引用本文： 焦海山, 肖波, 王曉冬, 李東印, 宋悅寧, 鄭輝, 劉曉梅. 術中短期低頻電刺激對陳舊性周圍神經缺損再生能力的影響. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(3): 335-344. doi: 10.7507/1002-1892.201609024 復制
周圍神經損傷是外科常見損傷，應盡早修復，但因各種原因未能在急性期得到及時處理的陳舊性周圍神經損傷仍屢見不鮮。由于受傳統理論和客觀修復難度的影響，臨床上對陳舊性周圍神經損傷，特別是高位離斷傷的治療效果往往不理想，常出現損傷神經對應靶肌肉癱瘓和相應區域的感覺障礙，嚴重影響患者生活質量。在眾多陳舊性神經損傷修復研究中，盡管能觀察到一定的神經再生現象，但從功能恢復效果看，離臨床應用要求還有很大差距[1-3]。近年來，術中短期低頻電刺激（short-term low-frequency electrical stimulation，SLES）在神經再生及功能恢復中的作用越來越引起研究者的重視，文獻報道術中 SLES 可能通過提高內源性神經因子的表達等途徑來促進損傷神經的再生[4-7]。結合陳舊性神經損傷的臨床特征（不可避免地會出現較大神經缺損）和神經缺損修復的金標準（切取非重要部位神經行自體神經移植），本課題組在前期研究[2,8-9]已成功制備出模擬臨床實際的陳舊性周圍神經缺損模型，并觀察到神經缺損有限再生；在此基礎上，本研究將 SLES 應用于陳舊性周圍神經缺損修復實驗中，使用免疫熒光染色、逆行示蹤、電鏡觀察等形態學研究方法評估神經再生效果，旨在尋找能提高陳舊性周圍神經缺損再生能力的途徑。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
小鼠抗生長相關蛋白 43（growth-associated protein 43，GAP-43）單抗、兔抗腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）多抗、羊抗小鼠 IgG-FITC 二抗、羊抗兔 IgG-TRITC 二抗、小鼠抗神經絲蛋白（neurofilament，NF）單抗、兔抗可溶性蛋白 100（soluble protein 100，S-100）多抗（武漢博士德生物工程有限公司）；5% 熒光金（Fluorochrome 公司，美國）。TI CFIS60 倒置熒光顯微鏡（Nikon 公司，日本）；JEM1230 透射電鏡（JEOL 公司，日本）。
1.2 大鼠陳舊性周圍神經缺損模型制備
成年雌性 SD 大鼠 30 只，體質量 160～180 g，由中國科學院上海實驗動物中心提供。大鼠以 3% 戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，無菌條件下暴露左側坐骨神經，于股中部切除坐骨神經 6 mm，近、遠側斷端神經分別翻轉 180°，以 9-0 醫用錦綸單絲線縫合固定于不同肌間隙中。檢查無出血后縫閉切口。
飼養 1 個月后，大鼠同上法麻醉后，無菌條件下自原切口進入，暴露左側坐骨神經，適當修剪近、遠側神經斷端，制成大鼠坐骨神經 13 mm 長陳舊性缺損模型。將大鼠模型隨機分為實驗組和對照組，每組 15 只。兩組均切取右側股中部 13 mm 長正常坐骨神經橋接至左側坐骨神經缺損處；右側取材處神經曠置，切口逐層縫閉。神經橋接修復后，實驗組予以 SLES 處理；具體步驟：陰性電極固定于近側端神經干上，陽性電極固定于神經附近的骨骼肌上，以方波低頻（20 Hz）電刺激（3 V，0.1 ms）1 h。對照組同實驗組方法放置電極，但不予以刺激。術畢縫閉切口，繼續飼養至指定時間點后取材進行觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 神經元中相關因子表達觀察 修復術后 1、2、7 d 兩組各取 2 只大鼠，經心臟灌注后，取部分脊髓腰膨大段（L4、5）以及相應背根神經節，浸入 4% 多聚甲醛溶液，經梯度蔗糖溶液沉底后冰凍切片（脊髓片厚 25 μm、背根神經節片厚 15 μm），行抗 GAP-43 及 BDNF 雙重免疫熒光染色。其中，一抗：小鼠抗 GAP-43 單抗（1∶300）、兔抗 BDNF 多抗（1∶200）；二抗：羊抗小鼠 IgG-FITC（1∶250）、羊抗兔 IgG-TRITC（1∶250）。倒置熒光顯微鏡下觀察 GAP-43 和 BDNF 表達情況。
1.3.2 熒光金逆行示蹤實驗 修復術后 3 個月兩組各取 2 只大鼠，同上法麻醉，在遠側吻合口以遠 5 mm 處用微量進樣針注射神經逆行示蹤劑 5% 熒光金 10 μL。繼續飼養 1 周后，經心臟灌注，取部分脊髓腰膨大段（L4、5）以及相應背根神經節，浸入適量 4% 多聚甲醛溶液，經梯度蔗糖溶液沉底后冰凍切片（片厚同前），倒置熒光顯微鏡觀察脊髓和背根神經節中神經元標記情況。
