引用本文： 徐朱杰, 陳敬華, 邵偉, 王瑞, 劉儀. 硫酸乙酰肝素成骨作用及成骨機制的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(8): 1016-1020. doi: 10.7507/1002-1892.201701103 復制
骨骼作為一個動態的、多功能的、有自我更新和再生能力的器官，理論上發生骨折后一般 6～8 周后可以愈合，但因年齡、骨折部位、骨膜剝離程度等因素的影響，部分骨折不能愈合或延遲愈合，嚴重影響患者活動功能和生活質量。既往研究發現，在骨損傷修復早期，多種硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycans，HSPGs）的基因表達均上調[1]，該結果間接論證了硫酸乙酰肝素（hepa-ran sulfate，HS）參與了骨愈合。因此，了解 HS 的成骨機制，并在此基礎上制定干預不愈合的治療方法，已成為國內外學者研究熱點。現對 HS 的成骨作用及成骨機制的最新研究進展進行綜述。
1 HS 的結構和功能特點
HS 是由二糖基單元重復形成的高硫酸化結構的線型陰離子多糖，并以共價鍵形式連接于核心蛋白絲氨酸甘氨酸殘基上[2]，組成位于細胞表面和細胞外基底膜的 HSPGs。HSPGs 的 HS 長鏈含有非硫酸化的 N-乙酰化域、高硫酸化的 N-硫酸化域和非還原末端，這些域結構根據物種和組織來源的不同，其磺基的大小和數目也不相同[3]。N-SO3、2-O-SO3、6-O-SO3 等特征性的硫酸化糖基簇聚可為各種生長因子、信號蛋白、部分重要的膜受體、趨化因子和細胞外基質蛋白提供結合位點[4]，一方面保護蛋白質，另一方面調控蛋白質通過基底膜轉運，介導蛋白質內置[5]。HSPGs 自身也可在細胞表面快速轉移，并根據細胞的變化改變自身結構，應答來自胞外的信號分子。這種結構特點是 HS 通過各種信號通路發揮生物學作用的重要基礎。
HS 具有多種生物功能，除了研究最多的調節凝血功能外，還具有調節胚胎發育、病毒感染、細胞分化、組織再生、腫瘤進展、炎性反應等作用[6-9]。在 HS 成骨方面，國內外相關研究從上世紀八九十年代已開始，且取得了顯著成果。由于 HSPGs 的 HS 鏈帶有高負荷，多糖鏈與蛋白質的結合力主要靠 HS 的陰離子部位與陽離子銨鹽基、胍鹽相互作用維持。HS 長鏈與許多參與骨折愈合的生長因子受體競爭性結合生長因子，通過非共價結合的方式進行結合，調節生長因子活性，保護這些生長因子免受蛋白酶的降解，并依靠維持穩定的信號分子濃度梯度來實現信號傳遞，影響許多生化過程[10]。其自身成分也參與構成骨基質，參與發揮骨組織內部結構和功能的穩定作用[11]。
2 HS 對骨形成的作用
2.1 HS 對成骨細胞系的影響
HS 對于成骨細胞系的分化以及基質的礦化能力具有正性作用。作為一種線性多糖，HS 除了具有促進成骨細胞分化、調節骨痂中骨再生生長因子的產量而調節骨形成、調控 BMP-4 的信號傳遞和活性等多種功能，還可以刺激成骨細胞重要來源細胞 BMSCs 的增殖，以及各類 MSCs 向成骨細胞的分化[12]。HSPGs 可協調前成骨細胞 MC3T3-E1 的黏附遷移[13]，與骨激活素（osteoactivin，OA）的結合可激活黏附斑激酶信號通路和細胞外調節激酶通路（extracellular signal-regulated kinase 2，ERK1/2），介導酪氨酸磷酸化級聯反應，導致黏著斑的形成，進而促進成骨細胞黏附至 OA 基質[14]。而 OA 作為一種黏附分子，經由整合素將細胞外基質的化學成分與力學狀態傳入細胞內，誘導細胞信號和功能的變化。
