引用本文： 馬潞, 田猛. 可注射明膠原位水凝膠作為脫鈣骨基質粉末輸送載體可行性的初步研究. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(3): 300-305. doi: 10.7507/1002-1892.201611113 復制
自上個世紀 60 年代 Urist[1]發現脫鈣骨基質（demineralized bone matrix，DBM）具有骨誘導性后，DBM 在骨修復和骨再生領域得到廣泛應用[2-5]。粉末狀 DBM 由于與植入位點細胞的作用表面最大，被認為具有最佳骨誘導性[6-8]。然而，DBM 粉末用于臨床時存在操作困難以及術后 DBM 不穩定、不固定，容易從植入位點遷移等問題[9-11]。為了解決以上問題，學者們研發了各種載體材料用于輸送 DBM 粉末[12-14]。理想載體材料除需要具有適宜物理性能外，還應具有良好生物相容性，持續、可控釋放活性物質功能，并且不能抑制 DBM 的骨誘導性[15]。但目前研發的載體材料尚不能滿足這些要求。可注射原位水凝膠作為生物活性材料以及細胞輸送載體具有明顯優勢，可以直接注射植入，然后凝膠成型后固定，具有廣闊臨床應用前景。本研究制備了一種可注射明膠原位水凝膠，并從體外細胞誘導和體內骨誘導兩方面，研究其作為 DBM 粉末輸送載體的可行性。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6～8 周齡雄性裸鼠 6 只，體質量 120～140 g，購自美國國立癌癥研究所。C2C12 細胞購自 ATCC 細胞庫。DBM 粉末購自美國 Lifelink 組織庫。明膠、胱胺二鹽酸鹽、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 [1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC]、二硫蘇糖醇、聚乙二醇雙丙烯酸酯 [poly（ethylene oxide） diacrylate，PEGDA]、MTT、對-硝基苯磷酸二鈉 [p-nitrophenyl phosphate，pNPP]（Sigma 公司，美國）；live/dead 試劑盒（Biotium 公司，美國）；Alamarblue 試劑盒（Invitrogen 公司，美國）。激光共聚焦顯微鏡（Perkin Elmer 公司，美國）；Sigma Photo Pro 軟件（Sigma 公司，美國）。
1.2 巰基化明膠制備
取 1 g 明膠加入 100 mL 超純水中，加熱至 40℃攪拌溶解后冷卻至室溫。加入胱胺二鹽酸鹽和 EDC，調節反應溶液 pH 值至 4.75；室溫下反應 4 h 后用蒸餾水透析，每 24 小時更換 1 次透析液，透析 3 d 后加入 0.5 g 二硫蘇糖醇，調節反應液 pH 值至 8.5，室溫下反應 2 h 后調節 pH 值至 4.0；氮氣保護下用蒸餾水透析 3 d。透析完成后過濾除菌、冷凍干燥，得到巰基化明膠。采用 Ellman 法[16]測定其巰基含量。
1.3 可注射明膠原位水凝膠制備
首先，取巰基化明膠及 PEGDA，使用 PBS 分別配制成 3wt% 巰基化明膠和 1wt% PEGDA 溶液。然后，按照 PEGDA 中雙鍵摩爾數與巰基化明膠中巰基摩爾數之比為 0.5 的標準，混合巰基化明膠與 PEGDA 溶液，得到可注射明膠原位水凝膠[17]。采用倒置法測定凝膠時間[17]，即兩種溶液混合后至成為凝膠狀為止。實驗重復 6 次。
1.4 DBM-可注射明膠原位水凝膠復合物（以下簡稱DBM-Gel）的制備
參照 1.3 方法取巰基化明膠與 PEGDA 溶液混勻后，取該混合溶液與 DBM 粉末按照體積比 2∶1 比例混合均勻[18]，置于 37℃、5% CO2 孵箱 10 min 成型，獲得 DBM-Gel。
1.5 觀測指標
