引用本文： 袁寧, 劉運德, 李雪, 張連祥, 侯敏, 李銀霞, 李朝陽. 慶大霉素和 O-羧甲基殼聚糖對硫酸鈣骨水泥改性研究. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(3): 306-312. doi: 10.7507/1002-1892.201604048 復制
可注射型骨修復材料可以在缺損部位任意塑形，原位自固化為具有多孔微結構的支架材料并發揮骨傳導作用，具有操作簡便、創傷小的優點，可廣泛應用于骨缺損的填充、修復，具有廣闊應用前景[1]。硫酸鈣骨水泥（calcium sulfate cement，CSC）作為骨修復材料已有 100 多年歷史[2]。臨床應用證實 CSC 安全且具有良好生物相容性[3]。但是單純 CSC 不僅注射性能不理想，還存在降解速率過快，與骨組織生成速率不匹配，容易形成“骨真空區”，造成其力學性能過快衰減，另外還存在骨誘導性差等問題，限制了 CSC 進一步臨床應用。
研究表明，多種無機鹽、有機物等可以作為改性劑，對硫酸鈣形貌和行為進行調控[4-5]。O-羧甲基殼聚糖（oxygen-carboxymethylated chitosan，O-CMC）是殼聚糖經羧甲基化后的產物，具有無毒、無味以及良好成膜性、水溶性、增稠性等優點，而且生物相容性和生物降解性良好。從理論上來說，O-CMC 是一種理想的 CSC 改性材料。
單純 CSC 作為骨替代材料，存在易感染的缺陷。慶大霉素是一種廣譜抗菌藥，與 CSC 直接均勻混合后，隨著硫酸鈣降解其會逐漸釋放[6]；采用該混合物修復骨缺損可有效防治感染性并發癥[7]。研究表明，將藥物負載在聚合物中再與硫酸鈣復合所制得的復合材料，具有更好的藥物釋放動力學曲線[8]。為此，我們首先在 CSC 液相中添加不同濃度 O-CMC，制備 O-CMC/硫酸鈣復合骨水泥（O-CMC/CSC），分析 O-CMC 濃度對 CSC 可注射性、降解行為、成骨活性及抗壓強度方面的影響，并在此基礎上選擇性能較佳的 O-CMC/CSC 加入慶大霉素，探究其抗壓強度和抗菌性。報告如下。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
小鼠成纖維細胞 L929 細胞、革蘭陰性大腸桿菌、革蘭陽性金黃色葡萄球菌（中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫）。半水硫酸鈣（Acros Organics 公司，美國）；O-CMC（南京森貝伽生物科技有限公司）；慶大霉素（煙臺只楚藥業有限公司）。
電子天平 [梅特勒-托利多（常州）精密儀器有限公司]；恒溫恒濕振蕩器[納諾斯克（天津）科技有限公司]；WDW-20 微控電子萬能試驗機（長春科新試驗儀器有限公司）；S-4800 掃描電鏡（Hitachi 公司，日本）、D8 ADVANCE X 射線衍射儀（X-ray diffraction，XRD；Bruker 公司，德國）；CO2 恒溫培養箱（Shellab 公司，美國）；等離子體原子發射光譜儀（Varian 公司，美國）；酶聯免疫檢測儀（Biotek 公司，美國）。
1.2 O-CMC/CSC 制備方法及觀測
1.2.1 CSC 制備 將半水硫酸鈣粉末與去離子水按照 0.5 g/mL 的固液比均勻混合，攪拌約 2 min。將混合均勻后的漿體轉移至聚四氟乙烯模具中，頂端抹平，置于 37℃、100% 相對濕度環境中進行固化。待 CSC 試樣完全固化后，取出待用。
1.2.2 O-CMC/CSC 制備 分別按照 0.1wt%、0.3wt%、0.5wt%、0.7wt%、1.0wt% 質量比將 O-CMC 加入去離子水中，攪拌約 10 min 使其完全溶解，制備不同濃度的 O-CMC 水溶液。按照 1.2.1 方法將半水硫酸鈣粉末與不同濃度的 O-CMC 水溶液混合制樣。
1.2.3 觀測指標 ① 可注射性測試：將半水硫酸鈣粉末分別與質量比為 0.1wt%、0.3wt%、0.5wt%、0.7wt%、1.0wt%O-CMC 水溶液混合，混合約 2 min 后，將調勻的漿體移至 5 mL 注射器內，每隔 1 min 注射 1 次，直至材料無法順利注射，記錄可注射時間（min），即開始混合至無法順利注射的時間。實驗重復 6 次。以 CSC 作為對照。
② 抗壓強度測試：參照文獻[9]方法測試材料抗壓強度。將 0.1wt%、0.3wt%、0.5wt%、0.7wt%、1.0wt%O-CMC/CSC 制成直徑 6 mm、高 12 mm 試樣，置于 37℃、100% 相對濕度環境下固化，分別于 1、3、7、14、28 d 取出試樣（n=6），用萬能試驗機以 1 mm/min 速度測試其抗壓強度。