Runx-2 是 Runt 轉錄因子家族成員之一，已被證明是胚胎發生階段成骨模式形成和成骨細胞分化進程必不可少的一種轉錄因子[15-16]。HS 可以提高 MC3T3-E1 細胞中 Runx-2、ALP 和骨橋蛋白的表達，并促使細胞器從增殖型向分化型轉變，提高成骨細胞的分化能力[13, 17]。Manton 等[18]研究表示，從正常成年人成骨細胞表面和基質中提取的 HS，體外能夠抑制人成骨細胞的增殖和代謝，而且這種抑制作用只有在細胞的初始線性期（48 h 內）以及 HS 濃度在 500 ng/mL 以上才顯現出來。這種抑制作用可能與 HSPGs 結合 TGF-β 的能力有關，其具體機制尚不明確。
但目前細胞表面和細胞外基質中的肝素酶（heparanase，HPSE）對成骨細胞的分化作用有兩種截然不同的觀點。一種觀點認為，HPSE 增多抑制了 Wnt/β-catenin 信號通路，降低 Runx-2 轉錄因子的表達，并使骨祖細胞從向成骨細胞分化轉向脂肪細胞分化，從而顯著抑制成骨細胞分化，增強破骨細胞作用，阻礙基質礦化和體內骨質形成[16, 19]；另一種觀點則認為，HPSE 可消化 HS 的蛋白結合位點，促使 HS 結合生長因子的釋放，包括 BMP 和 FGF，并且提高 pSMAD1/5/8 基因的表達，增強 BMP 通路，從而調節細胞的分化、黏附、增殖和細胞外基質重構，在骨軟骨交界處促使軟骨骨化和骨質形成[20-24]。因此，HPSE 對成骨作用的具體機制尚未明確，仍需要進一步研究。
2.2 HS 及其復合支架材料對動物骨缺損模型的影響
HS 在骨缺損局部的應用可以募集內源性生長因子，并提高內源性生長因子的產出，從而增加缺損部骨合成代謝的潛力。Jackson 等[25]利用 HS 對大鼠股骨中段骨折進行治療，結果顯示 5 μg HS 應用于骨折部位，2 周后可使骨小梁體積增加 20%，并且 ALP、Runx-2 等成骨細胞分化標志物的表達和許多肝素結合性生長因子的表達明顯增加。同樣在扁平骨（如顱骨）中，HS 亦有相同作用[26]。然而，也有文獻報道了 HS 對成骨并無作用，甚至存在抑制成骨信號蛋白的作用[27]。
對于 HS 修飾支架材料，盡管目前相關研究不多，但絕大部分實驗證明 HS 無論是與有機材料還是無機材料復合，對于骨缺損的修復作用均強于 HS 直接應用。Woodruff 等[28]通過構建 HS-纖維蛋白膠原支架對大鼠顱骨缺損模型進行了深入研究，證實了 HS-纖維蛋白膠原支架在骨再生和促成骨細胞方面更為有效。在經 HS 處理的纖維蛋白膠原支架組中，所有樣本骨缺損的邊緣均可清晰觀察到新生骨，同時缺損部位的成骨標志物包括Ⅰ型膠原、骨鈣素和骨橋蛋白都均勻而明顯地染色，Runx-2 和 ALP 的表達也顯著提高；而對于只有纖維蛋白膠原支架的對照組，各測量結果均介于 HS 組和空白對照組之間。還有研究表明，無機物 β-三磷酸鈣與 HS 的復合支架材料也顯示出復合支架的成骨優勢[29]。
2.3 基底膜蛋白多糖（Perlecan）/HSPG2亞等位基因敲除對骨祖細胞和骨組織的影響
