引用本文： 黃志剛, 王耀, 馬克. 低氧誘導因子 1α 基因在大鼠終板軟骨細胞中的表達及意義研究. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(3): 351-356. doi: 10.7507/1002-1892.201611129 復制
終板軟骨與關節軟骨一樣不含血管組織，主要靠滲透作用供給椎間盤營養物質，隨著機體的老化，終板軟骨逐漸退變，氧氣等營養物質供應及排除受阻，加上壓力及炎癥等因素，終板軟骨細胞以及細胞外基質會逐漸減少[1-2]。低氧誘導因子 1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）是細胞為了適應低氧環境的重要調節因子，也是一種基因轉錄核調節因子。研究顯示，HIF-1α 受細胞內氧分壓精細調節，在組織低氧環境下 HIF-1α 表達增高[3-4]。因此，為了解低氧環境下 HIF-1α 在終板軟骨細胞中的代償機制，我們將終板軟骨細胞在體外進行不同濃度氧環境處理以及干預 HIF-1α 基因表達后低氧條件下培養細胞，觀察 HIF-1α 基因表達變化以及終板軟骨細胞凋亡情況。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
10 周齡 SPF 級雄性 SD 大鼠 8 只，體質量 220～260 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供。實驗前適應性喂養 1 周。
DMEM/F12（HyClone 公司，美國）；FBS、0.25% 胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、FBS（GIBCO 公司，美國）；Trizol、Annexin V 凋亡試劑盒（Invitrogen 公司，美國）；LipofectaminTM2000 載體試劑（Olagen 公司，德國）；PrimeScriptTM RT-PCR 試劑盒、SYBR green Ⅰ real time PCR Kit 試劑盒（TaKaRa 公司，日本）；兔抗鼠 HIF-1α 多克隆抗體（Sigma 公司，美國）；山羊抗大鼠 Bax 多克隆抗體、山羊抗大鼠 Bcl-2 多克隆抗體（Oncogen 公司，美國）；山羊抗兔二抗、小鼠抗山羊二抗（北京中衫金橋生物技術有限公司）；GAPDH（上海碧云天生物技術有限公司）；DAB（北京諾博萊德科技有限公司）。流式細胞儀、細胞孵箱（Thermo Fisher 公司，美國）；紫外分光光度計（Tecan 公司，瑞士）；倒置相差顯微鏡（Olympus 公司，日本）。
1.2 終板軟骨細胞分離培養
采用酶消化法[5]分離培養終板軟骨細胞。取 8 只 SD 大鼠頸椎脫臼法處死，無菌條件下取 L1～5 椎間盤終板軟骨組織，剪碎至 1 mm×1 mm×1 mm 大小，加入 0.25% 胰蛋白酶消化 15 min，以離心半徑 3 cm，1 000 r/min 離心 5 min；去上清，加入 0.05%Ⅱ型膠原酶，消化 3 h 后過濾離心，以離心半徑 3 cm，1 000 r/min 離心 5 min；去上清，加入含 10% FBS 培養液，置于 37℃、5% CO2 細胞培養箱中進行培養，隔日換液。待細胞融合至 80% 消化傳代。取第 3 代細胞進行實驗。
1.3 常氧及低氧培養條件對終板軟骨細胞的影響
根據培養條件不同，將終板軟骨細胞分為兩組，20% O2 常氧條件下培養組（A 組）以及 0.5% O2 低氧條件下培養組（B 組）。采用氣體混合器調節 O2 濃度為 20% 和 0.5%（總流量 2 000 mL/min，CO2 100 mL/min，O2 為 400 mL/min 或 10 mL/min，余為 N2）。將終板軟骨細胞按照 1×105 個/孔置于缺氧盒中，檢查密閉性良好后，持續充入濃度為 20% 或 0.5% O2 5 min，缺氧盒密封后置于 37℃、飽和濕度孵箱中培養，每 12 小時更換培養液。培養 24 h 后取細胞進行觀測。
1.4 HIF-1α 對低氧培養條件下終板軟骨細胞的影響