1.3.3 再生神經大體及形態學觀測 修復術后 3 個月，兩組剩余 7 只大鼠同上法麻醉后，原切口入路，先肉眼觀察再生神經。然后兩組各取 3 只行透射電鏡觀察，4 只行組織學及免疫熒光染色觀察。
組織學及免疫熒光染色觀察：切取橋接物及兩端相連的神經（遠側吻合口以遠取至 5 mm 以外），選取再生神經組織中段作冰凍切片，片厚 15 μm，橫切、縱切各留取 2 套切片，分別作 Meyer 神經三色染色和抗 NF 及 S-100 雙重免疫熒光染色。其中，一抗：小鼠抗 NF 單抗（1∶400）、兔抗 S-100 多抗（1∶200）；二抗：羊抗小鼠 IgG-FITC（1∶250）、羊抗兔 IgG-TRITC（1∶250）。光鏡下觀察再生神經形態。
透射電鏡觀察：取左側遠端吻合口以遠 5 mm 處神經組織，鈾-鉛染色，透射電鏡觀察再生神經軸突、髓鞘生長狀況。采用圖像分析系統進行圖像處理，根據 Jiao 等[8]方法測量有髓神經纖維、軸突直徑及髓鞘厚度，并計算有髓神經纖維密度（高倍鏡視野內軸突數/相應視野面積）及 G 比值（軸突直徑/有髓神經纖維直徑）。
1.3.4 腓腸肌形態學觀測 術后觀察兩組大鼠左側腓腸肌萎縮情況。修復術后 3 個月，切取左側腓腸肌，稱重并計算相對濕重比（左側腓腸肌質量/體質量×100%）。常規固定后，梯度蔗糖溶液沉底后冰凍切片，片厚 25 μm，作 Karnovsky-Root 運動終板膽堿酯酶組織學染色[10]，光鏡觀察運動終板形態并計數。
1.4 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 神經元中相關因子表達觀察
實驗組修復術后 1、2 d，術側對應脊髓橫切面中運動神經元和背根神經節橫切面內感覺神經元均開始出現 GAP-43 和 BDNF 表達上調，以 BDNF 上調更明顯；7 d 時表達逐漸下降。對照組修復術后對應運動神經元和感覺神經元中兩種因子表達上調較實驗組慢，至 7 d 時表達上調較明顯。見圖 1、2。
圖1
兩組修復術后各時間點脊髓橫切面抗 GAP-43 及 BDNF 雙重免疫熒光染色觀察（倒置熒光顯微鏡×160） 從左至右依次為 GAP-43 染色、BDNF 染色及合圖 a. 實驗組 1 d；b. 實驗組 2 d；c. 實驗組 7 d；d. 對照組 1 d；e. 對照組 2 d；f. 對照組 7 d
Figure1.
Immunofluorescence double staining for GAP-43 and BDNF on the transversely sectioned spinal cord in 2 groups after repair (Fluorescence microscope×160) From left to right was GAP-43 staining, BDNF staining, and merge a. Experimental group at 1 day; b. Experimental group at 2 days; c. Experimental group at 7 days; d. Control group at 1 day; e. Control group at 2 days; f. Control group at 7 days
圖2
兩組修復術后各時間點背根神經節橫切面抗 GAP-43 和 BDNF 雙重免疫熒光染色觀察（倒置熒光顯微鏡×160） 從左至右依次為 GAP-43 染色、BDNF 染色及合圖 a. 實驗組 1 d；b. 實驗組 2 d；c. 實驗組 7 d；d. 對照組 1 d；e. 對照組 2 d；f. 對照組 7 d
Figure2.
Immunofluorescence double staining for GAP-43 and BDNF on the transversely sectioned DRGs in 2 groups after repair (Fluorescence microscope×160) From left to right was GAP-43 staining, BDNF staining, and merge a. Experimental group at 1 day; b. Experimental group at 2 days; c. Experimental group at 7 days; d. Control group at 1 day; e. Control group at 2 days; f. Control group at 7 days
2.2 熒光金逆行示蹤實驗
實驗組與對照組大鼠注射逆行示蹤劑熒光金后 1 周，在其術側脊髓前角及相應背根神經節中均觀察到逆行標記呈藍色的神經元胞體。其中，實驗組脊髓中運動神經元多于對照組。見圖 3。
圖3
兩組注射熒光金后 1 周倒置熒光顯微鏡觀察（×160） a. 實驗組脊髓；b. 實驗組背根神經節；c. 對照組脊髓；d. 對照組背根神經節
Figure3.