③ 降解率測試：通過模擬體液（simulated body fluid，SBF）[10]浸泡實驗測試材料降解行為。取 0.5wt%、1.0wt%O-CMC/CSC 制成直徑 6 mm、高 10 mm 試樣，兩端磨平，稱重，記為浸泡前質量。然后將試樣浸泡于含 5 mL SBF 溶液的離心管中，置于 37℃、100% 相對濕度環境。于浸泡 1、2、3、4、5、6 周時取出試樣（n=6），用去離子水洗滌，自然干燥 24 h 后，再次稱重，記為浸泡后質量。實驗過程中，每 2 天更換 1 次 SBF 溶液。按照以下公式計算降解率，降解率=（浸泡前質量—浸泡后質量）/浸泡前質量×100%。以 CSC 作為對照。
④ SBF 溶液 pH 值以及 Ca2+ 濃度測試：降解率測試樣品浸泡過程中，于 0、1、2、4、8、12、24、48 h 取離心管中 SBF 溶液（n=3），測量其 pH 值。于 1、3、5、7、14 d 取離心管中 SBF 溶液（n=3），采用等離子體原子發射光譜儀測量其 Ca2+ 濃度。
⑤ 成分與形貌表征觀察：取 0.3 wt%、0.5wt%、0.7wt%O-CMC/CSC，置于 SBF 溶液中浸泡，于浸泡后 1、14、35 d 取 0.5wt%O-CMC/CSC，取斷面經表面干燥處理后，采用 XRD 進行成分分析。浸泡 2、5 周取 0.3wt%、0.5wt%、0.7wt% O-CMC/CSC，取斷面經真空鍍膜儀表面噴金處理后，采用掃描電鏡觀察表面形貌；以 CSC 作為對照。
⑥ 細胞毒性測試：采用 L929 細胞，按照 MTT 法檢測 CSC 及 0.1wt%、0.3wt%、0.5wt%、0.7wt%、1.0wt%O-CMC/CSC 細胞毒性[7]。于培養 1、3 d 測量吸光度（A）值，每個試樣設 5 個復孔。以培養基作為空白對照，將空白對照 1 d 時A 值作為細胞成活率 100%，計算 5 種 O-CMC/CSC 細胞相對成活率。
綜合以上檢測指標，確定最佳性能 O-CMC/CSC，并以此復合慶大霉素，進行后續實驗。
1.3 載慶大霉素的 O-CMC/CSC 制備及觀測
1.3.1 載慶大霉素的 O-CMC/CSC 制備 按照 0.5wt%、1.5wt%、2.5wt% 質量比將慶大霉素加入最佳性能 O-CMC/CSC 對應濃度的 O-CMC 水溶液中，攪拌約 10 min，使其完全溶解，然后將半水硫酸鈣粉與溶液按照上述 1.2.2 方法混合制樣。
1.3.2 觀測指標 ① 抗壓強度測試：將制備的 3 種載慶大霉素的 O-CMC/CSC 制備成直徑 6 mm、高 12 mm 試樣，置于 37℃、100% 相對濕度環境下固化 24 h（n=6），然后用萬能試驗機以 1 mm/min 速度測試其抗壓強度。以未載慶大霉素的最佳性能 O-CMC/CSC 作為對照。
② 慶大霉素釋放量測試：將制備的 3 種載慶大霉素的 O-CMC/CSC 制備成直徑 6 mm、高 10 mm 試樣，兩端磨平，置于含 5 mL PBS 溶液的離心管中浸泡，離心管置于 37℃、100% 相對濕度搖床，以 60 r/min 頻率進行振蕩。于浸泡后 1、3、6、9、12、24 h 以及 2 、3、4、5、6、7 d 取浸泡液（n=6），測量其慶大霉素含量。以未載慶大霉素的最佳性能 O-CMC/CSC 作為對照。
③ 抑菌性測試：采用革蘭陰性大腸桿菌和革蘭陽性金黃色葡萄球菌作為模型細菌。首先制備鋪有細菌的 LB 瓊脂板，控制菌液濃度為 1×106 CFU/mL，每個瓊脂板上涂抹 100 μL 菌液，然后將制備的 3 種載慶大霉素的 O-CMC/CSC（直徑 12 mm、高 2 mm）置于鋪有細菌的 LB 瓊脂板上，37℃ 培養箱中孵育 24 h，測量各試樣抑菌區域。以未載慶大霉素的最佳性能 O-CMC/CSC 作為對照。
1.4 統計學方法
采用 SPSS11.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 O-CMC/CSC制備
2.1.1 可注射性測試 CSC 可注射時間為（3.5±0.2）min，各濃度 O-CMC/CSC 可注射時間均超過 5 min，并且隨 O-CMC 濃度增加而顯著延長，比較差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 1a。
圖1
O-CMC/CSC制備觀察 a. 可注射時間； b. 抗壓強度； c. 降解率； d. SBF 溶液 pH 值； e. SBF 溶液 Ca2+ 濃度； f. 浸泡 2 周時形貌表征觀察（掃描電鏡×10 k） 從左至右分別為 CSC 及 0.3wt%、0.5wt%、0.7wt% O-CMC/CSC； g. 浸泡 5 周時形貌表征觀察（掃描電鏡×10 k） 從左至右分別為 CSC 及 0.3wt%、0.5wt%、0.7wt% O-CMC/CSC； h. XRD 分析材料成分； i. 細胞毒性測試
Figure1.
