引用本文： 葉雨辰, 張長春, 朱坤, 許剛, 韓仲兵, 樂意. 蜂毒肽對 IL-1β 誘導的大鼠腰椎終板軟骨細胞Ⅱ型膠原表達的影響研究. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(3): 345-350. doi: 10.7507/1002-1892.201609062 復制
椎間盤退變是下腰痛、頸部疼痛及相關功能障礙的主要病因。椎間盤退變的機制較為復雜，目前研究表明終板軟骨細胞（endplate chondrocytes，EPCs）退變及其細胞外基質降解會加速椎間盤退變[1]。近年研究顯示，促炎性細胞因子如 IL-1β 在終板軟骨退變中起促進作用，在退變及突出椎間盤中的表達也有所升高[2]。蜂毒肽（Melittin）是從西方蜂蜜中提取出的一種生物多肽，具有生物和藥理作用，包括抗菌、抗毒、抗炎及抗癌效用。研究表明，Melittin 通過抑制基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的表達，從而起到抑制 EPCs 細胞外基質降解、延緩椎間盤退變進展的作用[3]。本實驗通過觀察 Melittin 對 IL-1β 誘導的大鼠 EPCsⅡ型膠原表達的影響，探討其對終板軟骨的作用。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4 周齡 SD 大鼠 10 只，雌雄不限，體質量（100±10）g，由蚌埠醫學院實驗動物中心提供。胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶（Sigma 公司，美國）；DMEM/F12、FBS（HyClone 公司，美國）；兔抗Ⅱ型膠原單克隆抗體、兔抗 MMP-3 單克隆抗體、二抗山羊抗兔抗體（Abcam 公司，英國）；重組大鼠 IL-1β（Pepro Tech 公司，美國）；Melittin（安徽博美生物科技有限公司）；苯甲基磺酰氟（phenylmethane-sulfonyl fluoride，PMSF）、增強型 RIPA 裂解液（武漢博士德生物工程有限公司）。倒置顯微鏡、倒置熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）；細胞孵育箱（Thermo 公司，美國）；臺式離心機、PCR 儀（Eppen-dorf 公司，德國）；全自動酶標儀（Bio Tek 公司，美國）；凝膠系統成像儀（Bio-Rad 公司，美國）。
1.2 大鼠 EPCs 培養及鑒定
1.2.1 細胞分離培養 取 10 只 SD 大鼠，采用腹腔注射戊巴比妥鈉（150 mg/kg）處死，移入 75% 乙醇中浸泡消毒 10 min 后置于超凈工作臺。取后正中切口，顯露整個腰椎，分離周圍附著軟組織后取出；移入裝有 PBS 的培養皿中洗滌 5 min，使用薄刀片削取位于椎體及椎間盤之間的淡白色薄層軟骨，放入含 10%FBS 及 1% 雙抗的 DMEM/F12 培養基中，剪碎至 0.5 mm3。將剪碎的終板軟骨以 0.25% 胰蛋白酶 37℃ 消化 5 min 后，轉入 15 mL 離心管中，4℃ 以離心半徑 15 cm、1 000 r/min 離心 5 min；棄上清后加入 2%Ⅱ型膠原酶，于 37℃、5% CO2 孵育箱中過夜。次日，同上法離心 5 min 后棄上清，加入含 10% FBS 及 1% 雙抗的 DMEM/F12 培養基，以 2×105 個/mL密度種植于培養瓶中，于 37℃、5% CO2 孵育箱中培養。每 3 天換液 1 次，換液后采用倒置顯微鏡觀察細胞形態。待原代細胞達 70%～80% 融合時，用 0.25% 胰蛋白酶消化傳代，倒置顯微鏡觀察細胞形態變化。