Fluorescence microscope observation at 1 week after FG retrograde tracing in 2 groups (×160) a. Spinal cord of experimental group; b. DRGs of experimental group; c. Spinal cord of control group; b. DRGs of control group
2.3 再生神經大體及形態學觀測
2.3.1 大體觀察 兩組再生神經與兩端神經連接良好，連接處無明顯膨大、無腫脹，無明顯粘連，表面血管生長清晰可見。見圖 4。
圖4
兩組修復術后 3 個月再生神經大體觀察 a. 實驗組；b. 對照組
Figure4.
Gross view of regenerated nerve at 3 months after repair in 2 groups a. Experimental group; b. Control group
2.3.2 組織形態觀察 兩組中段再生神經組織橫切面 Meyer 神經三色染色示髓鞘呈紅色，軸突呈藍綠色，神經纖維間均可見少量增生結締組織；縱切面抗 NF 與 S-100 雙重免疫熒光染色示髓鞘呈紅色熒光，軸突呈綠色熒光。兩組再生神經組織均生長良好，有髓神經纖維分布均勻，實驗組與對照組比較無明顯差異。見圖 5、6。
圖5
兩組修復術后 3 個月再生神經中段橫切面 Meyer 神經三色染色觀察 a. 實驗組（×160）；b. 實驗組（×640）；c. 對照組（×160）；d. 對照組（×640）
Figure5.
Meyer’s trichrome staining observation on transversely sectioned mid-portion of the regenerated segment at 3 months after repair in 2 groups a. Experimental group (×160); b. Experimental group (×640); c. Control group (×160); d. Control group (×640)
圖6
兩組修復術后 3 個月再生神經中段縱切面抗 NF 與 S-100 雙重免疫熒光染色（倒置熒光顯微鏡×160） 從左至右依次為 NF 染色、S-100 染色及合圖 a. 實驗組；b. 對照組
Figure6.
Immunofluorescence double staining for NF and S-100 on the longitudinal sectioned mid-portion of the regenerated segment at 3 months after repair in 2 groups (Fluorescence microscope×160) From left to right was NF staining, S-100 staining, and merge a. Experimental group; b. Control group
透射電鏡觀察：實驗組與對照組均可見再生神經纖維成簇分布，再生有髓神經纖維的髓鞘結構均致密而均勻，板層結構清晰。見圖 7。定量分析顯示，實驗組軸突直徑、髓鞘厚度、有髓神經纖維密度及 G 比值均略高于對照組，但差異無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
圖7
兩組修復術后 3 個月神經組織透射電鏡觀察 a. 實驗組（×6 000）；b. 實驗組（×50 k）；c. 對照組（×6 000）
Figure7.
Transmission electron microscope observation of distal sciatic nerve at 3 months after repair in 2 groups a. Experimental group (×6 000); b. Experimental group (×50 k); c. Control group (×6 000)
表1
兩組再生神經形態學指標比較（
n=3，
）
Table1.
Comparison of the morphology index of regenerative nerve between 2 groups (
n=3,
)
2.4 腓腸肌形態學觀測
2.4.1 大體觀察 修復術后隨時間延長，兩組大鼠術側腓腸肌均有不同程度萎縮。術后 3 個月取材時發現，實驗組術側靶肌肉萎縮明顯，其程度與對照組類似，肌肉色澤紅潤，質地較柔軟。
2.4.2 腓腸肌相對濕重比檢測 實驗組術側腓腸肌相對濕重比為 0.275%±0.021%，高于對照組的 0.223%±0.021%，比較差異有統計學意義（t=4.633，P=0.000）。
2.4.3 腓腸肌組織形態觀察 術側腓腸肌冰凍切片行 Karnovsky-Root 運動終板膽堿酯酶組織學染色示，兩組均可見運動終板，呈圓形或橢圓形，深棕色，其中實驗組運動終板形態和數量略優于對照組。見圖 8。
圖8
兩組修復術后 3 個月術側腓腸肌 Karnovsky-Root 運動終板膽堿酯酶組織學染色 a. 實驗組（×160）；b. 實驗組（×640）；c. 對照組（×160）；d. 對照組（×640）
Figure8.
