3 組織學觀察
2.3.1 鏡下觀察 訓練開始即刻時，各組跟腱組織纖維排列出現波浪狀紊亂，部分纖維斷裂，細胞明顯增多，部分細胞核變圓。1 周時，各組跟腱組織纖維排列紊亂程度較訓練開始時好轉，但有明顯纖維間隙和斷裂，異常細胞明顯增多。4 周時，各組觀察情況差異明顯；對照組跟腱組織纖維仍有部分波浪狀紊亂，但異常細胞較前減少；低強度組跟腱組織纖維排列整齊致密，大部分細胞核呈梭形；高強度組仍有較明顯的纖維間隙和較多異常細胞。見圖 4、5。
圖4
被動跑臺訓練 1 周時各組跟腱HE染色觀察 從左至右放大倍數分別為 40、100、200 倍 a. 對照組；b. 低強度組；c. 高強度組
Figure4.
The observations of Achilles tendon by HE staining in each group after passive treadmill training for 1 week From left to right for 40, 100, and 200 times, respectively a. Control group; b. Low-intensity group; c. High-intensity group
圖5
被動跑臺訓練 4 周時各組跟腱HE染色觀察 從左至右放大倍數分別為 40、100、200 倍 a. 對照組；b. 低強度組；c. 高強度組
Figure5.
The observations of Achilles tendon by HE staining in each group after passive treadmill training for 4 weeks From left to right for 40, 100, and 200 times, respectively a. Control group; b. Low-intensity group; c. High-intensity group
2.3.2 半定量評分 訓練開始即刻，各組纖維排列、細胞形態、細胞異常增多、新生血管量評分以及總分比較，差異均無統計學意義（P>0.05），提示各組跟腱微損傷模型損傷程度相似，具有可比性。見表 1。
表1
各組訓練開始即刻及 1、4 周時組織學染色評分比較（n=3，
）
Table1.
Comparison of histological staining scores between groups at immediate, 1 week, and 4 weeks after training (n=3,
)
訓練 1 周時，組織學評分總分比較：各組間差異無統計學意義（P>0.05）。組織學特征參數比較：低、高強度組除新生血管量評分與對照組比較，差異有統計學意義（P<0.05）外；其余參數與對照組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。低、高強度組間各參數比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
訓練 4 周時，組織學評分總分比較：高強度組明顯高于對照組、低強度組，對照組顯著高于低強度組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。組織學特征參數比較：低強度組纖維排列、細胞形態、細胞異常增多、新生血管量評分與對照組、高強度組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；而高強度組僅細胞異常增多評分與對照組比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
2.4 生物力學測試
訓練開始即刻及 1 周時，各組跟腱橫截面積、最終應力、抗拉強度及彈性模量比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。4 周時，低強度組最終應力及抗拉強度較對照組明顯升高，最終應力及彈性模量較高強度組明顯升高，比較差異有統計學意義（P<0.05）；其余各指標組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 6。
圖6
各組生物力學測試 a. 跟腱橫截面積；b. 最終應力；c. 抗拉強度；d. 彈性模量
Figure6.