1.5.1 細胞毒性觀察 參照 1.3 方法取巰基化明膠與 PEGDA 溶液混勻后，接種 1×105 個 C2C12 細胞，然后按 1.4 方法與 DBM 粉末混合均勻后，置于 37℃、5% CO2 孵箱 10 min，獲得包裹 C2C12 細胞的 DBM-Gel。采用含 10% FBS 的 DMEM 培養基，于 37℃、5% CO2 孵箱中培養。① 細胞成活觀察：培養 1、3、7 d，各取 4 個樣本，參照 live/dead 試劑盒說明書染色后，激光共聚焦顯微鏡下觀察，死細胞呈紅色染色，活細胞呈綠色染色。于 200 倍鏡下每個樣本取 10 個視野，計數活、死細胞，并按照公式計算細胞成活率，公式為：活細胞數/（活細胞數+死細胞數）×100%，取均值。
② 細胞增殖觀察：培養 1、3、5、7 d，各取 4 個樣本，加入含 10% Alamar blue 的培養基，繼續培養 4 h 后，參照 Alamar blue 試劑盒說明書檢測細胞增殖，以與 1 d 時細胞增殖率的比值表示各時間點細胞相對增殖率[18]。
1.5.2 體外細胞誘導觀察 取 DBM 加入 24 孔板，每孔 40 mg，經 DMEM 潤濕 2 h 后每孔接種 2×105 個 C2C12 細胞。使用含 10% FBS 的 DMEM 培養基，于 37℃、5% CO2 孵箱中培養 24 h 后，將 DBM 轉移至 48 孔板，采用 MTT 法測量黏附于 DBM 表面的細胞數量[18]。
實驗分為兩組，DBM-Gel 組：按照 1.4 DBM-Gel 制備方法，取上一步驟培養 24 h 的 DBM 以及巰基化明膠、PEGDA 溶液混合液，制備含細胞的 DBM-Gel；DBM 組：上一步驟中培養 24 h 的 DBM。兩組均使用含 5% FBS 的 DMEM 培養基，于 37℃、5% CO2 孵箱中培養，每 3 天更換 1 次培養液。培養 1、3、5、7 d 后，各時間點取 3 個樣本采用 pNPP 法檢測 ALP 活性[19]。
1.5.3 體內骨誘導性觀察 實驗分為兩組，DBM-Gel 組：按照 1.4 DBM-Gel 制備方法，采用 33 mg DBM 粉末與 50 μL 巰基化明膠、PEGDA 溶液混合液制備 DBM-Gel；DBM 組：取 33 mg DBM 粉末與 50 μL PBS 均勻混合。參考文獻[19]方法制備肌肉異位骨誘導模型。取 6 只裸鼠，每只裸鼠腹部肌肉分為左、右兩側，每側制備 2 個肌袋。采用 1 mL 注射針筒將兩組材料分別植入左、右側肌袋。4 周后 CO2 吸入處死動物，連同周圍組織取出植入材料，均分為兩份。其中 1 份采用 pNPP 法測定 ALP 活性。另 1 份置于多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片，片厚 5 μm，HE 染色，于 20 倍鏡下觀察。每個標本取 1 張具有代表性的切片，取 10 個視野進行骨誘導性組織學評分[18-19]，首先采用 Sigma Photo Pro 軟件測量新骨生成面積，并在此基礎上進行評分；5 分，新骨生成面積≥40% 并含有骨髓；4 分，新骨生成面積達 20%；3 分，新骨生成面積為 10%；2 分，只有軟骨；1 分，只有纖維組織。
1.6 統計學方法
采用 SPSS12.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用t 檢驗；組內各時間點間比較采用方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 DBM-Gel 制備觀察
Ellman 法檢測制備的巰基化明膠其巰基含量為（0.51±0.03）mmol/g。實驗成功制備可注射明膠原位水凝膠，其凝膠時間為（6±1）min。將 DBM 與巰基化明膠、PEGDA 溶液混合后，在凝膠時間內可以通過注射方式到達植入位點。見圖 1。
圖1
DBM-Gel 觀察 a. 可注射明膠原位水凝膠溶液；b. DBM； c. DBM-Gel； d. DBM-Gel 可通過注射方式植入位點
Figure1.