1.2.2 細胞鑒定 ① 甲苯胺藍染色觀察：分別取第 1、5 代細胞用 0.25% 胰蛋白酶消化后，以 1×105 個/mL密度接種于鋪有多聚賴氨酸玻片的 6 孔培養板中進行細胞爬片，待其爬滿后取部分切片用 4% 多聚甲醛固定，甲苯胺藍染色后中性樹膠封片，倒置顯微鏡下觀察甲苯胺藍染色情況。② Ⅱ型膠原免疫熒光染色觀察：取上述細胞爬片，用 0.25% Triton X-100 穿透細胞膜，1% 牛血清白蛋白封閉后孵育一抗兔抗Ⅱ型膠原單克隆抗體，4℃ 過夜，標記Ⅱ型膠原蛋白，次日孵育二抗山羊抗兔抗體（熒光標記一抗）并行 DAPI 染核后，抗熒光衰滅封片劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞熒光表達情況。
1.3 IL-1β 及 Melittin 最適濃度選擇
取生長良好的第 3 代 EPCs，以 0.25% 胰蛋白酶消化后制成密度為 2×105 個/mL的細胞懸液，接種于 96 孔培養板，每孔 100 μL。篩選 IL-1β 最適濃度時分為 4 組（每組設 4 個復孔），各組細胞中分別加入 0、5、10、20 ng/mL IL-1β 進行干預；篩選 Melittin 最適濃度時分為 5 組（每組設 4 個復孔），各組細胞中分別加入 0、0.5、1.0、2.0、4.0 μg/mL Melittin 進行干預。分別于干預 24、48 h 后采用 MTT 法測定各組吸光度（A）值，以是否降低細胞活性作為標準選擇 IL-1β 及 Melittin 的最適濃度。
1.4 Melittin 對 IL-1β 誘導的大鼠 EPCsⅡ型膠原表達的影響
取生長良好的第 3 代 EPCs，以 2×105 個/mL密度接種于細胞培養瓶中，于 37℃、5%CO2 孵育箱中培養 48 h 后，根據干預條件不同隨機分為 4 組，每組 4 瓶。A 組為正常組，不加任何藥物；B 組加入最適濃度的 IL-1β；C 組加入最適濃度的 Melittin；D 組加入最適濃度的 IL-1β 及 Melittin。干預培養 48 h 后，將各組細胞使用胰蛋白酶消化法提取細胞后，加入細胞裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1）200 μL 提取蛋白，然后加入 SDS-PAGE 上樣緩沖液置于 PCR 儀中 15 min、99℃ 制備蛋白樣品，殘余樣品使用酶標儀測定蛋白濃度。在 10%SDS-PAGE 中每孔上樣 20 μg 蛋白樣品，分別以 80 V、15 min，120 V、70 min 進行積層膠和分離膠電泳后，以 260 mA、150 min 轉聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。將已轉成的 PVDF 膜封閉 2 h 后，加入一抗兔抗Ⅱ型膠原單克隆抗體孵育 4℃ 過夜，次日洗膜后加入二抗山羊抗兔抗體孵育 1 h，再次洗膜后將 PVDF 膜置于凝膠系統成像儀中曝光成像。將成像的蛋白表達條帶使用 Tanon GIS 系列數碼凝膠圖像處理系統計算灰度值。
1.5 統計學方法
采用 SPSS13.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 EPCs 形態觀察及鑒定
倒置顯微鏡觀察示，原代培養的 EPCs 排列緊密、折光性強，細胞呈圓形；第 1 代細胞多呈多角形；傳至第 5 代后，細胞增殖能力逐漸減弱，細胞形態向梭形轉變。甲苯胺藍染色示第 1 代細胞的細胞核被染成紫色，細胞質中的酸性黏液物質（如蛋白多糖）被染成深藍色；傳至第 5 代后細胞質顏色逐漸變淺。第 1、5 代細胞Ⅱ型膠原免疫熒光染色觀察示，在不同波段熒光激發下，可見細胞骨架部分呈陽性表達（呈綠色熒光），而細胞核區域未見明顯陽性表達，即細胞質及細胞膜區域特異性表達Ⅱ型膠原，細胞核使用 DAPI 復染呈藍色。見圖 1。
圖1
大鼠腰椎 EPCs 形態觀察及鑒定 a. 第 1 代細胞倒置顯微鏡觀察（×200）；b. 第 5 代細胞倒置顯微鏡觀察（×200）；c. 第 1 代細胞甲苯胺藍染色觀察（倒置顯微鏡×200）；d. 第 5 代細胞甲苯胺藍染色觀察（倒置顯微鏡×200）；e. 第 1 代細胞免疫熒光染色觀察（倒置熒光顯微鏡×200）；f. 第 5 代細胞免疫熒光染色觀察（倒置熒光顯微鏡×200）
Figure1.