Physical and chemical properties of O-CMC/CSC a. The injection time; b. The compressive strength; c. The degradation rate; d. The pH value in simulated body fluid; e. The Ca2+ concentrations in simulated body fluid; f. Scanning electron microscope micrographs of different samples after immersing for 2 weeks (×10 k) From left to right for the samples of CSC, 0.3wt%O-CMC/CSC, 0.5wt%O-CMC/CSC, and 0.7wt%O-CMC/CSC, respectively; g. Scanning electron microscope micrographs of different samples after immersing for 5 weeks (×10 k) From left to right for the samples of CSC, 0.3wt%O-CMC/CSC, 0.5wt%O-CMC/CSC, and 0.7wt% O-CMC/CSC, respectively; h. X-ray diffraction patterns to identify the phases of different samples; i. The cytotoxicity of different samples
2.1.2 抗壓強度測試 各濃度 O-CMC/CSC 抗壓強度介于 11～18 MPa 之間，隨 O-CMC 濃度增加，O-CMC/CSC 抗壓強度呈先增加后降低趨勢，其中 0.5wt%O-CMC/CSC 抗壓強度最高，比較差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 1b。
2.1.3 降解率測試 各時間點，CSC 降解率均高于各濃度 O-CMC/CSC，0.5wt%O-CMC/CSC 降解率高于 1.0wt%O-CMC/CSC，但差異均無統計學意義（P>0.05）。隨時間延長，各濃度 O-CMC/CSC 降解率均逐漸增高，但組內各時間點間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 1c。
2.1.4 SBF 溶液 pH 值以及 Ca2+ 濃度測試 各濃度 O-CMC/CSC 浸泡 4 h 內 SBF 溶液 pH 值呈下降趨勢，4～24 h pH 值逐漸上升，但上升速率隨時間增加而減慢，但各時間點 pH 值比較差異無統計學意義（P>0.05）。浸泡 30 h 以內各濃度 O-CMC/CSC 浸泡液 pH 值低于 CSC，但隨時間延長，各濃度復合骨水泥及 CSC 浸泡液 pH 值趨于一致。見圖 1d。
隨時間延長，CSC 及 0.5wt%、1.0wt%O-CMC/CSC 在 SBF 中 Ca2+ 濃度增加速率均減緩。同一時間點，隨著 O-CMC 濃度增加，Ca2+ 濃度降低，但差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 1e。
2.1.5 成分與形貌表征觀察 ① 掃描電鏡觀察：浸泡 2 周，CSC 可見片狀二水硫酸鈣晶粒，表面無新物質形成；0.3wt%O-CMC/CSC 不僅有片狀二水硫酸鈣晶體，還有部分顆粒狀二水硫酸鈣分布在片層狀結構之間；0.5wt%、0.7wt%O-CMC/CSC，其二水硫酸鈣片狀晶粒表面和它們之間的小顆粒狀晶體出現了類似網狀多孔結構。根據 XRD 圖譜分析，在骨水泥試樣表面形成的是羥基磷灰石。見圖 1f。
浸泡 5 周，CSC 片狀二水硫酸鈣晶粒邊緣產生少量多孔粒狀物質；0.3wt%O-CMC/CSC 其片狀二水硫酸鈣晶粒大部分成為更小的不規則晶粒，表面有大量多孔物質形成；0.5wt%、0.7wt%O-CMC/CSC 未見片狀二水硫酸鈣晶體，可見大量整齊的片層狀物質垂直骨水泥表面。見圖 1g。
② XRD 分析：浸泡 1 d 時，0.5wt% O-CMC/CSC 主要顯示為二水硫酸鈣波峰；14 d 后二水硫酸鈣波峰變弱；35 d 時，二水硫酸鈣完全轉變為鈣磷鹽，骨水泥表面無二水硫酸鈣，而是明顯的新物質波峰。見圖 1h。
2.1.6 細胞毒性測試 培養 1 d 時，CSC 及不同濃度 O-CMC/CSC 細胞成活率約為 100%，3 d 時為 145%～165%。同一時間點，不同濃度 O-CMC/CSC 比較差異無統計學意義（P>0.05）。見 1i。
綜合以上檢測指標結果，確定采用以 0.5wt% O-CMC/CSC 進行后續實驗。
2.2 載慶大霉素的 O-CMC/CSC 觀測
2.2.1 抗壓強度測試 隨慶大霉素含量增加，載慶大霉素的 O-CMC/CSC 抗壓強度逐漸降低，且均低于 O-CMC/CSC，但組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 2a。
圖2
載慶大霉素的 O-CMC/CSC 觀測 a. 抗壓強度； b. 慶大霉素釋放量； c. 大腸桿菌抑菌性測試 從左至右分別為載 0、0.5wt%、1.5wt%、2.5wt% 慶大霉素的 O-CMC/CSC； d. 金黃色葡萄球菌抑菌性測試 從左至右分別為載 0、0.5wt%、1.5wt%、2.5wt% 慶大霉素的 O-CMC/CSC