DBM-Gel observation a. The injectable andin situ gelling gelatin hydrogel solution; b. DBM; c. DBM-Gel; d. Implantation of DBM-Gel into the site by injection
2.2 細胞毒性觀察
live/dead 染色觀察示，細胞在 DBM-Gel 中培養 1 d 后即呈鋪展形態，隨著培養時間延長，鋪展細胞逐漸增多，并且部分細胞之間有連接。見圖 2。培養 1、3、7 d 細胞成活率分別為 95.4%±1.9%、97.3%±1.3%、96.1%±1.6%。Alamar blue 檢測示，隨培養時間延長，細胞在 DBM-Gel 內增殖明顯，培養 1、3、5、7 d 細胞相對增殖率分別為 1.0±0.0、1.1±0.1、1.5±0.1、1.6±0.1。
圖2
C2C12 細胞在 DBM-Gel 中培養后 live/dead 染色觀察（激光共聚焦顯微鏡×200） a. 培養 1 d； b. 培養 3 d； c. 培養 7 d
Figure2.
Live/dead staining of C2C12 cells in DBM-Gel (Laser scanning confocal microscope×200) a. At 1 day after culture; b. At 3 days after culture; c. At 7 days after culture
2.3 體外細胞誘導觀察
MTT 檢測示培養 24 h 后有 1.02×105 個 C2C12 細胞黏附于 DBM 表面。pNPP 法檢測示，培養 1、3、5、7 d DBM-Gel 組和 DBM 組細胞表現相似的 ALP 活性，組間比較差異均無統計學意義（t=–1.702，P=0.164；t=–0.259，P=0.808；t=–1.204，P=0.295；t=–0.375，P=0.727）。隨培養時間延長，兩組 ALP 活性均逐漸增加，5、7 d 時 ALP 活性顯著高于 1、3 d，比較差異有統計學意義（P<0.05）；1、3 d 間比較以及 5、7 d 間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 3。
圖3
兩組培養各時間點 ALP 活性檢測
Figure3.
ALP activities of 2 groups at various time points after culture
2.4 體內骨誘導性觀察
體內植入 4 周后，DBM 組可見骨髓、骨、軟骨形成；DBM-Gel 組可見骨、軟骨形成，未觀察到骨髓形成（圖 4）。DBM-Gel 組、DBM 組骨誘導性組織學評分分別為 4.0、4.5 分；ALP 活性分別為（119.4±22.7）、（146.7±13.0）μmol/mg protein/min，組間比較差異無統計學意義（t=–2.085，P=0.082）。
圖4
體內植入 4 周后兩組標本HE染色觀察（×400） G：可注射明膠原位水凝膠； BM：骨髓； NB：新生骨； CL：軟骨 a、b. DBM 組； c、d. DBM-Gel 組
Figure4.
The HE staining of the specimen in 2 groups at 4 weeks after implantation (×400) G: Injectable andin situ gelling gelatin hydrogel; BM: Bone marrow; NB: New bone; CL: Cartilage a, b. DBM group; c, d. DBM-Gel group
3 討論
目前，DBM 粉末雖已用于臨床骨修復和骨再生，但因存在操作困難、容易從植入位點遷移等問題，限制了在臨床的進一步使用。針對這些問題，本研究首先制備了一種可注射的明膠原位水凝膠，該水凝膠由巰基化明膠與 PEGDA 通過化學交聯反應獲得。作為 DBM 輸送載體材料，首先要滿足能在臨床手術時間窗口內進行操作。本研究制備的可注射明膠原位水凝膠其凝膠時間為（6±1）min，滿足骨材料植入手術中 15 min 內的操作時間窗口。此外，將 DBM 粉末與巰基化明膠、PEGDA 溶液混合液混合后，即形成可塑型的 DBM-Gel，該復合物通過簡單壓入或者注射即可到達植入位點，待達到凝膠時間后固定于植入部位。