Morphology observation and identification of rat lumbar EPCs a. The first generation cells under inverted microscope (×200); b. The fifth generation cells under inverted microscope (×200); c. Toluidine blue staining of the first generation cells (Inverted microscope×200); d. Toluidine blue staining of the fifth generation cells (Inverted microscope×200); e. Immunofluorescence staining of the first generation cells (Inverted fluorescence microscope×200); f. Immunofluorescence staining of the fifth generation cells (Inverted fluorescence microscope×200)
2.2 IL-1β 及 Melittin 最適濃度選擇
干預 24、48 h，IL-1β 及 Melittin 對 EPCs 均有抑制作用，并呈劑量依賴性。IL-1β 20 ng/mL 組A 值顯著低于 0、5、10 ng/mL 組，Melittin 2.0、4.0 μg/mL 組A 值顯著低于 0、0.5、1.0 μg/mL 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 2。該結果提示 EPCs 在 IL-1β 20 ng/mL 和 Melittin 2.0、4.0 μg/mL 濃度下出現細胞活性明顯降低，故取上一個濃度梯度。因此 IL-1β 及 Melittin 的最適濃度分別為 10 ng/mL 和 1.0 μg/mL。
圖2
MTT 法確定 IL-1β 及 Melittin 的最適濃度 a. IL-1β 干預 24 h；b. IL-1β 干預 48 h；c. Melittin 干預 24 h；d. Melittin 干預 48 h
Figure2.
Determination of the optimal concentration of IL-1β and Melittin by MTT assay a. IL-1β intervention for 24 hours; b. IL-1β intervention for 48 hours; c. Melittin intervention for 24 hours; d. Melittin intervention for 48 hours
2.3 Melittin 對 IL-1β 誘導的大鼠 EPCsⅡ型膠原表達的影響
與 A 組比較，B 組 IL-1β 干預后Ⅱ型膠原表達明顯減少，C 組 Melittin 干預后Ⅱ型膠原表達明顯增加，而 D 組與 A 組比較無明顯差異。見圖 3。A、B、C、D 組Ⅱ型膠原相對表達量分別為 0.991±0.024、0.474±0.127、1.913±0.350、1.159±0.297，除 A、D 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）外，其余組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
圖3
Western blot 法檢測各組Ⅱ型膠原表達 1：A 組 2：B 組 3：C 組 4：D 組
Figure3.