在所有骨骼細胞中，骨細胞約占 90%，它們深嵌在礦化基質中，主要負責感知機械負荷并進行信息傳遞。礦化基質像隧道一樣將骨細胞包繞連接起來，稱作小管[30]。每個小管連接到骨細胞胞體周圍凹陷的礦化結構，并一起構成了骨陷窩-小管系統（lacunocanalicular system，LCS）。一般骨細胞和礦化基質的間隙被間質液和各種細胞外基質分子所填充，內部組織液的流動將直接影響其內部骨細胞的生理活動。含有蛋白多糖的細胞外基質可以調控 LCS 的溶質運輸和機械傳感性，促進骨基質的形成以及維持骨基質的穩定[31]，其中即包括具有分泌作用的 Perlecan/HSPG[32]。Thompson 等[11]對敲除亞等位基因 Perlecan/HSPG2 的小鼠骨皮質 LCS 進行研究，鏡下觀測顯示 HSPG2 缺乏組的皮質骨密度下降，骨細胞胞體周圍區域的面積以及小管區域的總面積均明顯變小。結果說明 HSPG2 是小鼠骨皮質 LCS 的組成部分，并發揮著保護 LCS 外周間隙尺寸的作用，HSPG2 的缺乏可能通過影響骨細胞周圍區域基質的完整性改變骨細胞 LCS 的形態。除 LCS 的上述變化外，Lowe 等[33]也對 Perlecan/HSPG2 基因突變胚胎干細胞的分化潛力和細胞外基質生長因子的影響進行了體外研究，HSPG2 基因突變組（細胞外基質含極少 HSPG2）的骨祖細胞比對照組（細胞外基質含大量 HSPG2）更傾向于向成骨細胞分化，且刺激細胞外基質中 BMP-2 表達增加，更能促進成骨作用。成年 Perlecan/HSPG2 突變小鼠則表現出嚴重的脊柱畸形、面部扁平、臀部變形、長骨骨腔擴大和長度縮短、骨骼脆性增大等異常發育[34]。
3 HS 干預的成骨信號通路
HS 參與的成骨作用是由多個信號通路協同交互作用的結果，其中主要的信號通路包括：FGF/HS/FGF 受體（FGF receptor，FGFR）信號通路、Wnt 信號通路、蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）信號通路、BMP 信號通路、骨保護素（osteoprotegerin，OPG）/NF-κB 受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）/NF-κB 受體活化因子（receptor activator for nuclear factor-κB，RANK）信號通路、Hedgehog 信號通路和 TGF-β 信號通路等。
3.1 FGF/HS/FGFR 信號通路
作為研究最多的通路，FGF/FGFR 信號傳遞在骨發育和愈合過程中，以及在調節骨骼細胞的增殖、分化，維持骨骼細胞活性和功能中起著關鍵作用，而這些過程均受到 HS 的調控[35-36]。FGF直接影響各種體內基質蛋白的表達，包括 ALP、骨鈣素、BMP-2 和轉錄因子 Runx-2 等。尤其是 FGF-2、FGF-9 和 FGF-18 對骨和軟骨的發育，以及關節的生物學健康存在極大影響[37]。但是 FGF 和 FGFR 在 HS 長鏈上有自己的結合位點，而且只有當 FGF-HS-FGFR 三元復合物形成時，才能發揮促有絲分裂、提高細胞增殖能力的作用[38]。
FGF-2 作為 FGF 家族最具特征性的成員，已被證實可以調節細胞的生長、分化和遷移等。FGF-2 通過激活 ERK1/2 信號通路，控制 Runx-2 轉錄因子的表達[17]。FGF-2/HSPGs 與 FGFR-2 結合可激活多條信號通路，包括絲裂原活化蛋白激酶信號通路和 PKC 信號通路[39]。而這些通路也被證實可以介導 FGF作用于成骨細胞[40-41]。
3.2 PKC 信號通路
PKC 信號通路是成骨細胞成骨作用的通路之一。PKC 通路的激活可以參與細胞的多種生物功能調節，包括細胞的遷移、增殖、分化與凋亡等[42]。宋淑軍等[43]通過 PKC 抑制劑抑制 PKC 通路，可完全阻斷 HS 促成骨細胞增殖的作用，證實了其在 HS 促成骨過程中的重要作用。同時 PKC 可以介導 FGF 作用于成骨細胞，刺激 Cbfa1/Runx-2（一種多功能的骨形成調節基因）的表達[41]。同樣，FGF-2 作用于 PKC 后可以激活 PKC 通路，增強人成骨細胞 N-鈣黏蛋白的表達[39]。