Biomechanical testing of Achilles tendons in each group a. Cross sectional area; b. Ultimate force; c. Tensile strength; d. Elastic modulus
3 討論
研究表明，不同運動強度對肌腱損傷修復過程的影響亦不同[19]。一方面，運動可以促進膠原蛋白合成，防止肌腱退變[20]；另一方面，過度運動會促進金屬蛋白酶釋放，導致膠原蛋白破壞[21]。因此，明確有助于肌腱微損傷修復的運動強度是進一步研究肌腱修復機制的前提。
各種實驗動物的運動能力不同，其肌腱對運動的適應能力也不同。以實驗室常用的大鼠為例，不同運動強度對其肌腱生理功能的影響仍存在爭議。Soslowsky 等[22]利用被動下坡跑臺誘導大鼠岡上肌腱形成肌腱病；Glazebrook 等[15]利用上坡高強度被動跑臺使大鼠跟腱出現了類似于人類肌腱病的組織病理學表現。但是 Heinemeier 等[16]同樣采用上坡高強度被動跑臺方法卻未能誘導出大鼠跟腱病理學改變，并且他們認為大鼠適應了這種運動強度，跟腱的生物力學特性得到了增強。另外，Dirks 等[23]對高運動能力大鼠進行高強度跑臺訓練，但也未成功誘導出大鼠跟腱病理變化。Godbout 等[24]認為早期自主運動不能促進膠原酶誘導的 Wistar 大鼠跟腱微損傷愈合，Dirks 等[12]則認為高強度跑臺訓練不會加劇高運動能力大鼠跟腱的損傷。
為了闡明不同強度跑臺訓練對大鼠跟腱微損傷修復的影響，本實驗參照上述研究方法，選擇高強度（17 m/min、60 min/d）[15-16]及低強度（13 m/min、20 min/d）[14]被動跑臺訓練作為影響因素，觀察不同運動強度對已存在的跟腱微損傷修復的影響。關于觀測時間的選擇，Lui 等[13]研究表明，大鼠跟腱注射膠原酶溶液后 3 d 出現白細胞浸潤炎性反應，7 d 后恢復至正常水平；Dirks 等[12]的研究選擇注射膠原酶溶液后 9 d 左右炎性期結束時進行后續實驗；同時，結合膠原酶誘導的大鼠跟腱微損傷模型具有自愈能力，本研究最終選擇膠原酶溶液注射后 1 周進行干預。
本研究結果顯示，訓練 1 周后，各組跟腱組織在外觀、病理學表現、生物力學方面未出現顯著變化。但 4 周時各組間差異明顯，其中低強度組跟腱組織在外觀、病理學表現及生物力學方面均較對照組有明顯改善，提示低強度（13m/min、20 min/d）被動跑臺訓練可以有效促進肌腱微損傷的修復，該結果與 Zhang 等[14]的研究結果一致，其研究發現該運動強度也能促進老齡大鼠損傷髕腱的修復。而高強度組大鼠跟腱組織不僅在生物力學方面與對照組無統計學差異，大體觀察及組織學觀察還發現，該強度跑臺訓練后在一定程度上延遲甚至阻礙了跟腱微損傷的修復，具體表現為腱旁組織增生、組織病理學評分更差。該結果與 Dirks 等[12]發現高強度跑臺未加劇膠原酶誘導的跟腱病理變化不一致，可能與其使用的實驗動物為經篩選后的高運動能力大鼠有關。
另外，我們發現跑臺訓練對微損傷肌腱的影響表現為新生血管增多、細胞增多，且該影響隨時間延長而逐漸增大，并持續至實驗結束。提示運動療法可能是通過某些途徑加速了跟腱組織的代謝能力，促進了局部細胞增殖、分化或者募集，以達到修復損傷跟腱組織的目的。2007 年 Bi 等[25]發現了存在于肌腱中的祖細胞——肌腱干細胞，并認為其在肌腱修復過程中起重要作用。之后學者們對機械應力條件下肌腱干細胞特性的變化進行了相關研究。Zhang 等[17]發現在適度牽拉條件下，可以有效促進肌腱干細胞向成肌腱方向分化，通過對小鼠跑臺訓練發現肌腱的成肌腱成分較成骨、成軟骨、成肌腱等異常分化方向明顯減少。提示運動不僅會影響肌腱組織，同時可能也影響肌腱干細胞，從而促進了損傷肌腱的修復。Rui 等[26]發現膠原酶誘導的微損傷肌腱中，肌腱干細胞分化傾向發生了變化。因此通過進一步研究運動是否會影響細胞外基質，導致肌腱干細胞募集、增殖、分化的改變，是否糾正了受損肌腱干細胞的分化以及其修復機制，有望明確運動對肌腱微損傷修復的影響。