Detection of Col-II expression by Western blot assay in each group 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D
3 討論
在成人體內，椎間盤是最大的無血管結構，椎間盤中的細胞存活所依賴的血管終止于骨性椎體終板鄰近的軟骨下骨/髓核。椎間盤細胞中的營養素及代謝物通過擴散作用來提供和交換[4-5]。EPCs 主要表達具有軟骨相關性的Ⅱ型膠原及蛋白多糖，并且在椎體與椎間盤之間的營養交換中起重要作用。研究表明終板軟骨的退變早于椎間盤退變，并可繼發椎間盤退變[6]。終板軟骨的生化結構構成對保證椎間盤的生物穩定性具有重要作用，其中Ⅱ型膠原及蛋白多糖含量的減少會繼發髓核細胞及其細胞外基質成分的改變，蛋白含量也與椎間盤與椎體之間的營養物質運輸密切相關。而軟骨終板滲透并傳遞營養物質的功能取決于兩個方面：一是物質的本身特性，如分子形狀、相對分子質量大小及所帶電荷等；二是終板軟骨中蛋白多糖及水分的含量[7-8]。
Melittin 作為蜂毒中主要有毒化合物的殘基，是一個包含有 26 個氨基酸的小分子蛋白。其分子結構具有親水、親脂特性，故具有去垢樣功能。由于其具有抗粥樣動脈硬化功能，繼而引起了研究者的廣泛關注。體內實驗表明，Melittin 具有抑制脂多糖/脂肪所誘導的黏附分子（如細胞因子等）表達的功能。近期研究表明，在大鼠相關性椎間盤退變模型中，Melittin 能夠通過抑制 NF-κB 的活性來發揮一定的延緩及改善椎間盤退變作用[9]。
NF-κB 信號在細胞對炎癥、應激和損傷的反應中起重要作用。NF-κB 是由一大類結構相關的轉錄因子組成，在哺乳類動物中包括 5 種蛋白亞單位，RelA 或 p65、c-Rel、RelB、p50 和 p52。NF-κB 作為一個同源二聚體或異源二聚體存在，其中 p50-p65 異源二聚體是控制 NF-κB 主要調控基因表達的最常見形式。NF-κB 的長期激活與組織老化和年齡相關性退變疾病有關，包括骨骼肌肉疾病和骨質疏松癥等。NF-κB 同時也參與了年齡相關性椎間盤退變[10]。在椎間盤組織中，NF-κB 的活性顯示了與氧化應激和老化退變之間的聯系[11]。椎間盤退變疾病中均可發現 NF-κB 活性增高，相比于無癥狀的椎間盤，有癥狀的椎間盤具有較高的促炎性細胞因子水平，其中典型的是 NF-κB 靶基因，如 IL-1β、IL-6 及 IL-8、TNF-α[12]。
無論是椎間盤還是終板軟骨的退變都與炎性因子相關，其中以 IL-1β 較為突出。IL-1β 高表達于退變椎間盤中，其通過調節趨化因子表達來進一步引發椎間盤中的炎性反應[13-16]。IL-1β 通過誘導椎間盤中的趨化因子配體 3 表達來激活 NF-κB、MAPK 等通路，進而增加 ADAMTS 及 SDC4 的表達，導致椎間盤及終板細胞外基質發生降解[17-18]。此外，IL-1β 通過激活 MMP，進而促使椎間盤及 EPCs 細胞外基質降解[19-20]。故本實驗中選用 IL-1β 誘導來建立體外大鼠 EPCs 退變模型。
本實驗發現，與正常組比較，IL-1β 誘導后 EPCs 中的Ⅱ型膠原表達下調，而進行 Melittin 干預后，Ⅱ型膠原表達下調被抑制。因此，Melittin 通過抑制 EPCs 細胞外基質成分的降解，從而具有抗炎、抗老化作用，為臨床應用 Melittin 防治椎間盤退變相關性疾病提供一定的理論依據。本實驗的不足之處在于僅研究了 Melittin 對Ⅱ型膠原表達的影響情況，而 Melittin 對 MMP 家族表達的影響以及 Melittin 如何從信號轉導通路角度延緩終板軟骨退變，還需進一步實驗研究。