3.3 OPG/RANKL/RANK 信號通路
OPG/RANKL/RANK 信號通路是目前骨質疏松方面研究最多的一條通路。OPG 作為成骨細胞分化的誘餌受體與 RANKL 發生競爭性結合，抑制 RANKL 與 RANK 的相互作用，從而封閉成骨細胞誘導的破骨細胞前體分化與融合，調控破骨細胞的分化增殖與凋亡，并影響其生理功能[44]。Li 等[45]研究顯示，HS 作為 RANKL/RANK/OPG 信號通路不可或缺的調節器，它可以誘導 OPG 的二聚化，改變 OPG 構象，形成 HS、OPG 和 RANKL 三元復合物；并通過固定 OPG 于成骨細胞表面，降低 OPG 抑制 RANKL 的閾值，從而抑制破骨細胞的破骨作用。
3.4 BMP 信號通路
BMP-2 是骨折愈合中強有力的肝素結合性生長因子之一[46]。HS 對 BMP 信號通路在成骨細胞系中的重要性一直存在爭議。現階段觀點分為兩種：Bramono 等[47]從人 BMSCs 中分離提取出 HS，進行體外成骨細胞實驗和動物體內骨缺損修復實驗，發現骨髓誘導的 HS 可以顯著增強 BMP-2 的成骨作用，降低抗凝副作用。此外，Murali 等[48]發現 HS 可以抑制 BMP-2 拮抗物 Noggin 蛋白，延長 pSMAD 信號蛋白表達，提高 BMP 生物活性。另一種觀點則相反，Jiao 等[49]認為細胞表面 HS 結合 BMP-2 并阻礙其與 BMP-2 受體結合，可使 C2C12 細胞（一種鼠成肌細胞）向成骨細胞分化的能力降低。而 Manton 等[23]通過酶破壞 HS 鏈可以明顯刺激 BMP 信號通路，促進體外人 MSCs 向成骨細胞的分化，提高 ALP、Runx-2 和骨鈣素等標志物的表達和增強基質礦化能力。因此，HS 在 BMP 信號通路中的具體影響機制需要進一步研究證實。
3.5 其他信號通路
Hedgehog 信號通路主要在骨折修復階段的軟骨細胞中被激活，被認為可作用于成骨細胞[50]。Levi 等[51]研究發現，激活 Hedgehog 信號通路可顯著上調 Runx2、ALP、Ⅰ型膠原酶相關基因的表達，促進骨質形成。同時，Wnt 信號通路可以促進成骨細胞分化，TGF-β/BMP 活化的 Smad 蛋白對骨形成也至關重要。HSPGs 同樣被認為可以通過與 Wnt、Hedgehog、TGF-β 等發生交互作用，從而影響 Wnt 信號通路、Hedgehog 信號通路和 TGF-β 信號通路，但相關研究機制尚不確切。
4 結論與展望
HS 介入的骨缺損愈合是由多種調節因子參與，成骨細胞和破骨細胞共同完成的一個非常復雜的修復過程。在愈合的某些特定階段，生長、膠黏和酶的因素都可對其愈合程度進行調節，且參與骨形成的信號通路并不是相互孤立的，往往是協同交互式發揮作用。為了解 HS 的成骨機制，國內外學者已經進行了大量研究，但確切作用機制和局部長期應用的安全性仍存在一定分歧和空白，包括 HS 局部使用對 BMP 信號通路的影響、對局部感染發生的影響[27]、與骨腫瘤形成的關系、對炎性因子的影響、遠期對肝脾腎功能的影響等，仍需要進一步驗證。此外，HS 修飾的復合支架材料的研究相對偏少，且極少涉及三元復合支架或更多元復合支架材料的研究。本實驗室正在對 HS 應用于多元復合支架的成骨作用與成骨機制，以及使用的長期肝腎脾毒性進行研究。隨著對 HS 成骨機制和安全性的不斷探索完善，有望為 HS找到一種最適合用于臨床修復骨缺損的應用方式，并為骨組織工程材料提供一種重要選擇。