Karnovsky-Root cholinesterase staining observation of the motor endplate on transverse sections of gastrocnemius muscle at the operated side at 3 months after repair in 2 groups a. Experimental group (×160); b. Experimental group (×640); c. Control group (×160); d. Control group (×640)
3 討論
3.1 SLES 對近端神經元的影響
有關電刺激對神經再生的影響研究已較多，早期研究表明電刺激能促進軸突芽生和某些早期功能的恢復[11-12]。近年有研究表明 SLES 可通過喚醒更多神經元啟動再生，提高再生率[13]；激活神經元胞體上的電壓依從性鈣通道，進一步激活胞內腺苷酸環化酶/cAMP-依賴性蛋白激酶系統[14-15]，促進損傷神經胞體早期表達系列內源性神經營養因子，如 BDNF、trkB 及 GAP-43 等，早期啟動神經再生，并助其通過損傷點進入遠端相應功能支，從而縮短神經再生時間[6,16-17]。本研究在修復術后 1、2、7 d 分別取材觀察缺損神經對應運動、感覺神經元中 BDNF、GAP-43 的表達情況，結果與前述報道基本相符。但由于大多數研究都是使用的急性損傷模型[4-6,14-15,18-19]，相應神經元對 SLES 的響應較為迅速且上調水平較高。如 Al-Majed 等[16-17]研究發現，術后 1 h 運動神經元中即開始出現 BDNF、trkB mRNA 表達上調，2 d 時達到峰值，7 d 時二者均下降。本研究采用的是神經缺損達 1 個月的陳舊性周圍神經缺損模型，故損傷神經元對 SLES 的響應速度和相關因子的上調水平低于急性損傷模型。
3.2 SLES 對陳舊性缺損神經再生過程的促進作用
導致周圍神經缺損后再生難度大的原因較多，諸如：近端神經元再生率低；軸突再生速度慢，再生距離長；遠端再生微環境逐漸退變，難以維持漫長的再生時間等[7]。對陳舊性神經缺損，遠端靶器官等待時間則更長。因此，能縮短上述過程的因素均有利于陳舊性神經缺損的再生。本研究逆行示蹤實驗顯示實驗組脊髓中運動神經元明顯多于對照組，透射電鏡觀察顯示實驗組神經發育亦優于對照組，Karnovsky-Root 運動終板膽堿酯酶組織學染色示實驗組運動終板發育相對較好，運動終板數量和形態都優于對照組。以上研究結果提示，SLES 在早期啟動了神經再生的進程，縮短了整體再生時間，使實驗組再生神經發育相對成熟，最終表現出實驗組術側腓腸肌相對濕重比優于對照組。另外，本研究制備的陳舊性周圍神經缺損模型為無自發再生可能的長距離神經缺損（大鼠神經缺損>12 mm 被認為是長距離神經缺損[20-21]），結合本研究結果表明，對短期（1 個月）長距離陳舊性周圍神經缺損，SLES 在一定程度上起到促進神經再生作用。
3.3 進一步優化電刺激方式
SLES 是 Al-Majed 等[22]在研究如何加快急性周圍神經損傷再生過程中的運動神經優先選擇期，以便提高再支配準確性時提出的。他們比較了 1 h、1 d、1～2 周的低頻電刺激對上述過程的作用，發現短期（1 h、1 d）與長期（1、2 周）電刺激在促經神經再生、加快運動神經優先選擇期方面表現出類似效果，并且這種短期電刺激對神經再生的作用可被鈉通道阻滯劑河豚毒素阻斷，因此他們認為其主要是通過影響損傷神經對應的近端神經元發揮作用，而短期電刺激更適合臨床應用。而對于陳舊性周圍神經缺損，有研究發現神經干切斷后 1 個月，近端脊髓前角中神經元丟失最多，減至對照側的 60%，但之后數量無明顯變化，一直至 12 個月[23-24]。陳舊性周圍神經缺損所導致的近端神經元減少，以及失神經損傷的神經元所出現的胞體先腫脹后萎縮等變化，均導致了本研究中觀察到的陳舊性周圍神經缺損對應神經元對 SLES 的響應速度和相關因子的上調水平不如急性損傷模型的結果，從而影響了近端神經元再生率。因此，對于陳舊性周圍神經缺損，有必要進一步優化電刺激的方式，比如術中直接刺激與術后體外刺激相結合，刺激近端神經元與激活遠端再生微環境、保護靶器官相結合，使電刺激更好地發揮促進陳舊性周圍神經再生的作用。
綜上述，SLES 對短期（1 個月）長距離陳舊性周圍神經缺損的神經再生起到一定促進作用。但由于陳舊性周圍神經近端神經元和遠端微環境的改變，影響了 SLES 的促神經再生作用，有必要進一步優化電刺激方式，更好地發揮促進陳舊性周圍神經再生的作用。