參照文獻[6]方法篩選有效 HIF-1α siRNA，正義鏈序列 5'-GAAACUCUUCCAAGCAAUUTT-3'，反義鏈序列 5'-AAUUGCUUGGAAGAGUUUCTT-3'。將 siRNA 溶液與脂質體 LipofectaminTM2000 載體試劑混合，形成 HIF-1α siRNA/LipofectaminTM2000 載體復合物。將終板軟骨細胞接種至 6 孔板，每孔 1×105 個細胞，于孔板內加入 LipofectaminTM2000 載體試劑作為陰性對照組（C 組），加入 HIF-1α siRNA/LipofectaminTM2000 載體復合物作為 HIF-1α 基因沉默組（D 組）。轉染 6 h 后更換培養液，然后按照 1.3 方法于 0.5% O2 低氧條件下培養。培養 24 h 取細胞進行觀測。
1.5 觀測指標
1.5.1 細胞形態觀察 倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞形態及生長情況。取 C、D 組細胞，參照文獻[7]方法進行 HIF-1α 免疫熒光染色，HIF-1α 蛋白陽性染色呈綠色。
1.5.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 將各組細胞置于 0.25% 胰蛋白酶（不含 EDTA）消化后，收集細胞加入 PBS，以離心半徑 3 cm，1 000 r/min 離心 3 min，棄上清，重復 2 次；加入預先配制的 Annexin V，制成 500 μL 濃度為 1×106 個/mL的細胞懸液。先后加入 5 μL Annexin V-FITC 結合物和 5 μL 碘化丙啶。室溫下避光培養 15 min，上機檢測。
1.5.3 實時熒光定量 PCR 檢測 HIF-1α、Ⅱ型膠原、蛋白多糖、SOX9 基因表達 取各組細胞加入 Trizol 試劑提取總 RNA，逆轉錄成 cDNA，利用 SYBR green Ⅰ real time PCR Kit 試劑盒擴增目的基因，引物由上海生工生物工程有限公司合成，GAPDH 作為內參，各引物序列見表 1。采用 2–ΔΔCt 法檢測相關基因的相對表達量。其中 A、B 組僅檢測 HIF-1α 基因，C、D 組檢測 HIF-1α、Ⅱ型膠原、蛋白多糖、SOX9 基因。
表1
目的基因引物序列及產物長度
Table1.
Primer sequences and product size for target genes
1.5.4 Western blot 檢測 HIF-1α、Bax、Bcl-2 蛋白表達 取各組細胞加入裂解液裂解 30 min 后，以離心半徑 3 cm，12 000 r/min 離心 30 min，取上清，BCA 法蛋白定量后調整至同等濃度，每孔上樣 40 μg，經 12% SDS-PAGE 凝膠電泳后轉移至聚偏氟乙烯膜，5% 脫脂奶粉封閉 1 h，加入 TBST 稀釋的 HIF-1α（1∶2 000）、Bax（1∶2 000）、Bcl-2（1∶5 000）一抗 4℃ 過夜，TBST 洗膜 3 次，加入二抗（1∶2 000）室溫孵育 2 h，TBST 洗膜 3 次，DAB 顯色，加入化學顯示劑后定影。以與 GAPDH 蛋白條帶灰度值比值作為目的蛋白相對表達量。
1.6 統計學方法
采用 SPSS18.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 常氧及低氧培養條件對終板軟骨細胞的影響
2.1.1 細胞形態觀察 培養 24 h A、B 組細胞爬滿瓶底，倒置相差顯微鏡下觀察，終板軟骨細胞為梭形、多邊形，呈鋪路石樣，出現接觸抑制，并可見少量空泡壞死細胞，兩組細胞形態無顯著區別。見圖 1a、b。
圖1
常氧及低氧培養條件下培養 24 h 細胞觀察 a. A 組細胞形態觀察（倒置相差顯微鏡×20）； b. B 組細胞形態觀察（倒置相差顯微鏡×20）； c. A 組流式細胞儀檢測； d. B 組流式細胞儀檢測； e. Western blot 檢測 HIF-1α、Bax、Bcl-2 蛋白表達 1：A 組； 2：B 組
Figure1.