骨骼作為一個動態的、多功能的、有自我更新和再生能力的器官，理論上發生骨折后一般 6～8 周后可以愈合，但因年齡、骨折部位、骨膜剝離程度等因素的影響，部分骨折不能愈合或延遲愈合，嚴重影響患者活動功能和生活質量。既往研究發現，在骨損傷修復早期，多種硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycans，HSPGs）的基因表達均上調[1]，該結果間接論證了硫酸乙酰肝素（hepa-ran sulfate，HS）參與了骨愈合。因此，了解 HS 的成骨機制，并在此基礎上制定干預不愈合的治療方法，已成為國內外學者研究熱點。現對 HS 的成骨作用及成骨機制的最新研究進展進行綜述。
1 HS 的結構和功能特點
HS 是由二糖基單元重復形成的高硫酸化結構的線型陰離子多糖，并以共價鍵形式連接于核心蛋白絲氨酸甘氨酸殘基上[2]，組成位于細胞表面和細胞外基底膜的 HSPGs。HSPGs 的 HS 長鏈含有非硫酸化的 N-乙酰化域、高硫酸化的 N-硫酸化域和非還原末端，這些域結構根據物種和組織來源的不同，其磺基的大小和數目也不相同[3]。N-SO3、2-O-SO3、6-O-SO3 等特征性的硫酸化糖基簇聚可為各種生長因子、信號蛋白、部分重要的膜受體、趨化因子和細胞外基質蛋白提供結合位點[4]，一方面保護蛋白質，另一方面調控蛋白質通過基底膜轉運，介導蛋白質內置[5]。HSPGs 自身也可在細胞表面快速轉移，并根據細胞的變化改變自身結構，應答來自胞外的信號分子。這種結構特點是 HS 通過各種信號通路發揮生物學作用的重要基礎。
HS 具有多種生物功能，除了研究最多的調節凝血功能外，還具有調節胚胎發育、病毒感染、細胞分化、組織再生、腫瘤進展、炎性反應等作用[6-9]。在 HS 成骨方面，國內外相關研究從上世紀八九十年代已開始，且取得了顯著成果。由于 HSPGs 的 HS 鏈帶有高負荷，多糖鏈與蛋白質的結合力主要靠 HS 的陰離子部位與陽離子銨鹽基、胍鹽相互作用維持。HS 長鏈與許多參與骨折愈合的生長因子受體競爭性結合生長因子，通過非共價結合的方式進行結合，調節生長因子活性，保護這些生長因子免受蛋白酶的降解，并依靠維持穩定的信號分子濃度梯度來實現信號傳遞，影響許多生化過程[10]。其自身成分也參與構成骨基質，參與發揮骨組織內部結構和功能的穩定作用[11]。
2 HS 對骨形成的作用
2.1 HS 對成骨細胞系的影響
HS 對于成骨細胞系的分化以及基質的礦化能力具有正性作用。作為一種線性多糖，HS 除了具有促進成骨細胞分化、調節骨痂中骨再生生長因子的產量而調節骨形成、調控 BMP-4 的信號傳遞和活性等多種功能，還可以刺激成骨細胞重要來源細胞 BMSCs 的增殖，以及各類 MSCs 向成骨細胞的分化[12]。HSPGs 可協調前成骨細胞 MC3T3-E1 的黏附遷移[13]，與骨激活素（osteoactivin，OA）的結合可激活黏附斑激酶信號通路和細胞外調節激酶通路（extracellular signal-regulated kinase 2，ERK1/2），介導酪氨酸磷酸化級聯反應，導致黏著斑的形成，進而促進成骨細胞黏附至 OA 基質[14]。而 OA 作為一種黏附分子，經由整合素將細胞外基質的化學成分與力學狀態傳入細胞內，誘導細胞信號和功能的變化。