· 信 息 · 第三屆中山骨科學術周報名通知 復旦大學附屬中山醫院骨科以新鮮尸體標本操作為特色，連續舉辦了 7 屆全國脊柱及關節和 2 屆圍關節創傷及肩關節鏡學習班，學員多為副高級以上醫師，得到了廣泛好評。在此基礎上，我們連續舉辦了兩屆中山骨科學術周，邀請了顧玉東、戴尅戎、邱貴興、付小兵院士及侯樹勛、王巖、田偉、張英澤、王坤正、姜保國、邱勇、楊惠林、袁文、姜建元、張長青等大師和來自美、德、法、日、韓、香港等國家和地區的國際著名教授以及各相關專業領軍專家，學術周場場爆滿，與會人數千余人。 第 3 屆中山骨科學術周將繼續邀請國內外著名專家，由董健主任擔任總論壇主席于 2017 年 4 月 19 日舉行多學科協作高峰論壇；脊柱論壇于 4 月 18 日–21 日舉行，論壇主席：董健主任、姜曉幸主任；關節論壇于 4 月 20 日–22 日舉行，論壇主席：閻作勤副院長、姚振均主任；創傷論壇于 4 月 21 日–23 日舉行，論壇主席：施德源主任、周建平主任；關節鏡論壇于 4 月 22 日–23 日舉行，論壇主席：林建平主任；骨腫瘤論壇于 4 月 23 日舉行，論壇主席：王毅超主任。 本屆學術周各學習班可分別報名，詳情請關注 http://www.zs-hospital.sh.cn/的“學術會議”欄和 http://www.zs-guke.cn/的“骨科公告”欄。實踐操作不接受現場報名，要參加操作的學員請先聯系陸醫師（手機：13917306891，座機：021-64041990 轉 2336）預先報名，操作報名截止日期為 2017 年 4 月 5 日。
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主辦：復旦大學附屬中山醫院骨科上海市中西醫結合學會骨傷科專業委員會上海醫師協會骨科醫師分會關節工作組中國臨床醫學雜志協辦：上海市醫學會骨科專業委員會上海市醫學會創傷專業委員會復旦大學基礎醫學院解剖與組織胚胎學系中華骨科雜志中華創傷雜志2016-12-27 |
椎間盤退變是下腰痛、頸部疼痛及相關功能障礙的主要病因。椎間盤退變的機制較為復雜，目前研究表明終板軟骨細胞（endplate chondrocytes，EPCs）退變及其細胞外基質降解會加速椎間盤退變[1]。近年研究顯示，促炎性細胞因子如 IL-1β 在終板軟骨退變中起促進作用，在退變及突出椎間盤中的表達也有所升高[2]。蜂毒肽（Melittin）是從西方蜂蜜中提取出的一種生物多肽，具有生物和藥理作用，包括抗菌、抗毒、抗炎及抗癌效用。研究表明，Melittin 通過抑制基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的表達，從而起到抑制 EPCs 細胞外基質降解、延緩椎間盤退變進展的作用[3]。本實驗通過觀察 Melittin 對 IL-1β 誘導的大鼠 EPCsⅡ型膠原表達的影響，探討其對終板軟骨的作用。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4 周齡 SD 大鼠 10 只，雌雄不限，體質量（100±10）g，由蚌埠醫學院實驗動物中心提供。胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶（Sigma 公司，美國）；DMEM/F12、FBS（HyClone 公司，美國）；兔抗Ⅱ型膠原單克隆抗體、兔抗 MMP-3 單克隆抗體、二抗山羊抗兔抗體（Abcam 公司，英國）；重組大鼠 IL-1β（Pepro Tech 公司，美國）；Melittin（安徽博美生物科技有限公司）；苯甲基磺酰氟（phenylmethane-sulfonyl fluoride，PMSF）、增強型 RIPA 裂解液（武漢博士德生物工程有限公司）。倒置顯微鏡、倒置熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）；細胞孵育箱（Thermo 公司，美國）；臺式離心機、PCR 儀（Eppen-dorf 公司，德國）；全自動酶標儀（Bio Tek 公司，美國）；凝膠系統成像儀（Bio-Rad 公司，美國）。
1.2 大鼠 EPCs 培養及鑒定
1.2.1 細胞分離培養 取 10 只 SD 大鼠，采用腹腔注射戊巴比妥鈉（150 mg/kg）處死，移入 75% 乙醇中浸泡消毒 10 min 后置于超凈工作臺。取后正中切口，顯露整個腰椎，分離周圍附著軟組織后取出；移入裝有 PBS 的培養皿中洗滌 5 min，使用薄刀片削取位于椎體及椎間盤之間的淡白色薄層軟骨，放入含 10%FBS 及 1% 雙抗的 DMEM/F12 培養基中，剪碎至 0.5 mm3。將剪碎的終板軟骨以 0.25% 胰蛋白酶 37℃ 消化 5 min 后，轉入 15 mL 離心管中，4℃ 以離心半徑 15 cm、1 000 r/min 離心 5 min；棄上清后加入 2%Ⅱ型膠原酶，于 37℃、5% CO2 孵育箱中過夜。次日，同上法離心 5 min 后棄上清，加入含 10% FBS 及 1% 雙抗的 DMEM/F12 培養基，以 2×105 個/mL密度種植于培養瓶中，于 37℃、5% CO2 孵育箱中培養。每 3 天換液 1 次，換液后采用倒置顯微鏡觀察細胞形態。待原代細胞達 70%～80% 融合時，用 0.25% 胰蛋白酶消化傳代，倒置顯微鏡觀察細胞形態變化。