Observation of endplate chondrocytes under normoxia and hypoxia culture conditions for 24 hours a. Morphological observation of endplate chondrocytes in group A (Inverted phase contrast microscope×20); b. Morphological observation of endplate chondrocytes in group B (Inverted phase contrast microscope×20); c. Cell apoptosis by flow cytometry in group A; d. Cell apoptosis by flow cytometry in group B; e. The protein expressions of HIF-1α, Bax, and Bcl-2 by Western blot 1: Group A; 2: Group B
2.1.2 流式細胞儀檢測 培養 24 h，A 組細胞凋亡率為 2.51%±0.38%，B 組為 2.63%±0.29%，兩組細胞凋亡率比較差異無統計學意義（t=1.026，P=0.471）。見圖 1c、d。
2.1.3 實時熒光定量 PCR 檢測 培養 24 h，A 組 HIF-1α 基因相對表達量為 0.47±0.03，B 組為 1.02±0.09；B 組 HIF-1α 基因表達顯著高于 A 組，比較差異有統計學意義（t=22.672，P=0.015）。
2.1.4 Western blot 檢測 A 組 HIF-1α 蛋白相對表達量為 1.01±0.12，B 組為 6.92±0.48；B 組 HIF-1α 蛋白表達顯著高于 A 組，比較差異有統計學意義（t=18.396，P=0.013）。A 組 Bax、Bcl-2 蛋白相對表達量分別為 0.97±0.08、1.03±0.11，B 組分別為 0.76±0.07、0.69±0.08；兩組以上兩蛋白表達比較，差異均無統計學意義（t=0.594，P=0.781；t=1.251，P=0.342）。見圖 1e。
2.2 HIF-1α 對低氧培養條件下終板軟骨細胞的影響
2.2.1 細胞形態觀察 倒置相差顯微鏡下觀察示，低氧培養 24 h，C 組終板軟骨細胞呈長梭形，細胞質豐富，局部有空泡壞死細胞，但數量較少；D 組細胞胞質固縮，并出現大量漂浮空泡壞死細胞。見圖 2a、b。HIF-1α 免疫熒光染色觀察示，D 組可見大量綠染的終板軟骨細胞，而 C 組未見綠染的終板軟骨細胞。見圖 2c、d。
圖2
低氧培養條件下培養 24 h 后 C、D 組細胞觀察 a. C 組細胞形態觀察（倒置相差顯微鏡×40）； b. D 組細胞形態觀察（倒置相差顯微鏡×40）； c. C 組 HIF-1α 免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×400）； d. D 組 HIF-1α 免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×400）； e. C 組流式細胞儀檢測； f. D 組流式細胞儀檢測； g. Western blot 檢測 HIF-1α、Bax、Bcl-2 蛋白表達 1：C 組； 2：D 組
Figure2.