綜上述，不同強度跑臺訓練對于膠原酶誘導的大鼠跟腱微損傷修復的影響也不同，低強度運動可以在一定程度上促進微損傷肌腱的修復，但具體作用機制還需進一步深入研究。另外，本研究也存在一定局限性，考慮到大鼠跟腱微損傷模型具有自愈性，本研究僅進行了 4 周跑臺訓練，觀察時間較短；另外，研究僅設置了 2 個跑臺強度，因此需要針對不同實驗動物選擇更多運動強度進行干預觀察。
肌腱微損傷是肌腱微觀結構的破壞，表現為肌腱纖維變形、分離、斷裂，常由反復過度牽拉引起[1-2]。由于細胞外基質等因素改變，肌腱微損傷后得不到有效修復，最終出現局部腫痛、功能障礙等肌腱病表現[3]。目前臨床上采用的促進肌腱修復方法主要包括非甾體類抗炎藥物治療、離心性牽伸訓練、生物工程治療以及超聲、沖擊波理療等[4-8]，但是由于肌腱損傷修復機制尚不清楚，各種治療手段均有其局限性。
運動作為一種促進肌腱修復的方法，其有效性已在大量研究中得到了證實[8-11]。與其他治療方法相比，運動療法具有簡單易行、創傷小、成本低等優點。但目前有關運動強度對肌腱修復影響的研究較少。為此，本研究通過組織學和生物力學觀察不同強度運動對大鼠跟腱微損傷修復的影響，為闡明運動促進肌腱損傷修復的機制提供實驗依據。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
8 周齡雄性 SD 大鼠 72 只，體質量 200～250 g，由第三軍醫大學實驗動物中心提供；實驗前所有大鼠均進行為期 1 周的適應性跑臺訓練。Ⅰ型膠原酶（Sigma 公司，美國），采用 PBS 配制成濃度為 10 mg/mL 的溶液。計算機控制動物實驗跑臺（安徽正華生物儀器設備有限公司）；微機控制電子萬能試驗機（深圳瑞格爾儀器有限公司）；光學顯微鏡（Olympus 公司，日本）；游標卡尺（精確度 0.02 mm；哈爾濱量具刃具有限公司）。
1.2 大鼠跟腱微損傷模型制備
參照 Dirks 等[12]的方法制備大鼠跟腱微損傷模型。72 只大鼠經吸入麻醉后，用 5 號針頭經皮在距離腱-骨連接部 2 mm 處的雙側跟腱內，注射濃度為 10 mg/mL 的Ⅰ型膠原酶溶液 30 μL。注射后飼養 1 周，待急性炎性反應期結束后[12-13]進行分組干預。
為驗證模型制備方法有效性，本研究進行了預實驗。分別于大鼠右側跟腱注射濃度為 10 mg/mL 的Ⅰ型膠原酶溶液 30 μL（實驗側），左側注射等量 PBS 溶液（對照側）。注射后 1 周，大體觀察見與對照側相比，實驗側跟腱腱旁組織增生明顯，跟腱缺乏光澤；HE 染色示實驗側跟腱纖維排列紊亂、斷裂，異常形態細胞增生明顯。實驗側符合肌腱微損傷特征，提示模型制備成功。見圖 1、2。
圖1
預實驗跟腱大體觀察 左側：對照側；右側：實驗側
Figure1.
Gross observation of Achilles tendons in pre-experiment Leftside: control side; Right side: experimental side
圖2
預實驗跟腱 HE 染色觀察 a. 對照側（×100）；b. 對照側（×200）；c. 實驗側（×100）；d. 實驗側（×200）
Figure2.