Runx-2 是 Runt 轉錄因子家族成員之一，已被證明是胚胎發生階段成骨模式形成和成骨細胞分化進程必不可少的一種轉錄因子[15-16]。HS 可以提高 MC3T3-E1 細胞中 Runx-2、ALP 和骨橋蛋白的表達，并促使細胞器從增殖型向分化型轉變，提高成骨細胞的分化能力[13, 17]。Manton 等[18]研究表示，從正常成年人成骨細胞表面和基質中提取的 HS，體外能夠抑制人成骨細胞的增殖和代謝，而且這種抑制作用只有在細胞的初始線性期（48 h 內）以及 HS 濃度在 500 ng/mL 以上才顯現出來。這種抑制作用可能與 HSPGs 結合 TGF-β 的能力有關，其具體機制尚不明確。
但目前細胞表面和細胞外基質中的肝素酶（heparanase，HPSE）對成骨細胞的分化作用有兩種截然不同的觀點。一種觀點認為，HPSE 增多抑制了 Wnt/β-catenin 信號通路，降低 Runx-2 轉錄因子的表達，并使骨祖細胞從向成骨細胞分化轉向脂肪細胞分化，從而顯著抑制成骨細胞分化，增強破骨細胞作用，阻礙基質礦化和體內骨質形成[16, 19]；另一種觀點則認為，HPSE 可消化 HS 的蛋白結合位點，促使 HS 結合生長因子的釋放，包括 BMP 和 FGF，并且提高 pSMAD1/5/8 基因的表達，增強 BMP 通路，從而調節細胞的分化、黏附、增殖和細胞外基質重構，在骨軟骨交界處促使軟骨骨化和骨質形成[20-24]。因此，HPSE 對成骨作用的具體機制尚未明確，仍需要進一步研究。
2.2 HS 及其復合支架材料對動物骨缺損模型的影響
HS 在骨缺損局部的應用可以募集內源性生長因子，并提高內源性生長因子的產出，從而增加缺損部骨合成代謝的潛力。Jackson 等[25]利用 HS 對大鼠股骨中段骨折進行治療，結果顯示 5 μg HS 應用于骨折部位，2 周后可使骨小梁體積增加 20%，并且 ALP、Runx-2 等成骨細胞分化標志物的表達和許多肝素結合性生長因子的表達明顯增加。同樣在扁平骨（如顱骨）中，HS 亦有相同作用[26]。然而，也有文獻報道了 HS 對成骨并無作用，甚至存在抑制成骨信號蛋白的作用[27]。
對于 HS 修飾支架材料，盡管目前相關研究不多，但絕大部分實驗證明 HS 無論是與有機材料還是無機材料復合，對于骨缺損的修復作用均強于 HS 直接應用。Woodruff 等[28]通過構建 HS-纖維蛋白膠原支架對大鼠顱骨缺損模型進行了深入研究，證實了 HS-纖維蛋白膠原支架在骨再生和促成骨細胞方面更為有效。在經 HS 處理的纖維蛋白膠原支架組中，所有樣本骨缺損的邊緣均可清晰觀察到新生骨，同時缺損部位的成骨標志物包括Ⅰ型膠原、骨鈣素和骨橋蛋白都均勻而明顯地染色，Runx-2 和 ALP 的表達也顯著提高；而對于只有纖維蛋白膠原支架的對照組，各測量結果均介于 HS 組和空白對照組之間。還有研究表明，無機物 β-三磷酸鈣與 HS 的復合支架材料也顯示出復合支架的成骨優勢[29]。
2.3 基底膜蛋白多糖（Perlecan）/HSPG2亞等位基因敲除對骨祖細胞和骨組織的影響
在所有骨骼細胞中，骨細胞約占 90%，它們深嵌在礦化基質中，主要負責感知機械負荷并進行信息傳遞。礦化基質像隧道一樣將骨細胞包繞連接起來，稱作小管[30]。每個小管連接到骨細胞胞體周圍凹陷的礦化結構，并一起構成了骨陷窩-小管系統（lacunocanalicular system，LCS）。一般骨細胞和礦化基質的間隙被間質液和各種細胞外基質分子所填充，內部組織液的流動將直接影響其內部骨細胞的生理活動。含有蛋白多糖的細胞外基質可以調控 LCS 的溶質運輸和機械傳感性，促進骨基質的形成以及維持骨基質的穩定[31]，其中即包括具有分泌作用的 Perlecan/HSPG[32]。