1.2.2 細胞鑒定 ① 甲苯胺藍染色觀察：分別取第 1、5 代細胞用 0.25% 胰蛋白酶消化后，以 1×105 個/mL密度接種于鋪有多聚賴氨酸玻片的 6 孔培養板中進行細胞爬片，待其爬滿后取部分切片用 4% 多聚甲醛固定，甲苯胺藍染色后中性樹膠封片，倒置顯微鏡下觀察甲苯胺藍染色情況。② Ⅱ型膠原免疫熒光染色觀察：取上述細胞爬片，用 0.25% Triton X-100 穿透細胞膜，1% 牛血清白蛋白封閉后孵育一抗兔抗Ⅱ型膠原單克隆抗體，4℃ 過夜，標記Ⅱ型膠原蛋白，次日孵育二抗山羊抗兔抗體（熒光標記一抗）并行 DAPI 染核后，抗熒光衰滅封片劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞熒光表達情況。
1.3 IL-1β 及 Melittin 最適濃度選擇
取生長良好的第 3 代 EPCs，以 0.25% 胰蛋白酶消化后制成密度為 2×105 個/mL的細胞懸液，接種于 96 孔培養板，每孔 100 μL。篩選 IL-1β 最適濃度時分為 4 組（每組設 4 個復孔），各組細胞中分別加入 0、5、10、20 ng/mL IL-1β 進行干預；篩選 Melittin 最適濃度時分為 5 組（每組設 4 個復孔），各組細胞中分別加入 0、0.5、1.0、2.0、4.0 μg/mL Melittin 進行干預。分別于干預 24、48 h 后采用 MTT 法測定各組吸光度（A）值，以是否降低細胞活性作為標準選擇 IL-1β 及 Melittin 的最適濃度。
1.4 Melittin 對 IL-1β 誘導的大鼠 EPCsⅡ型膠原表達的影響
取生長良好的第 3 代 EPCs，以 2×105 個/mL密度接種于細胞培養瓶中，于 37℃、5%CO2 孵育箱中培養 48 h 后，根據干預條件不同隨機分為 4 組，每組 4 瓶。A 組為正常組，不加任何藥物；B 組加入最適濃度的 IL-1β；C 組加入最適濃度的 Melittin；D 組加入最適濃度的 IL-1β 及 Melittin。干預培養 48 h 后，將各組細胞使用胰蛋白酶消化法提取細胞后，加入細胞裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1）200 μL 提取蛋白，然后加入 SDS-PAGE 上樣緩沖液置于 PCR 儀中 15 min、99℃ 制備蛋白樣品，殘余樣品使用酶標儀測定蛋白濃度。在 10%SDS-PAGE 中每孔上樣 20 μg 蛋白樣品，分別以 80 V、15 min，120 V、70 min 進行積層膠和分離膠電泳后，以 260 mA、150 min 轉聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。將已轉成的 PVDF 膜封閉 2 h 后，加入一抗兔抗Ⅱ型膠原單克隆抗體孵育 4℃ 過夜，次日洗膜后加入二抗山羊抗兔抗體孵育 1 h，再次洗膜后將 PVDF 膜置于凝膠系統成像儀中曝光成像。將成像的蛋白表達條帶使用 Tanon GIS 系列數碼凝膠圖像處理系統計算灰度值。
1.5 統計學方法
采用 SPSS13.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 EPCs 形態觀察及鑒定
倒置顯微鏡觀察示，原代培養的 EPCs 排列緊密、折光性強，細胞呈圓形；第 1 代細胞多呈多角形；傳至第 5 代后，細胞增殖能力逐漸減弱，細胞形態向梭形轉變。甲苯胺藍染色示第 1 代細胞的細胞核被染成紫色，細胞質中的酸性黏液物質（如蛋白多糖）被染成深藍色；傳至第 5 代后細胞質顏色逐漸變淺。第 1、5 代細胞Ⅱ型膠原免疫熒光染色觀察示，在不同波段熒光激發下，可見細胞骨架部分呈陽性表達（呈綠色熒光），而細胞核區域未見明顯陽性表達，即細胞質及細胞膜區域特異性表達Ⅱ型膠原，細胞核使用 DAPI 復染呈藍色。見圖 1。