HE staining of Achilles tendons in pre-experiment a. Control side (×100); b. Control side (×200); c. Experimental side (×100); d. Experimental side (×200)
1.3 實驗分組及方法
模型制備后，將 72 只大鼠隨機分為 3 組，分別為對照組、低強度組、高強度組，每組 24 只。對照組大鼠正常飼養，可自由活動。低、高強度組采用計算機控制動物實驗跑臺對大鼠進行被動跑臺訓練；低強度組跑臺強度為 13 m/min、20 min/d[14]，高強度組跑臺強度為 17 m/min、60 min/d[15-16]。于被動跑臺訓練開始即刻及 1、4 周[17]，每組各取 8 只大鼠，給予 CO2 處死后完整取出雙側跟腱；其中，3 只大鼠跟腱行組織學觀察，5 只大鼠跟腱行生物力學測試。
1.4 觀測指標
1.4.1 一般情況 觀察各組大鼠存活以及肢體運動情況。
1.4.2 大體觀察 各時間點處死大鼠后，作雙側跟腱正中縱切口，肉眼觀察跟腱光澤度以及腱旁組織增生情況。
1.4.3 組織學觀察 將跟腱標本置于 4% 多聚甲醛溶液固定 24 h，石蠟包埋，于腱-骨聯合近端 2 mm 處沿跟腱縱軸切片，片厚 5 μm，HE 染色，鏡下觀察組織學變化。采用 Dirks 等[12]的半定量評分方法：在偏光鏡下選擇病理表現最嚴重區域，對以下參數進行評分：① 纖維排列（100 倍鏡下觀察 1 個區域）；② 細胞形態（200 倍鏡下觀察 4 個區域）；③ 細胞異常增多（100 倍鏡下觀察 1 個區域）；④ 新生血管量（400 倍鏡下觀察 10 個區域）。每個參數采用 4 級評分：0 分，正常；1 分，輕度異常；2 分，中度異常；3 分，重度異常。以上 4 個參數評分總和為 0～12 分，其中 0 分代表正常肌腱組織，12 分代表最嚴重的異常肌腱組織。每個樣本均由 2 名獨立實驗員進行評分，取均值。
1.4.4 生物力學測試 取標本切斷跟骨及比目魚肌-腓腸肌中段，保留完整跟腱組織。去除跖肌腱及跟腱周圍組織后，用游標卡尺測量跟腱寬度和厚度，并通過橢圓形公式計算其橫截面積。將標本固定于電子萬能試驗機上，樣本兩端應用定制夾具固定，夾具表面具有橫行突起以防止標本滑脫。以 20 mm/min 速度牽拉跟腱，至跟腱斷裂停止。記錄整個過程中負荷值變化、最終應力，并繪制應力-應變曲線。計算抗拉強度（最終應力/橫截面積）以及彈性模量（由應力-應變曲線初始點對應的切線斜率計算得出[18]）。
1.5 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
所有大鼠均存活至實驗結束。注射后各組大鼠后肢均有跛行，1 周后步態異常明顯減輕。在跑臺訓練過程中，各組大鼠均可自由活動，組間肢體活動頻率和活動幅度未見明顯差異。
2.2 大體觀察
訓練開始即刻及 1 周時，各組跟腱標本均表現為腱旁結締組織增生、肌腱組織顏色暗淡缺乏光澤，組間無明顯差異。4 周時，低強度組腱旁增生組織較對照組明顯減少；高強度組腱旁結締組織較低強度組多，并且有大量新生血管形成。見圖 3。
圖3
各組跟腱大體觀察 從左至右分別為對照組、低強度組、高強度組 a. 被動跑臺訓練 1 周；b. 被動跑臺訓練 4 周
Figure3.
The gross observations of Achilles tendons in each group From left to right for the control group, the low-intensity group, and the high-intensity group, respectively a. Passive treadmill training for 1 week; b. Passive treadmill training for 4 weeks
2.3 組織學觀察
2.3.1 鏡下觀察 訓練開始即刻時，各組跟腱組織纖維排列出現波浪狀紊亂，部分纖維斷裂，細胞明顯增多，部分細胞核變圓。1 周時，各組跟腱組織纖維排列紊亂程度較訓練開始時好轉，但有明顯纖維間隙和斷裂，異常細胞明顯增多。4 周時，各組觀察情況差異明顯；對照組跟腱組織纖維仍有部分波浪狀紊亂，但異常細胞較前減少；低強度組跟腱組織纖維排列整齊致密，大部分細胞核呈梭形；高強度組仍有較明顯的纖維間隙和較多異常細胞。見圖 4、5。
圖4
被動跑臺訓練 1 周時各組跟腱HE染色觀察 從左至右放大倍數分別為 40、100、200 倍 a. 對照組；b. 低強度組；c. 高強度組
Figure4.