Figure2.
Physical and antibacterial properties of O-CMC/CSC with gentamicin a. The compressive strength; b. The release profile of gentamicin; c. The antibacterial activity of O-CMC/CSC againstEscherichia Coli From left to right for 0, 0.5wt%, 1.5wt%, and 2.5wt% gentamicin, respectively; d. The antibacterial activity of O-CMC/CSC againstStaphylococcus Aureus From left to right for 0, 0.5wt%, 1.5wt%, and 2.5wt% gentamicin, respectively
2.2.2 慶大霉素釋放量測試 同一時間點，載慶大霉素的 O-CMC/CSC 其慶大霉素釋放量隨含量增加而顯著增加，比較差異有統計學意義（P<0.05）。各載慶大霉素的 O-CMC/CSC 均于 1 d 內釋放速率最快，約占總釋放量的 80%，之后釋放速率變慢，釋放量趨于平緩。見圖 2b。
2.2.3 抑菌性測試 大腸桿菌抑菌性測試顯示，不含慶大霉素的 O-CMC/CSC 無抑菌圈，載 1.5wt% 慶大霉素的 O-CMC/CSC 抑菌圈直徑為（20.0±3.2）mm，較載 0.5wt%、2.5wt% 慶大霉素的 O-CMC/CSC（17.0±1.8）、（16.0±1.5）mm 擴大，但組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
金黃色葡萄球菌抑菌性測試結果與大腸桿菌抑菌性測試，不含慶大霉素的 O-CMC/CSC 無抑菌圈，載 1.5wt% 慶大霉素的 O-CMC/CSC 抑菌圈直徑為（37.0±5.5）mm，較載 0.5wt%、2.5wt% 慶大霉素的 O-CMC/CSC（32.0±4.8）、（34.0±5.0）mm 擴大，但組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 2c、d。
3 討論
材料的可注射性是指無論注射壓力大小，其被注射時所含相能保持均勻狀態（各種相不發生分離）的能力。目前，對于材料可注射性的表征缺少統一標準。骨修復材料的可注射性評價指標主要包括注射率、注射力、注射壓力和可注射時間等，注射率越大或者注射力、注射壓力越小，可注射時間越長，說明骨水泥可注射性越好。本實驗主要測試了樣品的可注射時間。結果顯示，加入 O-CMC 后 CSC 可注射時間延長，主要原因可能是 O-CMC 長鏈上含有較多的 -COOH 和 -OH，在半水硫酸鈣水化過程中產生大量 Ca2+，-COOH 和 -OH 與 Ca2+ 發生螯合作用，使得溶液中的 Ca2+ 變少，從而半水硫酸鈣向二水硫酸鈣轉化過程變慢，即延長了 CSC 的固化時間，使漿體可塑時間變長。-COOH 和 -OH 的含量越多，螯合的 Ca2+ 越多，因此 CSC 的可注射時間隨 O-CMC 的濃度增加而增加。由此可見，通過控制液相中 O-CMC 的濃度可以控制 O-CMC/CSC 的可注射時間，為 CSC 的臨床應用提供了更多可能。
在臨床治療使用中，骨修復材料需要在骨缺損部位提供一定力學支撐，足夠的力學強度是成骨前期的保證。為了達到一定力學強度，二水硫酸鈣晶粒和 O-CMC 必須達到一種力學穩態，即一個二水硫酸鈣晶粒周圍必須完全被 O-CMC 包裹。本實驗結果顯示，二水硫酸鈣晶粒和 O-CMC 有達到這種穩態的趨勢，其中含 0.5wt%O-CMC 的復合骨水泥達到最大力學強度，抗壓強度最大。但隨著 O-CMC 的繼續添加，O-CMC 會破壞二水硫酸鈣晶粒原有的自固化結構，二水硫酸鈣晶粒之間的自固化鏈接被破壞，復合骨水泥變得疏松，孔隙率增加，力學強度下降。松質骨抗壓強度在 5～10 MPa之間[11-12]。本實驗各濃度 O-CMC/CSC 抗壓強度介于 11～18 MPa 之間，能滿足骨缺損部位臨床使用要求。
O-CMC/CSC 在降解過程中會產生鈣磷鹽類物質，且隨著 O-CMC 濃度的增加，鈣磷鹽類物質產生越多。根據 XRD 圖譜分析，在骨水泥試樣表面形成的是羥基磷灰石。羥基磷灰石具有良好的骨傳導性，并能產生骨性結合，結合掃描電鏡觀察結果，與對照組 CSC 相比，添加 O-CMC 有助于提高 CSC 的生物活性。
骨修復材料降解性能是評價植入材料的另一個重要指標，材料本身的理化性質決定了其降解性能。CSC 的缺點是降解過快，無法與新骨生成速率相匹配。CSC 在 SBF 溶液中降解過快，可能是因為其含有較多的微孔結構，孔隙率較大，結構疏松，容易降解。O-CMC 作為一種高分子材料，降解速率明顯低于 CSC，而且適量的 O-CMC 可以填補 CSC 中的孔隙，使 O-CMC/CSC 孔隙率降低，孔徑變小，降解速率降低。
有研究認為，CSC 在降解過程中會產生局部酸度，雖然酸度過高會引起無菌炎癥，但移植部位適度的酸性環境被認為有助于骨骼重建，酸性環境能夠使局部骨組織部位脫礦，促進生長因子如 BMP 等的生成，從而促使 BMSCs 分化成為成骨細胞，有助于新骨形成[13]。本實驗結果顯示，雖然浸泡 48 h 內 O-CMC/CSC 浸泡液的 pH 值有所下降，但仍在安全范圍內，且有利于成骨。