Thompson 等[11]對敲除亞等位基因 Perlecan/HSPG2 的小鼠骨皮質 LCS 進行研究，鏡下觀測顯示 HSPG2 缺乏組的皮質骨密度下降，骨細胞胞體周圍區域的面積以及小管區域的總面積均明顯變小。結果說明 HSPG2 是小鼠骨皮質 LCS 的組成部分，并發揮著保護 LCS 外周間隙尺寸的作用，HSPG2 的缺乏可能通過影響骨細胞周圍區域基質的完整性改變骨細胞 LCS 的形態。除 LCS 的上述變化外，Lowe 等[33]也對 Perlecan/HSPG2 基因突變胚胎干細胞的分化潛力和細胞外基質生長因子的影響進行了體外研究，HSPG2 基因突變組（細胞外基質含極少 HSPG2）的骨祖細胞比對照組（細胞外基質含大量 HSPG2）更傾向于向成骨細胞分化，且刺激細胞外基質中 BMP-2 表達增加，更能促進成骨作用。成年 Perlecan/HSPG2 突變小鼠則表現出嚴重的脊柱畸形、面部扁平、臀部變形、長骨骨腔擴大和長度縮短、骨骼脆性增大等異常發育[34]。
3 HS 干預的成骨信號通路
HS 參與的成骨作用是由多個信號通路協同交互作用的結果，其中主要的信號通路包括：FGF/HS/FGF 受體（FGF receptor，FGFR）信號通路、Wnt 信號通路、蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）信號通路、BMP 信號通路、骨保護素（osteoprotegerin，OPG）/NF-κB 受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）/NF-κB 受體活化因子（receptor activator for nuclear factor-κB，RANK）信號通路、Hedgehog 信號通路和 TGF-β 信號通路等。
3.1 FGF/HS/FGFR 信號通路
作為研究最多的通路，FGF/FGFR 信號傳遞在骨發育和愈合過程中，以及在調節骨骼細胞的增殖、分化，維持骨骼細胞活性和功能中起著關鍵作用，而這些過程均受到 HS 的調控[35-36]。FGF直接影響各種體內基質蛋白的表達，包括 ALP、骨鈣素、BMP-2 和轉錄因子 Runx-2 等。尤其是 FGF-2、FGF-9 和 FGF-18 對骨和軟骨的發育，以及關節的生物學健康存在極大影響[37]。但是 FGF 和 FGFR 在 HS 長鏈上有自己的結合位點，而且只有當 FGF-HS-FGFR 三元復合物形成時，才能發揮促有絲分裂、提高細胞增殖能力的作用[38]。
FGF-2 作為 FGF 家族最具特征性的成員，已被證實可以調節細胞的生長、分化和遷移等。FGF-2 通過激活 ERK1/2 信號通路，控制 Runx-2 轉錄因子的表達[17]。FGF-2/HSPGs 與 FGFR-2 結合可激活多條信號通路，包括絲裂原活化蛋白激酶信號通路和 PKC 信號通路[39]。而這些通路也被證實可以介導 FGF作用于成骨細胞[40-41]。
3.2 PKC 信號通路
PKC 信號通路是成骨細胞成骨作用的通路之一。PKC 通路的激活可以參與細胞的多種生物功能調節，包括細胞的遷移、增殖、分化與凋亡等[42]。宋淑軍等[43]通過 PKC 抑制劑抑制 PKC 通路，可完全阻斷 HS 促成骨細胞增殖的作用，證實了其在 HS 促成骨過程中的重要作用。同時 PKC 可以介導 FGF 作用于成骨細胞，刺激 Cbfa1/Runx-2（一種多功能的骨形成調節基因）的表達[41]。同樣，FGF-2 作用于 PKC 后可以激活 PKC 通路，增強人成骨細胞 N-鈣黏蛋白的表達[39]。