Observation of endplate chondrocytes under hypoxia culture condition for 24 hours a. Morphological observation of endplate chondrocytes in group C (Inverted phase contrast microscope×40); b. Morphological observation of endplate chondrocytes in group D (Inverted phase contrast microscope×40); c. Observation of HIF-1α immunofluorescence staining in group C (Fluorescence microscopy×400); d. Observation of HIF-1α immunofluorescence staining in group D (Fluorescence microscopy×400); e. Cell apoptosis by flow cytometry in group C; f. Cell apoptosis by flow cytometry in group D; g. The protein expressions of HIF-1α, Bax, and Bcl-2 by Western blot 1: Group C; 2: Group D
2.2.2 流式細胞儀檢測 低氧培養 24 h，C 組細胞凋亡率為 7.64%±0.68%，D 組為 26.77%±0.98%；D 組細胞凋亡率顯著高于 C 組，比較差異有統計學意義（t=27.143，P=0.002）。見圖 2e、f。
2.2.3 實時熒光定量 PCR 檢測 低氧培養 24 h，C 組 HIF-1α、Ⅱ型膠原、蛋白多糖、SOX9 基因相對表達量分別為 1.02±0.12、1.03±0.14、1.01±0.09、1.05±0.09，D 組分別為 0.11±0.01、0.83±0.07、0.29±0.03、0.59±0.06，C 組以上目的基因表達均顯著高于 D 組，比較差異有統計學意義（t=21.097，P=0.015；t=34.829，P=0.002；t=18.673，P=0.022；t=31.949，P=0.007）。
2.2.4 Western blot 檢測 低氧培養 24 h，C 組 HIF-1α、Bax、Bcl-2 蛋白相對表達量分別為 5.83±0.62、1.01±0.09、4.63±0.52，D 組分別為 1.04±0.18、3.48±0.12、0.56±0.07；C 組 HIF-1α、Bcl-2 蛋白表達均顯著高于 D 組（t=37.648，P=0.006；t=16.729，P=0.036），而 Bax 蛋白表達顯著低于 D 組（t=25.583，P=0.011）。見圖 2g。
3 討論
終板軟骨在保護椎骨及維持椎間盤穩定方面具有重要作用，由于終板軟骨內缺少血管和神經，終板軟骨細胞長期處于低氧狀態[8-9]。為模擬體內缺氧環境及探索 HIF-1α 是否在終板軟骨細胞中表達，我們對常氧和低氧條件下培養的終板軟骨細胞進行觀測。結果顯示，與常氧條件培養細胞相比，低氧條件下終板軟骨細胞未發生明顯凋亡，HIF-1α 基因和蛋白大量表達，而凋亡蛋白 Bax 和 Bcl-2 無明顯變化。提示 HIF-1α 在低氧條件下大量表達，以提高終板軟骨細胞耐低氧能力，抑制細胞自發性凋亡。
為驗證低氧環境下 HIF-1α 在終板軟骨細胞內所起作用，以及進一步探索 HIF-1α 基因與終板軟骨細胞凋亡的關系，我們設計在 0.5% O2 低氧條件下，通過 RNA 干擾技術，選擇性抑制 HIF-1α 基因表達，發現在抑制 HIF-1α 基因表達后，細胞凋亡率顯著提高，Bax 蛋白大量表達，Bcl-2 蛋白表達明顯抑制，HIF-1α 基因受抑制后細胞大量凋亡，提示 HIF-1α 基因在低氧環境下可抑制終板軟骨細胞凋亡，并且 HIF-1α 基因抑制后，軟骨特異性基因Ⅱ型膠原、蛋白多糖、SOX9 基因表達也明顯受到抑制，提示 HIF-1α 基因在低氧環境下對終板軟骨細胞起保護作用。