此外，載體材料還應具有良好生物相容性，并且不能抑制 DBM 骨誘導性[15]。本研究將細胞包裹在可注射明膠原位水凝膠中進行培養，以研究其細胞毒性。結果表明，培養后細胞成活率達 95% 以上，并且隨培養時間延長細胞增殖明顯，提示該水凝膠不影響細胞成活及增殖。對于骨誘導性的檢測，本研究分別從體外和體內兩方面來驗證。體外采用經典成肌細胞 C2C12 細胞，誘導培養其表達 ALP 活性。pNPP 法檢測示，培養 1、3、5、7 d DBM-Gel 組和 DBM 組細胞表現相似的 ALP 活性，且差異無統計學意義。然后，采用裸鼠肌肉異位骨誘導模型進一步研究 DBM-Gel 體內骨誘導性。結果表明，DBM-Gel 仍具有骨誘導能力，但與 DBM 對照組相比，其骨誘導性延遲。DBM 的骨誘導性與其含有的 BMP 釋放至周圍組織有關，當使用載體輸送 DBM 時，由于 DBM 被載體包裹，阻止了其與周圍組織的直接接觸和 BMP 釋放，所以載體材料通常對 DBM 骨誘導有一定延遲作用。這種現象在其他輸送系統中也存在，如本課題組前期研究的一種溫敏性殼聚糖水凝膠，發現經過該水凝膠輸送后，DBM 復合物骨誘導性受到延遲[19]；Barbieri 等[20]研究表明載體包裹磷酸鈣后延遲了組織的長入和血管化，減慢了 MSCs 的遷入。
綜上述，本研究制備的可注射明膠原位水凝膠作為 DBM 粉末輸送載體可行，可有效改善 DBM 粉末操作性；體外、體內研究證明該水凝膠無細胞毒性，能保持 DBM 粉末骨誘導性。
· 信 息 · 第十屆中國骨科醫師年會通知 由中國醫師協會、中國醫師協會骨科醫師分會主辦，中國醫師協會骨科醫師分會、廣東省醫師協會承辦，廣東省人民醫院、中山大學附屬第三醫院、暨南大學第一附屬醫院協辦的“第十屆骨科醫師大會”將于 2017 年 5 月 11 日—14 日（周四、五、六、日）在廣州長隆國際會展中心舉行。 現將會議事項通知如下： 1 大會時間：2017 年 5 月 11 日—14 日，大會地點：中國廣州長隆國際會展中心。 2 學分：國家級Ⅰ類 8 分，領取時間：2017 年 5 月 13 日 10∶00—20∶00、2017 年 5 月 14 日 9∶00—11∶00。 3 注冊程序：請登錄中國醫師協會骨科醫師分會網 www.caos-china.org，點擊進入年會頁面，填寫注冊信息、繳費，打印參會確認函。注冊截止日期：2017 年 4 月 7 日。 大會秘書處聯系方式：電話：010-59007165，郵箱：conference@caos-china.org，網址：www.caos-china.org。 掃描二維碼進入 CAOS2017 微官網查看更多精彩內容！
自上個世紀 60 年代 Urist[1]發現脫鈣骨基質（demineralized bone matrix，DBM）具有骨誘導性后，DBM 在骨修復和骨再生領域得到廣泛應用[2-5]。粉末狀 DBM 由于與植入位點細胞的作用表面最大，被認為具有最佳骨誘導性[6-8]。然而，DBM 粉末用于臨床時存在操作困難以及術后 DBM 不穩定、不固定，容易從植入位點遷移等問題[9-11]。為了解決以上問題，學者們研發了各種載體材料用于輸送 DBM 粉末[12-14]。理想載體材料除需要具有適宜物理性能外，還應具有良好生物相容性，持續、可控釋放活性物質功能，并且不能抑制 DBM 的骨誘導性[15]。但目前研發的載體材料尚不能滿足這些要求。可注射原位水凝膠作為生物活性材料以及細胞輸送載體具有明顯優勢，可以直接注射植入，然后凝膠成型后固定，具有廣闊臨床應用前景。本研究制備了一種可注射明膠原位水凝膠，并從體外細胞誘導和體內骨誘導兩方面，研究其作為 DBM 粉末輸送載體的可行性。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6～8 周齡雄性裸鼠 6 只，體質量 120～140 g，購自美國國立癌癥研究所。C2C12 細胞購自 ATCC 細胞庫。DBM 粉末購自美國 Lifelink 組織庫。明膠、胱胺二鹽酸鹽、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 [1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC]、二硫蘇糖醇、聚乙二醇雙丙烯酸酯 [poly（ethylene oxide） diacrylate，PEGDA]、MTT、對-硝基苯磷酸二鈉 [p-nitrophenyl phosphate，pNPP]（Sigma 公司，美國）；live/dead 試劑盒（Biotium 公司，美國）；Alamarblue 試劑盒（Invitrogen 公司，美國）。激光共聚焦顯微鏡（Perkin Elmer 公司，美國）；Sigma Photo Pro 軟件（Sigma 公司，美國）。