周圍神經損傷是外科常見損傷，應盡早修復，但因各種原因未能在急性期得到及時處理的陳舊性周圍神經損傷仍屢見不鮮。由于受傳統理論和客觀修復難度的影響，臨床上對陳舊性周圍神經損傷，特別是高位離斷傷的治療效果往往不理想，常出現損傷神經對應靶肌肉癱瘓和相應區域的感覺障礙，嚴重影響患者生活質量。在眾多陳舊性神經損傷修復研究中，盡管能觀察到一定的神經再生現象，但從功能恢復效果看，離臨床應用要求還有很大差距[1-3]。近年來，術中短期低頻電刺激（short-term low-frequency electrical stimulation，SLES）在神經再生及功能恢復中的作用越來越引起研究者的重視，文獻報道術中 SLES 可能通過提高內源性神經因子的表達等途徑來促進損傷神經的再生[4-7]。結合陳舊性神經損傷的臨床特征（不可避免地會出現較大神經缺損）和神經缺損修復的金標準（切取非重要部位神經行自體神經移植），本課題組在前期研究[2,8-9]已成功制備出模擬臨床實際的陳舊性周圍神經缺損模型，并觀察到神經缺損有限再生；在此基礎上，本研究將 SLES 應用于陳舊性周圍神經缺損修復實驗中，使用免疫熒光染色、逆行示蹤、電鏡觀察等形態學研究方法評估神經再生效果，旨在尋找能提高陳舊性周圍神經缺損再生能力的途徑。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
小鼠抗生長相關蛋白 43（growth-associated protein 43，GAP-43）單抗、兔抗腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）多抗、羊抗小鼠 IgG-FITC 二抗、羊抗兔 IgG-TRITC 二抗、小鼠抗神經絲蛋白（neurofilament，NF）單抗、兔抗可溶性蛋白 100（soluble protein 100，S-100）多抗（武漢博士德生物工程有限公司）；5% 熒光金（Fluorochrome 公司，美國）。TI CFIS60 倒置熒光顯微鏡（Nikon 公司，日本）；JEM1230 透射電鏡（JEOL 公司，日本）。
1.2 大鼠陳舊性周圍神經缺損模型制備
成年雌性 SD 大鼠 30 只，體質量 160～180 g，由中國科學院上海實驗動物中心提供。大鼠以 3% 戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，無菌條件下暴露左側坐骨神經，于股中部切除坐骨神經 6 mm，近、遠側斷端神經分別翻轉 180°，以 9-0 醫用錦綸單絲線縫合固定于不同肌間隙中。檢查無出血后縫閉切口。
飼養 1 個月后，大鼠同上法麻醉后，無菌條件下自原切口進入，暴露左側坐骨神經，適當修剪近、遠側神經斷端，制成大鼠坐骨神經 13 mm 長陳舊性缺損模型。將大鼠模型隨機分為實驗組和對照組，每組 15 只。兩組均切取右側股中部 13 mm 長正常坐骨神經橋接至左側坐骨神經缺損處；右側取材處神經曠置，切口逐層縫閉。神經橋接修復后，實驗組予以 SLES 處理；具體步驟：陰性電極固定于近側端神經干上，陽性電極固定于神經附近的骨骼肌上，以方波低頻（20 Hz）電刺激（3 V，0.1 ms）1 h。對照組同實驗組方法放置電極，但不予以刺激。術畢縫閉切口，繼續飼養至指定時間點后取材進行觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 神經元中相關因子表達觀察 修復術后 1、2、7 d 兩組各取 2 只大鼠，經心臟灌注后，取部分脊髓腰膨大段（L4、5）以及相應背根神經節，浸入 4% 多聚甲醛溶液，經梯度蔗糖溶液沉底后冰凍切片（脊髓片厚 25 μm、背根神經節片厚 15 μm），行抗 GAP-43 及 BDNF 雙重免疫熒光染色。其中，一抗：小鼠抗 GAP-43 單抗（1∶300）、兔抗 BDNF 多抗（1∶200）；二抗：羊抗小鼠 IgG-FITC（1∶250）、羊抗兔 IgG-TRITC（1∶250）。倒置熒光顯微鏡下觀察 GAP-43 和 BDNF 表達情況。
1.3.2 熒光金逆行示蹤實驗 修復術后 3 個月兩組各取 2 只大鼠，同上法麻醉，在遠側吻合口以遠 5 mm 處用微量進樣針注射神經逆行示蹤劑 5% 熒光金 10 μL。繼續飼養 1 周后，經心臟灌注，取部分脊髓腰膨大段（L4、5）以及相應背根神經節，浸入適量 4% 多聚甲醛溶液，經梯度蔗糖溶液沉底后冰凍切片（片厚同前），倒置熒光顯微鏡觀察脊髓和背根神經節中神經元標記情況。
1.3.3 再生神經大體及形態學觀測 修復術后 3 個月，兩組剩余 7 只大鼠同上法麻醉后，原切口入路，先肉眼觀察再生神經。然后兩組各取 3 只行透射電鏡觀察，4 只行組織學及免疫熒光染色觀察。