本研究發現 HIF-1α 保護終板軟骨細胞，抑制其凋亡，分析原因可能有以下兩方面：其一，低氧條件下終板軟骨細胞幾乎完全依靠無氧糖酵解維持細胞能量代謝[10-11]，HIF-1α 能通過上調葡萄糖轉運蛋白表達，促進葡萄糖和線粒體在終板軟骨細胞內代謝，維持代謝平衡[12]；其二，退變的終板軟骨以鈣化和低氧為特征[13-14]，本研究表明在低氧條件下因 HIF-1α 基因表達上調，終板軟骨細胞未發生明顯凋亡。Fas/FasL 信號通路是重要凋亡通路之一，而半乳糖凝集素 3 是已知能夠有效抑制 Fas 配體介導的細胞凋亡因子，而 HIF-1α 可與半乳糖凝集素 3 反應元件結合，協同抑制 Fas/FasL 信號通路介導的細胞凋亡[15-16]。另外，VEGF-A 與血管內皮因子受體 1 結合可促進細胞凋亡，而 CITED2（Cbp/ p300-interacting transactivator with Glu/Asp-rich carboxy-terminal domain 2）可抑制 VEGF 介導的細胞凋亡，低氧條件下 HIF-1α 可調節 p300 結合蛋白 CITED2 啟動子活性，抑制 VEGF 表達條件細胞凋亡，從而提高細胞在低氧環境中成活率[17-19]。
綜上述，在缺氧情況下，終板軟骨細胞 HIF-1α 表達上調，提高細胞耐氧性，并抑制細胞凋亡，其具體生物學功能及相關機制有待深入研究。
終板軟骨與關節軟骨一樣不含血管組織，主要靠滲透作用供給椎間盤營養物質，隨著機體的老化，終板軟骨逐漸退變，氧氣等營養物質供應及排除受阻，加上壓力及炎癥等因素，終板軟骨細胞以及細胞外基質會逐漸減少[1-2]。低氧誘導因子 1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）是細胞為了適應低氧環境的重要調節因子，也是一種基因轉錄核調節因子。研究顯示，HIF-1α 受細胞內氧分壓精細調節，在組織低氧環境下 HIF-1α 表達增高[3-4]。因此，為了解低氧環境下 HIF-1α 在終板軟骨細胞中的代償機制，我們將終板軟骨細胞在體外進行不同濃度氧環境處理以及干預 HIF-1α 基因表達后低氧條件下培養細胞，觀察 HIF-1α 基因表達變化以及終板軟骨細胞凋亡情況。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
10 周齡 SPF 級雄性 SD 大鼠 8 只，體質量 220～260 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供。實驗前適應性喂養 1 周。
DMEM/F12（HyClone 公司，美國）；FBS、0.25% 胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、FBS（GIBCO 公司，美國）；Trizol、Annexin V 凋亡試劑盒（Invitrogen 公司，美國）；LipofectaminTM2000 載體試劑（Olagen 公司，德國）；PrimeScriptTM RT-PCR 試劑盒、SYBR green Ⅰ real time PCR Kit 試劑盒（TaKaRa 公司，日本）；兔抗鼠 HIF-1α 多克隆抗體（Sigma 公司，美國）；山羊抗大鼠 Bax 多克隆抗體、山羊抗大鼠 Bcl-2 多克隆抗體（Oncogen 公司，美國）；山羊抗兔二抗、小鼠抗山羊二抗（北京中衫金橋生物技術有限公司）；GAPDH（上海碧云天生物技術有限公司）；DAB（北京諾博萊德科技有限公司）。流式細胞儀、細胞孵箱（Thermo Fisher 公司，美國）；紫外分光光度計（Tecan 公司，瑞士）；倒置相差顯微鏡（Olympus 公司，日本）。
1.2 終板軟骨細胞分離培養
采用酶消化法[5]分離培養終板軟骨細胞。取 8 只 SD 大鼠頸椎脫臼法處死，無菌條件下取 L1～5 椎間盤終板軟骨組織，剪碎至 1 mm×1 mm×1 mm 大小，加入 0.25% 胰蛋白酶消化 15 min，以離心半徑 3 cm，1 000 r/min 離心 5 min；去上清，加入 0.05%Ⅱ型膠原酶，消化 3 h 后過濾離心，以離心半徑 3 cm，1 000 r/min 離心 5 min；去上清，加入含 10% FBS 培養液，置于 37℃、5% CO2 細胞培養箱中進行培養，隔日換液。待細胞融合至 80% 消化傳代。取第 3 代細胞進行實驗。
1.3 常氧及低氧培養條件對終板軟骨細胞的影響
根據培養條件不同，將終板軟骨細胞分為兩組，20% O2 常氧條件下培養組（A 組）以及 0.5% O2 低氧條件下培養組（B 組）。采用氣體混合器調節 O2 濃度為 20% 和 0.5%（總流量 2 000 mL/min，CO2 100 mL/min，O2 為 400 mL/min 或 10 mL/min，余為 N2）。將終板軟骨細胞按照 1×105 個/孔置于缺氧盒中，檢查密閉性良好后，持續充入濃度為 20% 或 0.5% O2 5 min，缺氧盒密封后置于 37℃、飽和濕度孵箱中培養，每 12 小時更換培養液。培養 24 h 后取細胞進行觀測。