The observations of Achilles tendon by HE staining in each group after passive treadmill training for 1 week From left to right for 40, 100, and 200 times, respectively a. Control group; b. Low-intensity group; c. High-intensity group
圖5
被動跑臺訓練 4 周時各組跟腱HE染色觀察 從左至右放大倍數分別為 40、100、200 倍 a. 對照組；b. 低強度組；c. 高強度組
Figure5.
The observations of Achilles tendon by HE staining in each group after passive treadmill training for 4 weeks From left to right for 40, 100, and 200 times, respectively a. Control group; b. Low-intensity group; c. High-intensity group
2.3.2 半定量評分 訓練開始即刻，各組纖維排列、細胞形態、細胞異常增多、新生血管量評分以及總分比較，差異均無統計學意義（P>0.05），提示各組跟腱微損傷模型損傷程度相似，具有可比性。見表 1。
表1
各組訓練開始即刻及 1、4 周時組織學染色評分比較（n=3，
）
Table1.
Comparison of histological staining scores between groups at immediate, 1 week, and 4 weeks after training (n=3,
)
訓練 1 周時，組織學評分總分比較：各組間差異無統計學意義（P>0.05）。組織學特征參數比較：低、高強度組除新生血管量評分與對照組比較，差異有統計學意義（P<0.05）外；其余參數與對照組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。低、高強度組間各參數比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
訓練 4 周時，組織學評分總分比較：高強度組明顯高于對照組、低強度組，對照組顯著高于低強度組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。組織學特征參數比較：低強度組纖維排列、細胞形態、細胞異常增多、新生血管量評分與對照組、高強度組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；而高強度組僅細胞異常增多評分與對照組比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
2.4 生物力學測試
訓練開始即刻及 1 周時，各組跟腱橫截面積、最終應力、抗拉強度及彈性模量比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。4 周時，低強度組最終應力及抗拉強度較對照組明顯升高，最終應力及彈性模量較高強度組明顯升高，比較差異有統計學意義（P<0.05）；其余各指標組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 6。
圖6
各組生物力學測試 a. 跟腱橫截面積；b. 最終應力；c. 抗拉強度；d. 彈性模量
Figure6.
Biomechanical testing of Achilles tendons in each group a. Cross sectional area; b. Ultimate force; c. Tensile strength; d. Elastic modulus
3 討論