組織學及免疫熒光染色觀察：切取橋接物及兩端相連的神經（遠側吻合口以遠取至 5 mm 以外），選取再生神經組織中段作冰凍切片，片厚 15 μm，橫切、縱切各留取 2 套切片，分別作 Meyer 神經三色染色和抗 NF 及 S-100 雙重免疫熒光染色。其中，一抗：小鼠抗 NF 單抗（1∶400）、兔抗 S-100 多抗（1∶200）；二抗：羊抗小鼠 IgG-FITC（1∶250）、羊抗兔 IgG-TRITC（1∶250）。光鏡下觀察再生神經形態。
透射電鏡觀察：取左側遠端吻合口以遠 5 mm 處神經組織，鈾-鉛染色，透射電鏡觀察再生神經軸突、髓鞘生長狀況。采用圖像分析系統進行圖像處理，根據 Jiao 等[8]方法測量有髓神經纖維、軸突直徑及髓鞘厚度，并計算有髓神經纖維密度（高倍鏡視野內軸突數/相應視野面積）及 G 比值（軸突直徑/有髓神經纖維直徑）。
1.3.4 腓腸肌形態學觀測 術后觀察兩組大鼠左側腓腸肌萎縮情況。修復術后 3 個月，切取左側腓腸肌，稱重并計算相對濕重比（左側腓腸肌質量/體質量×100%）。常規固定后，梯度蔗糖溶液沉底后冰凍切片，片厚 25 μm，作 Karnovsky-Root 運動終板膽堿酯酶組織學染色[10]，光鏡觀察運動終板形態并計數。
1.4 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 神經元中相關因子表達觀察
實驗組修復術后 1、2 d，術側對應脊髓橫切面中運動神經元和背根神經節橫切面內感覺神經元均開始出現 GAP-43 和 BDNF 表達上調，以 BDNF 上調更明顯；7 d 時表達逐漸下降。對照組修復術后對應運動神經元和感覺神經元中兩種因子表達上調較實驗組慢，至 7 d 時表達上調較明顯。見圖 1、2。
圖1
兩組修復術后各時間點脊髓橫切面抗 GAP-43 及 BDNF 雙重免疫熒光染色觀察（倒置熒光顯微鏡×160） 從左至右依次為 GAP-43 染色、BDNF 染色及合圖 a. 實驗組 1 d；b. 實驗組 2 d；c. 實驗組 7 d；d. 對照組 1 d；e. 對照組 2 d；f. 對照組 7 d
Figure1.
Immunofluorescence double staining for GAP-43 and BDNF on the transversely sectioned spinal cord in 2 groups after repair (Fluorescence microscope×160) From left to right was GAP-43 staining, BDNF staining, and merge a. Experimental group at 1 day; b. Experimental group at 2 days; c. Experimental group at 7 days; d. Control group at 1 day; e. Control group at 2 days; f. Control group at 7 days
圖2
兩組修復術后各時間點背根神經節橫切面抗 GAP-43 和 BDNF 雙重免疫熒光染色觀察（倒置熒光顯微鏡×160） 從左至右依次為 GAP-43 染色、BDNF 染色及合圖 a. 實驗組 1 d；b. 實驗組 2 d；c. 實驗組 7 d；d. 對照組 1 d；e. 對照組 2 d；f. 對照組 7 d
Figure2.
Immunofluorescence double staining for GAP-43 and BDNF on the transversely sectioned DRGs in 2 groups after repair (Fluorescence microscope×160) From left to right was GAP-43 staining, BDNF staining, and merge a. Experimental group at 1 day; b. Experimental group at 2 days; c. Experimental group at 7 days; d. Control group at 1 day; e. Control group at 2 days; f. Control group at 7 days
2.2 熒光金逆行示蹤實驗
實驗組與對照組大鼠注射逆行示蹤劑熒光金后 1 周，在其術側脊髓前角及相應背根神經節中均觀察到逆行標記呈藍色的神經元胞體。其中，實驗組脊髓中運動神經元多于對照組。見圖 3。
圖3
兩組注射熒光金后 1 周倒置熒光顯微鏡觀察（×160） a. 實驗組脊髓；b. 實驗組背根神經節；c. 對照組脊髓；d. 對照組背根神經節
Figure3.