1.4 HIF-1α 對低氧培養條件下終板軟骨細胞的影響
參照文獻[6]方法篩選有效 HIF-1α siRNA，正義鏈序列 5'-GAAACUCUUCCAAGCAAUUTT-3'，反義鏈序列 5'-AAUUGCUUGGAAGAGUUUCTT-3'。將 siRNA 溶液與脂質體 LipofectaminTM2000 載體試劑混合，形成 HIF-1α siRNA/LipofectaminTM2000 載體復合物。將終板軟骨細胞接種至 6 孔板，每孔 1×105 個細胞，于孔板內加入 LipofectaminTM2000 載體試劑作為陰性對照組（C 組），加入 HIF-1α siRNA/LipofectaminTM2000 載體復合物作為 HIF-1α 基因沉默組（D 組）。轉染 6 h 后更換培養液，然后按照 1.3 方法于 0.5% O2 低氧條件下培養。培養 24 h 取細胞進行觀測。
1.5 觀測指標
1.5.1 細胞形態觀察 倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞形態及生長情況。取 C、D 組細胞，參照文獻[7]方法進行 HIF-1α 免疫熒光染色，HIF-1α 蛋白陽性染色呈綠色。
1.5.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 將各組細胞置于 0.25% 胰蛋白酶（不含 EDTA）消化后，收集細胞加入 PBS，以離心半徑 3 cm，1 000 r/min 離心 3 min，棄上清，重復 2 次；加入預先配制的 Annexin V，制成 500 μL 濃度為 1×106 個/mL的細胞懸液。先后加入 5 μL Annexin V-FITC 結合物和 5 μL 碘化丙啶。室溫下避光培養 15 min，上機檢測。
1.5.3 實時熒光定量 PCR 檢測 HIF-1α、Ⅱ型膠原、蛋白多糖、SOX9 基因表達 取各組細胞加入 Trizol 試劑提取總 RNA，逆轉錄成 cDNA，利用 SYBR green Ⅰ real time PCR Kit 試劑盒擴增目的基因，引物由上海生工生物工程有限公司合成，GAPDH 作為內參，各引物序列見表 1。采用 2–ΔΔCt 法檢測相關基因的相對表達量。其中 A、B 組僅檢測 HIF-1α 基因，C、D 組檢測 HIF-1α、Ⅱ型膠原、蛋白多糖、SOX9 基因。
表1
目的基因引物序列及產物長度
Table1.
Primer sequences and product size for target genes
1.5.4 Western blot 檢測 HIF-1α、Bax、Bcl-2 蛋白表達 取各組細胞加入裂解液裂解 30 min 后，以離心半徑 3 cm，12 000 r/min 離心 30 min，取上清，BCA 法蛋白定量后調整至同等濃度，每孔上樣 40 μg，經 12% SDS-PAGE 凝膠電泳后轉移至聚偏氟乙烯膜，5% 脫脂奶粉封閉 1 h，加入 TBST 稀釋的 HIF-1α（1∶2 000）、Bax（1∶2 000）、Bcl-2（1∶5 000）一抗 4℃ 過夜，TBST 洗膜 3 次，加入二抗（1∶2 000）室溫孵育 2 h，TBST 洗膜 3 次，DAB 顯色，加入化學顯示劑后定影。以與 GAPDH 蛋白條帶灰度值比值作為目的蛋白相對表達量。
1.6 統計學方法
采用 SPSS18.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 常氧及低氧培養條件對終板軟骨細胞的影響
2.1.1 細胞形態觀察 培養 24 h A、B 組細胞爬滿瓶底，倒置相差顯微鏡下觀察，終板軟骨細胞為梭形、多邊形，呈鋪路石樣，出現接觸抑制，并可見少量空泡壞死細胞，兩組細胞形態無顯著區別。見圖 1a、b。
圖1
常氧及低氧培養條件下培養 24 h 細胞觀察 a. A 組細胞形態觀察（倒置相差顯微鏡×20）； b. B 組細胞形態觀察（倒置相差顯微鏡×20）； c. A 組流式細胞儀檢測； d. B 組流式細胞儀檢測； e. Western blot 檢測 HIF-1α、Bax、Bcl-2 蛋白表達 1：A 組； 2：B 組
Figure1.