圖1
大鼠腰椎 EPCs 形態觀察及鑒定 a. 第 1 代細胞倒置顯微鏡觀察（×200）；b. 第 5 代細胞倒置顯微鏡觀察（×200）；c. 第 1 代細胞甲苯胺藍染色觀察（倒置顯微鏡×200）；d. 第 5 代細胞甲苯胺藍染色觀察（倒置顯微鏡×200）；e. 第 1 代細胞免疫熒光染色觀察（倒置熒光顯微鏡×200）；f. 第 5 代細胞免疫熒光染色觀察（倒置熒光顯微鏡×200）
Figure1.
Morphology observation and identification of rat lumbar EPCs a. The first generation cells under inverted microscope (×200); b. The fifth generation cells under inverted microscope (×200); c. Toluidine blue staining of the first generation cells (Inverted microscope×200); d. Toluidine blue staining of the fifth generation cells (Inverted microscope×200); e. Immunofluorescence staining of the first generation cells (Inverted fluorescence microscope×200); f. Immunofluorescence staining of the fifth generation cells (Inverted fluorescence microscope×200)
2.2 IL-1β 及 Melittin 最適濃度選擇
干預 24、48 h，IL-1β 及 Melittin 對 EPCs 均有抑制作用，并呈劑量依賴性。IL-1β 20 ng/mL 組A 值顯著低于 0、5、10 ng/mL 組，Melittin 2.0、4.0 μg/mL 組A 值顯著低于 0、0.5、1.0 μg/mL 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 2。該結果提示 EPCs 在 IL-1β 20 ng/mL 和 Melittin 2.0、4.0 μg/mL 濃度下出現細胞活性明顯降低，故取上一個濃度梯度。因此 IL-1β 及 Melittin 的最適濃度分別為 10 ng/mL 和 1.0 μg/mL。
圖2
MTT 法確定 IL-1β 及 Melittin 的最適濃度 a. IL-1β 干預 24 h；b. IL-1β 干預 48 h；c. Melittin 干預 24 h；d. Melittin 干預 48 h
Figure2.
Determination of the optimal concentration of IL-1β and Melittin by MTT assay a. IL-1β intervention for 24 hours; b. IL-1β intervention for 48 hours; c. Melittin intervention for 24 hours; d. Melittin intervention for 48 hours
2.3 Melittin 對 IL-1β 誘導的大鼠 EPCsⅡ型膠原表達的影響
與 A 組比較，B 組 IL-1β 干預后Ⅱ型膠原表達明顯減少，C 組 Melittin 干預后Ⅱ型膠原表達明顯增加，而 D 組與 A 組比較無明顯差異。見圖 3。A、B、C、D 組Ⅱ型膠原相對表達量分別為 0.991±0.024、0.474±0.127、1.913±0.350、1.159±0.297，除 A、D 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）外，其余組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
圖3
Western blot 法檢測各組Ⅱ型膠原表達 1：A 組 2：B 組 3：C 組 4：D 組
Figure3.