研究表明，不同運動強度對肌腱損傷修復過程的影響亦不同[19]。一方面，運動可以促進膠原蛋白合成，防止肌腱退變[20]；另一方面，過度運動會促進金屬蛋白酶釋放，導致膠原蛋白破壞[21]。因此，明確有助于肌腱微損傷修復的運動強度是進一步研究肌腱修復機制的前提。
各種實驗動物的運動能力不同，其肌腱對運動的適應能力也不同。以實驗室常用的大鼠為例，不同運動強度對其肌腱生理功能的影響仍存在爭議。Soslowsky 等[22]利用被動下坡跑臺誘導大鼠岡上肌腱形成肌腱病；Glazebrook 等[15]利用上坡高強度被動跑臺使大鼠跟腱出現了類似于人類肌腱病的組織病理學表現。但是 Heinemeier 等[16]同樣采用上坡高強度被動跑臺方法卻未能誘導出大鼠跟腱病理學改變，并且他們認為大鼠適應了這種運動強度，跟腱的生物力學特性得到了增強。另外，Dirks 等[23]對高運動能力大鼠進行高強度跑臺訓練，但也未成功誘導出大鼠跟腱病理變化。Godbout 等[24]認為早期自主運動不能促進膠原酶誘導的 Wistar 大鼠跟腱微損傷愈合，Dirks 等[12]則認為高強度跑臺訓練不會加劇高運動能力大鼠跟腱的損傷。
為了闡明不同強度跑臺訓練對大鼠跟腱微損傷修復的影響，本實驗參照上述研究方法，選擇高強度（17 m/min、60 min/d）[15-16]及低強度（13 m/min、20 min/d）[14]被動跑臺訓練作為影響因素，觀察不同運動強度對已存在的跟腱微損傷修復的影響。關于觀測時間的選擇，Lui 等[13]研究表明，大鼠跟腱注射膠原酶溶液后 3 d 出現白細胞浸潤炎性反應，7 d 后恢復至正常水平；Dirks 等[12]的研究選擇注射膠原酶溶液后 9 d 左右炎性期結束時進行后續實驗；同時，結合膠原酶誘導的大鼠跟腱微損傷模型具有自愈能力，本研究最終選擇膠原酶溶液注射后 1 周進行干預。
本研究結果顯示，訓練 1 周后，各組跟腱組織在外觀、病理學表現、生物力學方面未出現顯著變化。但 4 周時各組間差異明顯，其中低強度組跟腱組織在外觀、病理學表現及生物力學方面均較對照組有明顯改善，提示低強度（13m/min、20 min/d）被動跑臺訓練可以有效促進肌腱微損傷的修復，該結果與 Zhang 等[14]的研究結果一致，其研究發現該運動強度也能促進老齡大鼠損傷髕腱的修復。而高強度組大鼠跟腱組織不僅在生物力學方面與對照組無統計學差異，大體觀察及組織學觀察還發現，該強度跑臺訓練后在一定程度上延遲甚至阻礙了跟腱微損傷的修復，具體表現為腱旁組織增生、組織病理學評分更差。該結果與 Dirks 等[12]發現高強度跑臺未加劇膠原酶誘導的跟腱病理變化不一致，可能與其使用的實驗動物為經篩選后的高運動能力大鼠有關。
另外，我們發現跑臺訓練對微損傷肌腱的影響表現為新生血管增多、細胞增多，且該影響隨時間延長而逐漸增大，并持續至實驗結束。提示運動療法可能是通過某些途徑加速了跟腱組織的代謝能力，促進了局部細胞增殖、分化或者募集，以達到修復損傷跟腱組織的目的。2007 年 Bi 等[25]發現了存在于肌腱中的祖細胞——肌腱干細胞，并認為其在肌腱修復過程中起重要作用。之后學者們對機械應力條件下肌腱干細胞特性的變化進行了相關研究。Zhang 等[17]發現在適度牽拉條件下，可以有效促進肌腱干細胞向成肌腱方向分化，通過對小鼠跑臺訓練發現肌腱的成肌腱成分較成骨、成軟骨、成肌腱等異常分化方向明顯減少。提示運動不僅會影響肌腱組織，同時可能也影響肌腱干細胞，從而促進了損傷肌腱的修復。Rui 等[26]發現膠原酶誘導的微損傷肌腱中，肌腱干細胞分化傾向發生了變化。因此通過進一步研究運動是否會影響細胞外基質，導致肌腱干細胞募集、增殖、分化的改變，是否糾正了受損肌腱干細胞的分化以及其修復機制，有望明確運動對肌腱微損傷修復的影響。
綜上述，不同強度跑臺訓練對于膠原酶誘導的大鼠跟腱微損傷修復的影響也不同，低強度運動可以在一定程度上促進微損傷肌腱的修復，但具體作用機制還需進一步深入研究。另外，本研究也存在一定局限性，考慮到大鼠跟腱微損傷模型具有自愈性，本研究僅進行了 4 周跑臺訓練，觀察時間較短；另外，研究僅設置了 2 個跑臺強度，因此需要針對不同實驗動物選擇更多運動強度進行干預觀察。