1.2 巰基化明膠制備
取 1 g 明膠加入 100 mL 超純水中，加熱至 40℃攪拌溶解后冷卻至室溫。加入胱胺二鹽酸鹽和 EDC，調節反應溶液 pH 值至 4.75；室溫下反應 4 h 后用蒸餾水透析，每 24 小時更換 1 次透析液，透析 3 d 后加入 0.5 g 二硫蘇糖醇，調節反應液 pH 值至 8.5，室溫下反應 2 h 后調節 pH 值至 4.0；氮氣保護下用蒸餾水透析 3 d。透析完成后過濾除菌、冷凍干燥，得到巰基化明膠。采用 Ellman 法[16]測定其巰基含量。
1.3 可注射明膠原位水凝膠制備
首先，取巰基化明膠及 PEGDA，使用 PBS 分別配制成 3wt% 巰基化明膠和 1wt% PEGDA 溶液。然后，按照 PEGDA 中雙鍵摩爾數與巰基化明膠中巰基摩爾數之比為 0.5 的標準，混合巰基化明膠與 PEGDA 溶液，得到可注射明膠原位水凝膠[17]。采用倒置法測定凝膠時間[17]，即兩種溶液混合后至成為凝膠狀為止。實驗重復 6 次。
1.4 DBM-可注射明膠原位水凝膠復合物（以下簡稱DBM-Gel）的制備
參照 1.3 方法取巰基化明膠與 PEGDA 溶液混勻后，取該混合溶液與 DBM 粉末按照體積比 2∶1 比例混合均勻[18]，置于 37℃、5% CO2 孵箱 10 min 成型，獲得 DBM-Gel。
1.5 觀測指標
1.5.1 細胞毒性觀察 參照 1.3 方法取巰基化明膠與 PEGDA 溶液混勻后，接種 1×105 個 C2C12 細胞，然后按 1.4 方法與 DBM 粉末混合均勻后，置于 37℃、5% CO2 孵箱 10 min，獲得包裹 C2C12 細胞的 DBM-Gel。采用含 10% FBS 的 DMEM 培養基，于 37℃、5% CO2 孵箱中培養。① 細胞成活觀察：培養 1、3、7 d，各取 4 個樣本，參照 live/dead 試劑盒說明書染色后，激光共聚焦顯微鏡下觀察，死細胞呈紅色染色，活細胞呈綠色染色。于 200 倍鏡下每個樣本取 10 個視野，計數活、死細胞，并按照公式計算細胞成活率，公式為：活細胞數/（活細胞數+死細胞數）×100%，取均值。
② 細胞增殖觀察：培養 1、3、5、7 d，各取 4 個樣本，加入含 10% Alamar blue 的培養基，繼續培養 4 h 后，參照 Alamar blue 試劑盒說明書檢測細胞增殖，以與 1 d 時細胞增殖率的比值表示各時間點細胞相對增殖率[18]。
1.5.2 體外細胞誘導觀察 取 DBM 加入 24 孔板，每孔 40 mg，經 DMEM 潤濕 2 h 后每孔接種 2×105 個 C2C12 細胞。使用含 10% FBS 的 DMEM 培養基，于 37℃、5% CO2 孵箱中培養 24 h 后，將 DBM 轉移至 48 孔板，采用 MTT 法測量黏附于 DBM 表面的細胞數量[18]。
實驗分為兩組，DBM-Gel 組：按照 1.4 DBM-Gel 制備方法，取上一步驟培養 24 h 的 DBM 以及巰基化明膠、PEGDA 溶液混合液，制備含細胞的 DBM-Gel；DBM 組：上一步驟中培養 24 h 的 DBM。兩組均使用含 5% FBS 的 DMEM 培養基，于 37℃、5% CO2 孵箱中培養，每 3 天更換 1 次培養液。培養 1、3、5、7 d 后，各時間點取 3 個樣本采用 pNPP 法檢測 ALP 活性[19]。
1.5.3 體內骨誘導性觀察 實驗分為兩組，DBM-Gel 組：按照 1.4 DBM-Gel 制備方法，采用 33 mg DBM 粉末與 50 μL 巰基化明膠、PEGDA 溶液混合液制備 DBM-Gel；DBM 組：取 33 mg DBM 粉末與 50 μL PBS 均勻混合。參考文獻[19]方法制備肌肉異位骨誘導模型。取 6 只裸鼠，每只裸鼠腹部肌肉分為左、右兩側，每側制備 2 個肌袋。采用 1 mL 注射針筒將兩組材料分別植入左、右側肌袋。4 周后 CO2 吸入處死動物，連同周圍組織取出植入材料，均分為兩份。其中 1 份采用 pNPP 法測定 ALP 活性。另 1 份置于多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片，片厚 5 μm，HE 染色，于 20 倍鏡下觀察。每個標本取 1 張具有代表性的切片，取 10 個視野進行骨誘導性組織學評分[18-19]，首先采用 Sigma Photo Pro 軟件測量新骨生成面積，并在此基礎上進行評分；5 分，新骨生成面積≥40% 并含有骨髓；4 分，新骨生成面積達 20%；3 分，新骨生成面積為 10%；2 分，只有軟骨；1 分，只有纖維組織。