Fluorescence microscope observation at 1 week after FG retrograde tracing in 2 groups (×160) a. Spinal cord of experimental group; b. DRGs of experimental group; c. Spinal cord of control group; b. DRGs of control group
2.3 再生神經大體及形態學觀測
2.3.1 大體觀察 兩組再生神經與兩端神經連接良好，連接處無明顯膨大、無腫脹，無明顯粘連，表面血管生長清晰可見。見圖 4。
圖4
兩組修復術后 3 個月再生神經大體觀察 a. 實驗組；b. 對照組
Figure4.
Gross view of regenerated nerve at 3 months after repair in 2 groups a. Experimental group; b. Control group
2.3.2 組織形態觀察 兩組中段再生神經組織橫切面 Meyer 神經三色染色示髓鞘呈紅色，軸突呈藍綠色，神經纖維間均可見少量增生結締組織；縱切面抗 NF 與 S-100 雙重免疫熒光染色示髓鞘呈紅色熒光，軸突呈綠色熒光。兩組再生神經組織均生長良好，有髓神經纖維分布均勻，實驗組與對照組比較無明顯差異。見圖 5、6。
圖5
兩組修復術后 3 個月再生神經中段橫切面 Meyer 神經三色染色觀察 a. 實驗組（×160）；b. 實驗組（×640）；c. 對照組（×160）；d. 對照組（×640）
Figure5.
Meyer’s trichrome staining observation on transversely sectioned mid-portion of the regenerated segment at 3 months after repair in 2 groups a. Experimental group (×160); b. Experimental group (×640); c. Control group (×160); d. Control group (×640)
圖6
兩組修復術后 3 個月再生神經中段縱切面抗 NF 與 S-100 雙重免疫熒光染色（倒置熒光顯微鏡×160） 從左至右依次為 NF 染色、S-100 染色及合圖 a. 實驗組；b. 對照組
Figure6.
Immunofluorescence double staining for NF and S-100 on the longitudinal sectioned mid-portion of the regenerated segment at 3 months after repair in 2 groups (Fluorescence microscope×160) From left to right was NF staining, S-100 staining, and merge a. Experimental group; b. Control group
透射電鏡觀察：實驗組與對照組均可見再生神經纖維成簇分布，再生有髓神經纖維的髓鞘結構均致密而均勻，板層結構清晰。見圖 7。定量分析顯示，實驗組軸突直徑、髓鞘厚度、有髓神經纖維密度及 G 比值均略高于對照組，但差異無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
圖7
兩組修復術后 3 個月神經組織透射電鏡觀察 a. 實驗組（×6 000）；b. 實驗組（×50 k）；c. 對照組（×6 000）
Figure7.
Transmission electron microscope observation of distal sciatic nerve at 3 months after repair in 2 groups a. Experimental group (×6 000); b. Experimental group (×50 k); c. Control group (×6 000)
表1
兩組再生神經形態學指標比較（
n=3，
）
Table1.
Comparison of the morphology index of regenerative nerve between 2 groups (
n=3,
)
2.4 腓腸肌形態學觀測
2.4.1 大體觀察 修復術后隨時間延長，兩組大鼠術側腓腸肌均有不同程度萎縮。術后 3 個月取材時發現，實驗組術側靶肌肉萎縮明顯，其程度與對照組類似，肌肉色澤紅潤，質地較柔軟。
2.4.2 腓腸肌相對濕重比檢測 實驗組術側腓腸肌相對濕重比為 0.275%±0.021%，高于對照組的 0.223%±0.021%，比較差異有統計學意義（t=4.633，P=0.000）。
2.4.3 腓腸肌組織形態觀察 術側腓腸肌冰凍切片行 Karnovsky-Root 運動終板膽堿酯酶組織學染色示，兩組均可見運動終板，呈圓形或橢圓形，深棕色，其中實驗組運動終板形態和數量略優于對照組。見圖 8。
圖8
兩組修復術后 3 個月術側腓腸肌 Karnovsky-Root 運動終板膽堿酯酶組織學染色 a. 實驗組（×160）；b. 實驗組（×640）；c. 對照組（×160）；d. 對照組（×640）
Figure8.