雖然 Ca2+ 可能改變骨吸收/骨重建的平衡，刺激成骨細胞分化，抑制破骨細胞吸收[14]，有利于新骨形成，但高鈣環境容易引起炎性反應，如瞬態高鈣血癥等，而稍高濃度的 Ca2+ 環境（6～8 mmol/L）有利于成骨類細胞分化。O-CMC/CSC 在降解過程中會產生鈣磷鹽類物質，但 Ca2+ 濃度最終穩定在 6～8 mmol/L，且釋放曲線更平穩，提示添加 O-CMC 改善了 CSC 骨再生的 Ca2+ 微環境和生物活性。
在細胞相容性方面，我們將空白對照 1 d 時的A 值作為 100%，根據各組樣品細胞相對成活率來判斷樣品的細胞活性。A 值間接反映細胞數量，一定細胞數量范圍內結晶物形成的量與細胞數成正比，A 值越高可以認為細胞生長越好[15]。O-CMC/CSC 與 CSC 的測試結果之間沒有顯著性差異，提示均可以促進細胞增殖，具有良好細胞活性。
慶大霉素在硫酸鈣基體中主要以 2 種形態存在，分別為以物理吸附在硫酸鈣表面和內部微孔孔壁，以及與硫酸鈣基體或凝膠產生化學螯合。釋放初期主要是物理吸附的慶大霉素擴散釋放，而在釋放后期則主要是與硫酸鈣基體或凝膠產生化學螯合的慶大霉素的溶解釋放，這部分的慶大霉素釋放相對較困難，所以緩釋初期慶大霉素的釋放速度明顯大于釋放后期的釋放速度[16]。載 0.5wt% 慶大霉素的樣品釋放量較少，釋放出的藥物濃度太低，難以達到抗菌、消炎的治療效果；而載藥量達 1.5wt% 的樣品中，慶大霉素釋放不完全，只釋放了總載藥量的 66.7% 左右。載藥量為 2.5wt% 的樣品其釋放量達到了 72%，既能保證治療所需要的藥物濃度，又能使藥物達到高效釋放，效果較佳。樣品對于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌測試均表明，含慶大霉素 1.5wt% 時的抑菌效果較好，且樣品對金黃色葡萄球菌的抑菌性比對大腸桿菌好。
綜上所述，CSC 經 O-CMC 和慶大霉素改性后，提高了其在骨修復領域應用的可行性，但要應用于臨床還有待更深入、系統地研究。
可注射型骨修復材料可以在缺損部位任意塑形，原位自固化為具有多孔微結構的支架材料并發揮骨傳導作用，具有操作簡便、創傷小的優點，可廣泛應用于骨缺損的填充、修復，具有廣闊應用前景[1]。硫酸鈣骨水泥（calcium sulfate cement，CSC）作為骨修復材料已有 100 多年歷史[2]。臨床應用證實 CSC 安全且具有良好生物相容性[3]。但是單純 CSC 不僅注射性能不理想，還存在降解速率過快，與骨組織生成速率不匹配，容易形成“骨真空區”，造成其力學性能過快衰減，另外還存在骨誘導性差等問題，限制了 CSC 進一步臨床應用。
研究表明，多種無機鹽、有機物等可以作為改性劑，對硫酸鈣形貌和行為進行調控[4-5]。O-羧甲基殼聚糖（oxygen-carboxymethylated chitosan，O-CMC）是殼聚糖經羧甲基化后的產物，具有無毒、無味以及良好成膜性、水溶性、增稠性等優點，而且生物相容性和生物降解性良好。從理論上來說，O-CMC 是一種理想的 CSC 改性材料。
單純 CSC 作為骨替代材料，存在易感染的缺陷。慶大霉素是一種廣譜抗菌藥，與 CSC 直接均勻混合后，隨著硫酸鈣降解其會逐漸釋放[6]；采用該混合物修復骨缺損可有效防治感染性并發癥[7]。研究表明，將藥物負載在聚合物中再與硫酸鈣復合所制得的復合材料，具有更好的藥物釋放動力學曲線[8]。為此，我們首先在 CSC 液相中添加不同濃度 O-CMC，制備 O-CMC/硫酸鈣復合骨水泥（O-CMC/CSC），分析 O-CMC 濃度對 CSC 可注射性、降解行為、成骨活性及抗壓強度方面的影響，并在此基礎上選擇性能較佳的 O-CMC/CSC 加入慶大霉素，探究其抗壓強度和抗菌性。報告如下。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
小鼠成纖維細胞 L929 細胞、革蘭陰性大腸桿菌、革蘭陽性金黃色葡萄球菌（中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫）。半水硫酸鈣（Acros Organics 公司，美國）；O-CMC（南京森貝伽生物科技有限公司）；慶大霉素（煙臺只楚藥業有限公司）。
電子天平 [梅特勒-托利多（常州）精密儀器有限公司]；恒溫恒濕振蕩器[納諾斯克（天津）科技有限公司]；WDW-20 微控電子萬能試驗機（長春科新試驗儀器有限公司）；S-4800 掃描電鏡（Hitachi 公司，日本）、D8 ADVANCE X 射線衍射儀（X-ray diffraction，XRD；Bruker 公司，德國）；CO2 恒溫培養箱（Shellab 公司，美國）；等離子體原子發射光譜儀（Varian 公司，美國）；酶聯免疫檢測儀（Biotek 公司，美國）。
1.2 O-CMC/CSC 制備方法及觀測
1.2.1 CSC 制備 將半水硫酸鈣粉末與去離子水按照 0.5 g/mL 的固液比均勻混合，攪拌約 2 min。將混合均勻后的漿體轉移至聚四氟乙烯模具中，頂端抹平，置于 37℃、100% 相對濕度環境中進行固化。待 CSC 試樣完全固化后，取出待用。
1.2.2 O-CMC/CSC 制備 分別按照 0.1wt%、0.3wt%、0.5wt%、0.7wt%、1.0wt% 質量比將 O-CMC 加入去離子水中，攪拌約 10 min 使其完全溶解，制備不同濃度的 O-CMC 水溶液。按照 1.2.1 方法將半水硫酸鈣粉末與不同濃度的 O-CMC 水溶液混合制樣。