Observation of endplate chondrocytes under normoxia and hypoxia culture conditions for 24 hours a. Morphological observation of endplate chondrocytes in group A (Inverted phase contrast microscope×20); b. Morphological observation of endplate chondrocytes in group B (Inverted phase contrast microscope×20); c. Cell apoptosis by flow cytometry in group A; d. Cell apoptosis by flow cytometry in group B; e. The protein expressions of HIF-1α, Bax, and Bcl-2 by Western blot 1: Group A; 2: Group B
2.1.2 流式細胞儀檢測 培養 24 h，A 組細胞凋亡率為 2.51%±0.38%，B 組為 2.63%±0.29%，兩組細胞凋亡率比較差異無統計學意義（t=1.026，P=0.471）。見圖 1c、d。
2.1.3 實時熒光定量 PCR 檢測 培養 24 h，A 組 HIF-1α 基因相對表達量為 0.47±0.03，B 組為 1.02±0.09；B 組 HIF-1α 基因表達顯著高于 A 組，比較差異有統計學意義（t=22.672，P=0.015）。
2.1.4 Western blot 檢測 A 組 HIF-1α 蛋白相對表達量為 1.01±0.12，B 組為 6.92±0.48；B 組 HIF-1α 蛋白表達顯著高于 A 組，比較差異有統計學意義（t=18.396，P=0.013）。A 組 Bax、Bcl-2 蛋白相對表達量分別為 0.97±0.08、1.03±0.11，B 組分別為 0.76±0.07、0.69±0.08；兩組以上兩蛋白表達比較，差異均無統計學意義（t=0.594，P=0.781；t=1.251，P=0.342）。見圖 1e。
2.2 HIF-1α 對低氧培養條件下終板軟骨細胞的影響
2.2.1 細胞形態觀察 倒置相差顯微鏡下觀察示，低氧培養 24 h，C 組終板軟骨細胞呈長梭形，細胞質豐富，局部有空泡壞死細胞，但數量較少；D 組細胞胞質固縮，并出現大量漂浮空泡壞死細胞。見圖 2a、b。HIF-1α 免疫熒光染色觀察示，D 組可見大量綠染的終板軟骨細胞，而 C 組未見綠染的終板軟骨細胞。見圖 2c、d。
圖2
低氧培養條件下培養 24 h 后 C、D 組細胞觀察 a. C 組細胞形態觀察（倒置相差顯微鏡×40）； b. D 組細胞形態觀察（倒置相差顯微鏡×40）； c. C 組 HIF-1α 免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×400）； d. D 組 HIF-1α 免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×400）； e. C 組流式細胞儀檢測； f. D 組流式細胞儀檢測； g. Western blot 檢測 HIF-1α、Bax、Bcl-2 蛋白表達 1：C 組； 2：D 組
Figure2.
Observation of endplate chondrocytes under hypoxia culture condition for 24 hours a. Morphological observation of endplate chondrocytes in group C (Inverted phase contrast microscope×40); b. Morphological observation of endplate chondrocytes in group D (Inverted phase contrast microscope×40); c. Observation of HIF-1α immunofluorescence staining in group C (Fluorescence microscopy×400); d. Observation of HIF-1α immunofluorescence staining in group D (Fluorescence microscopy×400); e. Cell apoptosis by flow cytometry in group C; f. Cell apoptosis by flow cytometry in group D; g. The protein expressions of HIF-1α, Bax, and Bcl-2 by Western blot 1: Group C; 2: Group D