Karnovsky-Root cholinesterase staining observation of the motor endplate on transverse sections of gastrocnemius muscle at the operated side at 3 months after repair in 2 groups a. Experimental group (×160); b. Experimental group (×640); c. Control group (×160); d. Control group (×640)
3 討論
3.1 SLES 對近端神經元的影響
有關電刺激對神經再生的影響研究已較多，早期研究表明電刺激能促進軸突芽生和某些早期功能的恢復[11-12]。近年有研究表明 SLES 可通過喚醒更多神經元啟動再生，提高再生率[13]；激活神經元胞體上的電壓依從性鈣通道，進一步激活胞內腺苷酸環化酶/cAMP-依賴性蛋白激酶系統[14-15]，促進損傷神經胞體早期表達系列內源性神經營養因子，如 BDNF、trkB 及 GAP-43 等，早期啟動神經再生，并助其通過損傷點進入遠端相應功能支，從而縮短神經再生時間[6,16-17]。本研究在修復術后 1、2、7 d 分別取材觀察缺損神經對應運動、感覺神經元中 BDNF、GAP-43 的表達情況，結果與前述報道基本相符。但由于大多數研究都是使用的急性損傷模型[4-6,14-15,18-19]，相應神經元對 SLES 的響應較為迅速且上調水平較高。如 Al-Majed 等[16-17]研究發現，術后 1 h 運動神經元中即開始出現 BDNF、trkB mRNA 表達上調，2 d 時達到峰值，7 d 時二者均下降。本研究采用的是神經缺損達 1 個月的陳舊性周圍神經缺損模型，故損傷神經元對 SLES 的響應速度和相關因子的上調水平低于急性損傷模型。
3.2 SLES 對陳舊性缺損神經再生過程的促進作用
導致周圍神經缺損后再生難度大的原因較多，諸如：近端神經元再生率低；軸突再生速度慢，再生距離長；遠端再生微環境逐漸退變，難以維持漫長的再生時間等[7]。對陳舊性神經缺損，遠端靶器官等待時間則更長。因此，能縮短上述過程的因素均有利于陳舊性神經缺損的再生。本研究逆行示蹤實驗顯示實驗組脊髓中運動神經元明顯多于對照組，透射電鏡觀察顯示實驗組神經發育亦優于對照組，Karnovsky-Root 運動終板膽堿酯酶組織學染色示實驗組運動終板發育相對較好，運動終板數量和形態都優于對照組。以上研究結果提示，SLES 在早期啟動了神經再生的進程，縮短了整體再生時間，使實驗組再生神經發育相對成熟，最終表現出實驗組術側腓腸肌相對濕重比優于對照組。另外，本研究制備的陳舊性周圍神經缺損模型為無自發再生可能的長距離神經缺損（大鼠神經缺損>12 mm 被認為是長距離神經缺損[20-21]），結合本研究結果表明，對短期（1 個月）長距離陳舊性周圍神經缺損，SLES 在一定程度上起到促進神經再生作用。
3.3 進一步優化電刺激方式
SLES 是 Al-Majed 等[22]在研究如何加快急性周圍神經損傷再生過程中的運動神經優先選擇期，以便提高再支配準確性時提出的。他們比較了 1 h、1 d、1～2 周的低頻電刺激對上述過程的作用，發現短期（1 h、1 d）與長期（1、2 周）電刺激在促經神經再生、加快運動神經優先選擇期方面表現出類似效果，并且這種短期電刺激對神經再生的作用可被鈉通道阻滯劑河豚毒素阻斷，因此他們認為其主要是通過影響損傷神經對應的近端神經元發揮作用，而短期電刺激更適合臨床應用。而對于陳舊性周圍神經缺損，有研究發現神經干切斷后 1 個月，近端脊髓前角中神經元丟失最多，減至對照側的 60%，但之后數量無明顯變化，一直至 12 個月[23-24]。陳舊性周圍神經缺損所導致的近端神經元減少，以及失神經損傷的神經元所出現的胞體先腫脹后萎縮等變化，均導致了本研究中觀察到的陳舊性周圍神經缺損對應神經元對 SLES 的響應速度和相關因子的上調水平不如急性損傷模型的結果，從而影響了近端神經元再生率。因此，對于陳舊性周圍神經缺損，有必要進一步優化電刺激的方式，比如術中直接刺激與術后體外刺激相結合，刺激近端神經元與激活遠端再生微環境、保護靶器官相結合，使電刺激更好地發揮促進陳舊性周圍神經再生的作用。
綜上述，SLES 對短期（1 個月）長距離陳舊性周圍神經缺損的神經再生起到一定促進作用。但由于陳舊性周圍神經近端神經元和遠端微環境的改變，影響了 SLES 的促神經再生作用，有必要進一步優化電刺激方式，更好地發揮促進陳舊性周圍神經再生的作用。