1.2.3 觀測指標 ① 可注射性測試：將半水硫酸鈣粉末分別與質量比為 0.1wt%、0.3wt%、0.5wt%、0.7wt%、1.0wt%O-CMC 水溶液混合，混合約 2 min 后，將調勻的漿體移至 5 mL 注射器內，每隔 1 min 注射 1 次，直至材料無法順利注射，記錄可注射時間（min），即開始混合至無法順利注射的時間。實驗重復 6 次。以 CSC 作為對照。
② 抗壓強度測試：參照文獻[9]方法測試材料抗壓強度。將 0.1wt%、0.3wt%、0.5wt%、0.7wt%、1.0wt%O-CMC/CSC 制成直徑 6 mm、高 12 mm 試樣，置于 37℃、100% 相對濕度環境下固化，分別于 1、3、7、14、28 d 取出試樣（n=6），用萬能試驗機以 1 mm/min 速度測試其抗壓強度。
③ 降解率測試：通過模擬體液（simulated body fluid，SBF）[10]浸泡實驗測試材料降解行為。取 0.5wt%、1.0wt%O-CMC/CSC 制成直徑 6 mm、高 10 mm 試樣，兩端磨平，稱重，記為浸泡前質量。然后將試樣浸泡于含 5 mL SBF 溶液的離心管中，置于 37℃、100% 相對濕度環境。于浸泡 1、2、3、4、5、6 周時取出試樣（n=6），用去離子水洗滌，自然干燥 24 h 后，再次稱重，記為浸泡后質量。實驗過程中，每 2 天更換 1 次 SBF 溶液。按照以下公式計算降解率，降解率=（浸泡前質量—浸泡后質量）/浸泡前質量×100%。以 CSC 作為對照。
④ SBF 溶液 pH 值以及 Ca2+ 濃度測試：降解率測試樣品浸泡過程中，于 0、1、2、4、8、12、24、48 h 取離心管中 SBF 溶液（n=3），測量其 pH 值。于 1、3、5、7、14 d 取離心管中 SBF 溶液（n=3），采用等離子體原子發射光譜儀測量其 Ca2+ 濃度。
⑤ 成分與形貌表征觀察：取 0.3 wt%、0.5wt%、0.7wt%O-CMC/CSC，置于 SBF 溶液中浸泡，于浸泡后 1、14、35 d 取 0.5wt%O-CMC/CSC，取斷面經表面干燥處理后，采用 XRD 進行成分分析。浸泡 2、5 周取 0.3wt%、0.5wt%、0.7wt% O-CMC/CSC，取斷面經真空鍍膜儀表面噴金處理后，采用掃描電鏡觀察表面形貌；以 CSC 作為對照。
⑥ 細胞毒性測試：采用 L929 細胞，按照 MTT 法檢測 CSC 及 0.1wt%、0.3wt%、0.5wt%、0.7wt%、1.0wt%O-CMC/CSC 細胞毒性[7]。于培養 1、3 d 測量吸光度（A）值，每個試樣設 5 個復孔。以培養基作為空白對照，將空白對照 1 d 時A 值作為細胞成活率 100%，計算 5 種 O-CMC/CSC 細胞相對成活率。
綜合以上檢測指標，確定最佳性能 O-CMC/CSC，并以此復合慶大霉素，進行后續實驗。
1.3 載慶大霉素的 O-CMC/CSC 制備及觀測
1.3.1 載慶大霉素的 O-CMC/CSC 制備 按照 0.5wt%、1.5wt%、2.5wt% 質量比將慶大霉素加入最佳性能 O-CMC/CSC 對應濃度的 O-CMC 水溶液中，攪拌約 10 min，使其完全溶解，然后將半水硫酸鈣粉與溶液按照上述 1.2.2 方法混合制樣。
1.3.2 觀測指標 ① 抗壓強度測試：將制備的 3 種載慶大霉素的 O-CMC/CSC 制備成直徑 6 mm、高 12 mm 試樣，置于 37℃、100% 相對濕度環境下固化 24 h（n=6），然后用萬能試驗機以 1 mm/min 速度測試其抗壓強度。以未載慶大霉素的最佳性能 O-CMC/CSC 作為對照。
② 慶大霉素釋放量測試：將制備的 3 種載慶大霉素的 O-CMC/CSC 制備成直徑 6 mm、高 10 mm 試樣，兩端磨平，置于含 5 mL PBS 溶液的離心管中浸泡，離心管置于 37℃、100% 相對濕度搖床，以 60 r/min 頻率進行振蕩。于浸泡后 1、3、6、9、12、24 h 以及 2 、3、4、5、6、7 d 取浸泡液（n=6），測量其慶大霉素含量。以未載慶大霉素的最佳性能 O-CMC/CSC 作為對照。
③ 抑菌性測試：采用革蘭陰性大腸桿菌和革蘭陽性金黃色葡萄球菌作為模型細菌。首先制備鋪有細菌的 LB 瓊脂板，控制菌液濃度為 1×106 CFU/mL，每個瓊脂板上涂抹 100 μL 菌液，然后將制備的 3 種載慶大霉素的 O-CMC/CSC（直徑 12 mm、高 2 mm）置于鋪有細菌的 LB 瓊脂板上，37℃ 培養箱中孵育 24 h，測量各試樣抑菌區域。以未載慶大霉素的最佳性能 O-CMC/CSC 作為對照。
1.4 統計學方法
采用 SPSS11.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 O-CMC/CSC制備
2.1.1 可注射性測試 CSC 可注射時間為（3.5±0.2）min，各濃度 O-CMC/CSC 可注射時間均超過 5 min，并且隨 O-CMC 濃度增加而顯著延長，比較差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 1a。
圖1
O-CMC/CSC制備觀察 a. 可注射時間； b. 抗壓強度； c. 降解率； d. SBF 溶液 pH 值； e. SBF 溶液 Ca2+ 濃度； f. 浸泡 2 周時形貌表征觀察（掃描電鏡×10 k） 從左至右分別為 CSC 及 0.3wt%、0.5wt%、0.7wt% O-CMC/CSC； g. 浸泡 5 周時形貌表征觀察（掃描電鏡×10 k） 從左至右分別為 CSC 及 0.3wt%、0.5wt%、0.7wt% O-CMC/CSC； h. XRD 分析材料成分； i. 細胞毒性測試
Figure1.