Detection of Col-II expression by Western blot assay in each group 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D
3 討論
在成人體內，椎間盤是最大的無血管結構，椎間盤中的細胞存活所依賴的血管終止于骨性椎體終板鄰近的軟骨下骨/髓核。椎間盤細胞中的營養素及代謝物通過擴散作用來提供和交換[4-5]。EPCs 主要表達具有軟骨相關性的Ⅱ型膠原及蛋白多糖，并且在椎體與椎間盤之間的營養交換中起重要作用。研究表明終板軟骨的退變早于椎間盤退變，并可繼發椎間盤退變[6]。終板軟骨的生化結構構成對保證椎間盤的生物穩定性具有重要作用，其中Ⅱ型膠原及蛋白多糖含量的減少會繼發髓核細胞及其細胞外基質成分的改變，蛋白含量也與椎間盤與椎體之間的營養物質運輸密切相關。而軟骨終板滲透并傳遞營養物質的功能取決于兩個方面：一是物質的本身特性，如分子形狀、相對分子質量大小及所帶電荷等；二是終板軟骨中蛋白多糖及水分的含量[7-8]。
Melittin 作為蜂毒中主要有毒化合物的殘基，是一個包含有 26 個氨基酸的小分子蛋白。其分子結構具有親水、親脂特性，故具有去垢樣功能。由于其具有抗粥樣動脈硬化功能，繼而引起了研究者的廣泛關注。體內實驗表明，Melittin 具有抑制脂多糖/脂肪所誘導的黏附分子（如細胞因子等）表達的功能。近期研究表明，在大鼠相關性椎間盤退變模型中，Melittin 能夠通過抑制 NF-κB 的活性來發揮一定的延緩及改善椎間盤退變作用[9]。
NF-κB 信號在細胞對炎癥、應激和損傷的反應中起重要作用。NF-κB 是由一大類結構相關的轉錄因子組成，在哺乳類動物中包括 5 種蛋白亞單位，RelA 或 p65、c-Rel、RelB、p50 和 p52。NF-κB 作為一個同源二聚體或異源二聚體存在，其中 p50-p65 異源二聚體是控制 NF-κB 主要調控基因表達的最常見形式。NF-κB 的長期激活與組織老化和年齡相關性退變疾病有關，包括骨骼肌肉疾病和骨質疏松癥等。NF-κB 同時也參與了年齡相關性椎間盤退變[10]。在椎間盤組織中，NF-κB 的活性顯示了與氧化應激和老化退變之間的聯系[11]。椎間盤退變疾病中均可發現 NF-κB 活性增高，相比于無癥狀的椎間盤，有癥狀的椎間盤具有較高的促炎性細胞因子水平，其中典型的是 NF-κB 靶基因，如 IL-1β、IL-6 及 IL-8、TNF-α[12]。
無論是椎間盤還是終板軟骨的退變都與炎性因子相關，其中以 IL-1β 較為突出。IL-1β 高表達于退變椎間盤中，其通過調節趨化因子表達來進一步引發椎間盤中的炎性反應[13-16]。IL-1β 通過誘導椎間盤中的趨化因子配體 3 表達來激活 NF-κB、MAPK 等通路，進而增加 ADAMTS 及 SDC4 的表達，導致椎間盤及終板細胞外基質發生降解[17-18]。此外，IL-1β 通過激活 MMP，進而促使椎間盤及 EPCs 細胞外基質降解[19-20]。故本實驗中選用 IL-1β 誘導來建立體外大鼠 EPCs 退變模型。
本實驗發現，與正常組比較，IL-1β 誘導后 EPCs 中的Ⅱ型膠原表達下調，而進行 Melittin 干預后，Ⅱ型膠原表達下調被抑制。因此，Melittin 通過抑制 EPCs 細胞外基質成分的降解，從而具有抗炎、抗老化作用，為臨床應用 Melittin 防治椎間盤退變相關性疾病提供一定的理論依據。本實驗的不足之處在于僅研究了 Melittin 對Ⅱ型膠原表達的影響情況，而 Melittin 對 MMP 家族表達的影響以及 Melittin 如何從信號轉導通路角度延緩終板軟骨退變，還需進一步實驗研究。
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