3.3 OPG/RANKL/RANK 信號通路
OPG/RANKL/RANK 信號通路是目前骨質疏松方面研究最多的一條通路。OPG 作為成骨細胞分化的誘餌受體與 RANKL 發生競爭性結合，抑制 RANKL 與 RANK 的相互作用，從而封閉成骨細胞誘導的破骨細胞前體分化與融合，調控破骨細胞的分化增殖與凋亡，并影響其生理功能[44]。Li 等[45]研究顯示，HS 作為 RANKL/RANK/OPG 信號通路不可或缺的調節器，它可以誘導 OPG 的二聚化，改變 OPG 構象，形成 HS、OPG 和 RANKL 三元復合物；并通過固定 OPG 于成骨細胞表面，降低 OPG 抑制 RANKL 的閾值，從而抑制破骨細胞的破骨作用。
3.4 BMP 信號通路
BMP-2 是骨折愈合中強有力的肝素結合性生長因子之一[46]。HS 對 BMP 信號通路在成骨細胞系中的重要性一直存在爭議。現階段觀點分為兩種：Bramono 等[47]從人 BMSCs 中分離提取出 HS，進行體外成骨細胞實驗和動物體內骨缺損修復實驗，發現骨髓誘導的 HS 可以顯著增強 BMP-2 的成骨作用，降低抗凝副作用。此外，Murali 等[48]發現 HS 可以抑制 BMP-2 拮抗物 Noggin 蛋白，延長 pSMAD 信號蛋白表達，提高 BMP 生物活性。另一種觀點則相反，Jiao 等[49]認為細胞表面 HS 結合 BMP-2 并阻礙其與 BMP-2 受體結合，可使 C2C12 細胞（一種鼠成肌細胞）向成骨細胞分化的能力降低。而 Manton 等[23]通過酶破壞 HS 鏈可以明顯刺激 BMP 信號通路，促進體外人 MSCs 向成骨細胞的分化，提高 ALP、Runx-2 和骨鈣素等標志物的表達和增強基質礦化能力。因此，HS 在 BMP 信號通路中的具體影響機制需要進一步研究證實。
3.5 其他信號通路
Hedgehog 信號通路主要在骨折修復階段的軟骨細胞中被激活，被認為可作用于成骨細胞[50]。Levi 等[51]研究發現，激活 Hedgehog 信號通路可顯著上調 Runx2、ALP、Ⅰ型膠原酶相關基因的表達，促進骨質形成。同時，Wnt 信號通路可以促進成骨細胞分化，TGF-β/BMP 活化的 Smad 蛋白對骨形成也至關重要。HSPGs 同樣被認為可以通過與 Wnt、Hedgehog、TGF-β 等發生交互作用，從而影響 Wnt 信號通路、Hedgehog 信號通路和 TGF-β 信號通路，但相關研究機制尚不確切。
4 結論與展望
HS 介入的骨缺損愈合是由多種調節因子參與，成骨細胞和破骨細胞共同完成的一個非常復雜的修復過程。在愈合的某些特定階段，生長、膠黏和酶的因素都可對其愈合程度進行調節，且參與骨形成的信號通路并不是相互孤立的，往往是協同交互式發揮作用。為了解 HS 的成骨機制，國內外學者已經進行了大量研究，但確切作用機制和局部長期應用的安全性仍存在一定分歧和空白，包括 HS 局部使用對 BMP 信號通路的影響、對局部感染發生的影響[27]、與骨腫瘤形成的關系、對炎性因子的影響、遠期對肝脾腎功能的影響等，仍需要進一步驗證。此外，HS 修飾的復合支架材料的研究相對偏少，且極少涉及三元復合支架或更多元復合支架材料的研究。本實驗室正在對 HS 應用于多元復合支架的成骨作用與成骨機制，以及使用的長期肝腎脾毒性進行研究。隨著對 HS 成骨機制和安全性的不斷探索完善，有望為 HS找到一種最適合用于臨床修復骨缺損的應用方式，并為骨組織工程材料提供一種重要選擇。