Physical and chemical properties of O-CMC/CSC a. The injection time; b. The compressive strength; c. The degradation rate; d. The pH value in simulated body fluid; e. The Ca2+ concentrations in simulated body fluid; f. Scanning electron microscope micrographs of different samples after immersing for 2 weeks (×10 k) From left to right for the samples of CSC, 0.3wt%O-CMC/CSC, 0.5wt%O-CMC/CSC, and 0.7wt%O-CMC/CSC, respectively; g. Scanning electron microscope micrographs of different samples after immersing for 5 weeks (×10 k) From left to right for the samples of CSC, 0.3wt%O-CMC/CSC, 0.5wt%O-CMC/CSC, and 0.7wt% O-CMC/CSC, respectively; h. X-ray diffraction patterns to identify the phases of different samples; i. The cytotoxicity of different samples
2.1.2 抗壓強度測試 各濃度 O-CMC/CSC 抗壓強度介于 11～18 MPa 之間，隨 O-CMC 濃度增加，O-CMC/CSC 抗壓強度呈先增加后降低趨勢，其中 0.5wt%O-CMC/CSC 抗壓強度最高，比較差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 1b。
2.1.3 降解率測試 各時間點，CSC 降解率均高于各濃度 O-CMC/CSC，0.5wt%O-CMC/CSC 降解率高于 1.0wt%O-CMC/CSC，但差異均無統計學意義（P>0.05）。隨時間延長，各濃度 O-CMC/CSC 降解率均逐漸增高，但組內各時間點間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 1c。
2.1.4 SBF 溶液 pH 值以及 Ca2+ 濃度測試 各濃度 O-CMC/CSC 浸泡 4 h 內 SBF 溶液 pH 值呈下降趨勢，4～24 h pH 值逐漸上升，但上升速率隨時間增加而減慢，但各時間點 pH 值比較差異無統計學意義（P>0.05）。浸泡 30 h 以內各濃度 O-CMC/CSC 浸泡液 pH 值低于 CSC，但隨時間延長，各濃度復合骨水泥及 CSC 浸泡液 pH 值趨于一致。見圖 1d。
隨時間延長，CSC 及 0.5wt%、1.0wt%O-CMC/CSC 在 SBF 中 Ca2+ 濃度增加速率均減緩。同一時間點，隨著 O-CMC 濃度增加，Ca2+ 濃度降低，但差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 1e。
2.1.5 成分與形貌表征觀察 ① 掃描電鏡觀察：浸泡 2 周，CSC 可見片狀二水硫酸鈣晶粒，表面無新物質形成；0.3wt%O-CMC/CSC 不僅有片狀二水硫酸鈣晶體，還有部分顆粒狀二水硫酸鈣分布在片層狀結構之間；0.5wt%、0.7wt%O-CMC/CSC，其二水硫酸鈣片狀晶粒表面和它們之間的小顆粒狀晶體出現了類似網狀多孔結構。根據 XRD 圖譜分析，在骨水泥試樣表面形成的是羥基磷灰石。見圖 1f。
浸泡 5 周，CSC 片狀二水硫酸鈣晶粒邊緣產生少量多孔粒狀物質；0.3wt%O-CMC/CSC 其片狀二水硫酸鈣晶粒大部分成為更小的不規則晶粒，表面有大量多孔物質形成；0.5wt%、0.7wt%O-CMC/CSC 未見片狀二水硫酸鈣晶體，可見大量整齊的片層狀物質垂直骨水泥表面。見圖 1g。
② XRD 分析：浸泡 1 d 時，0.5wt% O-CMC/CSC 主要顯示為二水硫酸鈣波峰；14 d 后二水硫酸鈣波峰變弱；35 d 時，二水硫酸鈣完全轉變為鈣磷鹽，骨水泥表面無二水硫酸鈣，而是明顯的新物質波峰。見圖 1h。
2.1.6 細胞毒性測試 培養 1 d 時，CSC 及不同濃度 O-CMC/CSC 細胞成活率約為 100%，3 d 時為 145%～165%。同一時間點，不同濃度 O-CMC/CSC 比較差異無統計學意義（P>0.05）。見 1i。
綜合以上檢測指標結果，確定采用以 0.5wt% O-CMC/CSC 進行后續實驗。
2.2 載慶大霉素的 O-CMC/CSC 觀測
2.2.1 抗壓強度測試 隨慶大霉素含量增加，載慶大霉素的 O-CMC/CSC 抗壓強度逐漸降低，且均低于 O-CMC/CSC，但組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 2a。
圖2
載慶大霉素的 O-CMC/CSC 觀測 a. 抗壓強度； b. 慶大霉素釋放量； c. 大腸桿菌抑菌性測試 從左至右分別為載 0、0.5wt%、1.5wt%、2.5wt% 慶大霉素的 O-CMC/CSC； d. 金黃色葡萄球菌抑菌性測試 從左至右分別為載 0、0.5wt%、1.5wt%、2.5wt% 慶大霉素的 O-CMC/CSC
Figure2.
Physical and antibacterial properties of O-CMC/CSC with gentamicin a. The compressive strength; b. The release profile of gentamicin; c. The antibacterial activity of O-CMC/CSC againstEscherichia Coli From left to right for 0, 0.5wt%, 1.5wt%, and 2.5wt% gentamicin, respectively; d. The antibacterial activity of O-CMC/CSC againstStaphylococcus Aureus From left to right for 0, 0.5wt%, 1.5wt%, and 2.5wt% gentamicin, respectively