1.6 統計學方法
采用 SPSS12.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用t 檢驗；組內各時間點間比較采用方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 DBM-Gel 制備觀察
Ellman 法檢測制備的巰基化明膠其巰基含量為（0.51±0.03）mmol/g。實驗成功制備可注射明膠原位水凝膠，其凝膠時間為（6±1）min。將 DBM 與巰基化明膠、PEGDA 溶液混合后，在凝膠時間內可以通過注射方式到達植入位點。見圖 1。
圖1
DBM-Gel 觀察 a. 可注射明膠原位水凝膠溶液；b. DBM； c. DBM-Gel； d. DBM-Gel 可通過注射方式植入位點
Figure1.
DBM-Gel observation a. The injectable andin situ gelling gelatin hydrogel solution; b. DBM; c. DBM-Gel; d. Implantation of DBM-Gel into the site by injection
2.2 細胞毒性觀察
live/dead 染色觀察示，細胞在 DBM-Gel 中培養 1 d 后即呈鋪展形態，隨著培養時間延長，鋪展細胞逐漸增多，并且部分細胞之間有連接。見圖 2。培養 1、3、7 d 細胞成活率分別為 95.4%±1.9%、97.3%±1.3%、96.1%±1.6%。Alamar blue 檢測示，隨培養時間延長，細胞在 DBM-Gel 內增殖明顯，培養 1、3、5、7 d 細胞相對增殖率分別為 1.0±0.0、1.1±0.1、1.5±0.1、1.6±0.1。
圖2
C2C12 細胞在 DBM-Gel 中培養后 live/dead 染色觀察（激光共聚焦顯微鏡×200） a. 培養 1 d； b. 培養 3 d； c. 培養 7 d
Figure2.
Live/dead staining of C2C12 cells in DBM-Gel (Laser scanning confocal microscope×200) a. At 1 day after culture; b. At 3 days after culture; c. At 7 days after culture
2.3 體外細胞誘導觀察
MTT 檢測示培養 24 h 后有 1.02×105 個 C2C12 細胞黏附于 DBM 表面。pNPP 法檢測示，培養 1、3、5、7 d DBM-Gel 組和 DBM 組細胞表現相似的 ALP 活性，組間比較差異均無統計學意義（t=–1.702，P=0.164；t=–0.259，P=0.808；t=–1.204，P=0.295；t=–0.375，P=0.727）。隨培養時間延長，兩組 ALP 活性均逐漸增加，5、7 d 時 ALP 活性顯著高于 1、3 d，比較差異有統計學意義（P<0.05）；1、3 d 間比較以及 5、7 d 間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 3。
圖3
兩組培養各時間點 ALP 活性檢測
Figure3.
ALP activities of 2 groups at various time points after culture
2.4 體內骨誘導性觀察
體內植入 4 周后，DBM 組可見骨髓、骨、軟骨形成；DBM-Gel 組可見骨、軟骨形成，未觀察到骨髓形成（圖 4）。DBM-Gel 組、DBM 組骨誘導性組織學評分分別為 4.0、4.5 分；ALP 活性分別為（119.4±22.7）、（146.7±13.0）μmol/mg protein/min，組間比較差異無統計學意義（t=–2.085，P=0.082）。
圖4
體內植入 4 周后兩組標本HE染色觀察（×400） G：可注射明膠原位水凝膠； BM：骨髓； NB：新生骨； CL：軟骨 a、b. DBM 組； c、d. DBM-Gel 組
Figure4.