2.2.2 流式細胞儀檢測 低氧培養 24 h，C 組細胞凋亡率為 7.64%±0.68%，D 組為 26.77%±0.98%；D 組細胞凋亡率顯著高于 C 組，比較差異有統計學意義（t=27.143，P=0.002）。見圖 2e、f。
2.2.3 實時熒光定量 PCR 檢測 低氧培養 24 h，C 組 HIF-1α、Ⅱ型膠原、蛋白多糖、SOX9 基因相對表達量分別為 1.02±0.12、1.03±0.14、1.01±0.09、1.05±0.09，D 組分別為 0.11±0.01、0.83±0.07、0.29±0.03、0.59±0.06，C 組以上目的基因表達均顯著高于 D 組，比較差異有統計學意義（t=21.097，P=0.015；t=34.829，P=0.002；t=18.673，P=0.022；t=31.949，P=0.007）。
2.2.4 Western blot 檢測 低氧培養 24 h，C 組 HIF-1α、Bax、Bcl-2 蛋白相對表達量分別為 5.83±0.62、1.01±0.09、4.63±0.52，D 組分別為 1.04±0.18、3.48±0.12、0.56±0.07；C 組 HIF-1α、Bcl-2 蛋白表達均顯著高于 D 組（t=37.648，P=0.006；t=16.729，P=0.036），而 Bax 蛋白表達顯著低于 D 組（t=25.583，P=0.011）。見圖 2g。
3 討論
終板軟骨在保護椎骨及維持椎間盤穩定方面具有重要作用，由于終板軟骨內缺少血管和神經，終板軟骨細胞長期處于低氧狀態[8-9]。為模擬體內缺氧環境及探索 HIF-1α 是否在終板軟骨細胞中表達，我們對常氧和低氧條件下培養的終板軟骨細胞進行觀測。結果顯示，與常氧條件培養細胞相比，低氧條件下終板軟骨細胞未發生明顯凋亡，HIF-1α 基因和蛋白大量表達，而凋亡蛋白 Bax 和 Bcl-2 無明顯變化。提示 HIF-1α 在低氧條件下大量表達，以提高終板軟骨細胞耐低氧能力，抑制細胞自發性凋亡。
為驗證低氧環境下 HIF-1α 在終板軟骨細胞內所起作用，以及進一步探索 HIF-1α 基因與終板軟骨細胞凋亡的關系，我們設計在 0.5% O2 低氧條件下，通過 RNA 干擾技術，選擇性抑制 HIF-1α 基因表達，發現在抑制 HIF-1α 基因表達后，細胞凋亡率顯著提高，Bax 蛋白大量表達，Bcl-2 蛋白表達明顯抑制，HIF-1α 基因受抑制后細胞大量凋亡，提示 HIF-1α 基因在低氧環境下可抑制終板軟骨細胞凋亡，并且 HIF-1α 基因抑制后，軟骨特異性基因Ⅱ型膠原、蛋白多糖、SOX9 基因表達也明顯受到抑制，提示 HIF-1α 基因在低氧環境下對終板軟骨細胞起保護作用。
本研究發現 HIF-1α 保護終板軟骨細胞，抑制其凋亡，分析原因可能有以下兩方面：其一，低氧條件下終板軟骨細胞幾乎完全依靠無氧糖酵解維持細胞能量代謝[10-11]，HIF-1α 能通過上調葡萄糖轉運蛋白表達，促進葡萄糖和線粒體在終板軟骨細胞內代謝，維持代謝平衡[12]；其二，退變的終板軟骨以鈣化和低氧為特征[13-14]，本研究表明在低氧條件下因 HIF-1α 基因表達上調，終板軟骨細胞未發生明顯凋亡。Fas/FasL 信號通路是重要凋亡通路之一，而半乳糖凝集素 3 是已知能夠有效抑制 Fas 配體介導的細胞凋亡因子，而 HIF-1α 可與半乳糖凝集素 3 反應元件結合，協同抑制 Fas/FasL 信號通路介導的細胞凋亡[15-16]。另外，VEGF-A 與血管內皮因子受體 1 結合可促進細胞凋亡，而 CITED2（Cbp/ p300-interacting transactivator with Glu/Asp-rich carboxy-terminal domain 2）可抑制 VEGF 介導的細胞凋亡，低氧條件下 HIF-1α 可調節 p300 結合蛋白 CITED2 啟動子活性，抑制 VEGF 表達條件細胞凋亡，從而提高細胞在低氧環境中成活率[17-19]。
綜上述，在缺氧情況下，終板軟骨細胞 HIF-1α 表達上調，提高細胞耐氧性，并抑制細胞凋亡，其具體生物學功能及相關機制有待深入研究。