2.2.2 慶大霉素釋放量測試 同一時間點，載慶大霉素的 O-CMC/CSC 其慶大霉素釋放量隨含量增加而顯著增加，比較差異有統計學意義（P<0.05）。各載慶大霉素的 O-CMC/CSC 均于 1 d 內釋放速率最快，約占總釋放量的 80%，之后釋放速率變慢，釋放量趨于平緩。見圖 2b。
2.2.3 抑菌性測試 大腸桿菌抑菌性測試顯示，不含慶大霉素的 O-CMC/CSC 無抑菌圈，載 1.5wt% 慶大霉素的 O-CMC/CSC 抑菌圈直徑為（20.0±3.2）mm，較載 0.5wt%、2.5wt% 慶大霉素的 O-CMC/CSC（17.0±1.8）、（16.0±1.5）mm 擴大，但組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
金黃色葡萄球菌抑菌性測試結果與大腸桿菌抑菌性測試，不含慶大霉素的 O-CMC/CSC 無抑菌圈，載 1.5wt% 慶大霉素的 O-CMC/CSC 抑菌圈直徑為（37.0±5.5）mm，較載 0.5wt%、2.5wt% 慶大霉素的 O-CMC/CSC（32.0±4.8）、（34.0±5.0）mm 擴大，但組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 2c、d。
3 討論
材料的可注射性是指無論注射壓力大小，其被注射時所含相能保持均勻狀態（各種相不發生分離）的能力。目前，對于材料可注射性的表征缺少統一標準。骨修復材料的可注射性評價指標主要包括注射率、注射力、注射壓力和可注射時間等，注射率越大或者注射力、注射壓力越小，可注射時間越長，說明骨水泥可注射性越好。本實驗主要測試了樣品的可注射時間。結果顯示，加入 O-CMC 后 CSC 可注射時間延長，主要原因可能是 O-CMC 長鏈上含有較多的 -COOH 和 -OH，在半水硫酸鈣水化過程中產生大量 Ca2+，-COOH 和 -OH 與 Ca2+ 發生螯合作用，使得溶液中的 Ca2+ 變少，從而半水硫酸鈣向二水硫酸鈣轉化過程變慢，即延長了 CSC 的固化時間，使漿體可塑時間變長。-COOH 和 -OH 的含量越多，螯合的 Ca2+ 越多，因此 CSC 的可注射時間隨 O-CMC 的濃度增加而增加。由此可見，通過控制液相中 O-CMC 的濃度可以控制 O-CMC/CSC 的可注射時間，為 CSC 的臨床應用提供了更多可能。
在臨床治療使用中，骨修復材料需要在骨缺損部位提供一定力學支撐，足夠的力學強度是成骨前期的保證。為了達到一定力學強度，二水硫酸鈣晶粒和 O-CMC 必須達到一種力學穩態，即一個二水硫酸鈣晶粒周圍必須完全被 O-CMC 包裹。本實驗結果顯示，二水硫酸鈣晶粒和 O-CMC 有達到這種穩態的趨勢，其中含 0.5wt%O-CMC 的復合骨水泥達到最大力學強度，抗壓強度最大。但隨著 O-CMC 的繼續添加，O-CMC 會破壞二水硫酸鈣晶粒原有的自固化結構，二水硫酸鈣晶粒之間的自固化鏈接被破壞，復合骨水泥變得疏松，孔隙率增加，力學強度下降。松質骨抗壓強度在 5～10 MPa之間[11-12]。本實驗各濃度 O-CMC/CSC 抗壓強度介于 11～18 MPa 之間，能滿足骨缺損部位臨床使用要求。
O-CMC/CSC 在降解過程中會產生鈣磷鹽類物質，且隨著 O-CMC 濃度的增加，鈣磷鹽類物質產生越多。根據 XRD 圖譜分析，在骨水泥試樣表面形成的是羥基磷灰石。羥基磷灰石具有良好的骨傳導性，并能產生骨性結合，結合掃描電鏡觀察結果，與對照組 CSC 相比，添加 O-CMC 有助于提高 CSC 的生物活性。
骨修復材料降解性能是評價植入材料的另一個重要指標，材料本身的理化性質決定了其降解性能。CSC 的缺點是降解過快，無法與新骨生成速率相匹配。CSC 在 SBF 溶液中降解過快，可能是因為其含有較多的微孔結構，孔隙率較大，結構疏松，容易降解。O-CMC 作為一種高分子材料，降解速率明顯低于 CSC，而且適量的 O-CMC 可以填補 CSC 中的孔隙，使 O-CMC/CSC 孔隙率降低，孔徑變小，降解速率降低。
有研究認為，CSC 在降解過程中會產生局部酸度，雖然酸度過高會引起無菌炎癥，但移植部位適度的酸性環境被認為有助于骨骼重建，酸性環境能夠使局部骨組織部位脫礦，促進生長因子如 BMP 等的生成，從而促使 BMSCs 分化成為成骨細胞，有助于新骨形成[13]。本實驗結果顯示，雖然浸泡 48 h 內 O-CMC/CSC 浸泡液的 pH 值有所下降，但仍在安全范圍內，且有利于成骨。
雖然 Ca2+ 可能改變骨吸收/骨重建的平衡，刺激成骨細胞分化，抑制破骨細胞吸收[14]，有利于新骨形成，但高鈣環境容易引起炎性反應，如瞬態高鈣血癥等，而稍高濃度的 Ca2+ 環境（6～8 mmol/L）有利于成骨類細胞分化。O-CMC/CSC 在降解過程中會產生鈣磷鹽類物質，但 Ca2+ 濃度最終穩定在 6～8 mmol/L，且釋放曲線更平穩，提示添加 O-CMC 改善了 CSC 骨再生的 Ca2+ 微環境和生物活性。
在細胞相容性方面，我們將空白對照 1 d 時的A 值作為 100%，根據各組樣品細胞相對成活率來判斷樣品的細胞活性。A 值間接反映細胞數量，一定細胞數量范圍內結晶物形成的量與細胞數成正比，A 值越高可以認為細胞生長越好[15]。O-CMC/CSC 與 CSC 的測試結果之間沒有顯著性差異，提示均可以促進細胞增殖，具有良好細胞活性。
慶大霉素在硫酸鈣基體中主要以 2 種形態存在，分別為以物理吸附在硫酸鈣表面和內部微孔孔壁，以及與硫酸鈣基體或凝膠產生化學螯合。釋放初期主要是物理吸附的慶大霉素擴散釋放，而在釋放后期則主要是與硫酸鈣基體或凝膠產生化學螯合的慶大霉素的溶解釋放，這部分的慶大霉素釋放相對較困難，所以緩釋初期慶大霉素的釋放速度明顯大于釋放后期的釋放速度[16]。載 0.5wt% 慶大霉素的樣品釋放量較少，釋放出的藥物濃度太低，難以達到抗菌、消炎的治療效果；而載藥量達 1.5wt% 的樣品中，慶大霉素釋放不完全，只釋放了總載藥量的 66.7% 左右。載藥量為 2.5wt% 的樣品其釋放量達到了 72%，既能保證治療所需要的藥物濃度，又能使藥物達到高效釋放，效果較佳。樣品對于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌測試均表明，含慶大霉素 1.5wt% 時的抑菌效果較好，且樣品對金黃色葡萄球菌的抑菌性比對大腸桿菌好。
綜上所述，CSC 經 O-CMC 和慶大霉素改性后，提高了其在骨修復領域應用的可行性，但要應用于臨床還有待更深入、系統地研究。