The HE staining of the specimen in 2 groups at 4 weeks after implantation (×400) G: Injectable andin situ gelling gelatin hydrogel; BM: Bone marrow; NB: New bone; CL: Cartilage a, b. DBM group; c, d. DBM-Gel group
3 討論
目前，DBM 粉末雖已用于臨床骨修復和骨再生，但因存在操作困難、容易從植入位點遷移等問題，限制了在臨床的進一步使用。針對這些問題，本研究首先制備了一種可注射的明膠原位水凝膠，該水凝膠由巰基化明膠與 PEGDA 通過化學交聯反應獲得。作為 DBM 輸送載體材料，首先要滿足能在臨床手術時間窗口內進行操作。本研究制備的可注射明膠原位水凝膠其凝膠時間為（6±1）min，滿足骨材料植入手術中 15 min 內的操作時間窗口。此外，將 DBM 粉末與巰基化明膠、PEGDA 溶液混合液混合后，即形成可塑型的 DBM-Gel，該復合物通過簡單壓入或者注射即可到達植入位點，待達到凝膠時間后固定于植入部位。
此外，載體材料還應具有良好生物相容性，并且不能抑制 DBM 骨誘導性[15]。本研究將細胞包裹在可注射明膠原位水凝膠中進行培養，以研究其細胞毒性。結果表明，培養后細胞成活率達 95% 以上，并且隨培養時間延長細胞增殖明顯，提示該水凝膠不影響細胞成活及增殖。對于骨誘導性的檢測，本研究分別從體外和體內兩方面來驗證。體外采用經典成肌細胞 C2C12 細胞，誘導培養其表達 ALP 活性。pNPP 法檢測示，培養 1、3、5、7 d DBM-Gel 組和 DBM 組細胞表現相似的 ALP 活性，且差異無統計學意義。然后，采用裸鼠肌肉異位骨誘導模型進一步研究 DBM-Gel 體內骨誘導性。結果表明，DBM-Gel 仍具有骨誘導能力，但與 DBM 對照組相比，其骨誘導性延遲。DBM 的骨誘導性與其含有的 BMP 釋放至周圍組織有關，當使用載體輸送 DBM 時，由于 DBM 被載體包裹，阻止了其與周圍組織的直接接觸和 BMP 釋放，所以載體材料通常對 DBM 骨誘導有一定延遲作用。這種現象在其他輸送系統中也存在，如本課題組前期研究的一種溫敏性殼聚糖水凝膠，發現經過該水凝膠輸送后，DBM 復合物骨誘導性受到延遲[19]；Barbieri 等[20]研究表明載體包裹磷酸鈣后延遲了組織的長入和血管化，減慢了 MSCs 的遷入。
綜上述，本研究制備的可注射明膠原位水凝膠作為 DBM 粉末輸送載體可行，可有效改善 DBM 粉末操作性；體外、體內研究證明該水凝膠無細胞毒性，能保持 DBM 粉末骨誘導性。
· 信 息 · 第十屆中國骨科醫師年會通知 由中國醫師協會、中國醫師協會骨科醫師分會主辦，中國醫師協會骨科醫師分會、廣東省醫師協會承辦，廣東省人民醫院、中山大學附屬第三醫院、暨南大學第一附屬醫院協辦的“第十屆骨科醫師大會”將于 2017 年 5 月 11 日—14 日（周四、五、六、日）在廣州長隆國際會展中心舉行。 現將會議事項通知如下： 1 大會時間：2017 年 5 月 11 日—14 日，大會地點：中國廣州長隆國際會展中心。 2 學分：國家級Ⅰ類 8 分，領取時間：2017 年 5 月 13 日 10∶00—20∶00、2017 年 5 月 14 日 9∶00—11∶00。 3 注冊程序：請登錄中國醫師協會骨科醫師分會網 www.caos-china.org，點擊進入年會頁面，填寫注冊信息、繳費，打印參會確認函。注冊截止日期：2017 年 4 月 7 日。 大會秘書處聯系方式：電話：010-59007165，郵箱：conference@caos-china.org，網址：www.caos-china.org。 掃描二維碼進入 CAOS2017 微官網查看更多精彩內容！
