引用本文： 桑偉林, 姜亞飛, 程飚, 馬金忠, 朱力波, 陸海明, 王聰. 硬化蛋白在內翻畸形膝關節內外側脛骨平臺軟骨下骨中的表達差異及其意義. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(3): 295-299. doi: 10.7507/1002-1892.201610082 復制
骨關節炎是以軟骨退變、軟骨下骨硬化、骨贅形成和關節滑膜炎性反應為特征的退行性疾病，我國膝關節骨關節炎患者往往表現為膝內翻畸形。近年，學者們開始探討軟骨下骨骨重塑在骨關節炎發生、發展中的作用[1]。有學者提出軟骨下骨硬化導致上方軟骨承受負荷增加，可能是引起骨關節炎的重要機制[2-3]。軟骨下骨與軟骨之間通過神經、血管相連并進行信息傳遞和物質交換[4-5]。越來越多的基礎和臨床研究發現，軟骨下骨骨重塑與骨關節炎密切相關[6-7]。
骨關節炎中軟骨下骨的骨重塑主要表現為成骨活躍、破骨抑制，進而表現為骨量增加、骨硬化。硬化蛋白是一個主要由成熟骨細胞分泌的成骨抑制因子，它由位于 17 號染色體上的 sost 基因編碼[8]。與正常關節軟骨下骨相比，骨關節炎關節的軟骨下骨中硬化蛋白表達水平顯著降低[9]，提示硬化蛋白與骨關節炎的發生、發展具有相關性。但在同一關節不同部位以及不同程度骨關節炎中硬化蛋白表達差異及其意義尚缺少研究。本研究擬通過自身對照，比較內翻畸形膝關節內、外側脛骨平臺軟骨下骨中硬化蛋白表達差異，以及軟骨下骨骨結構改變情況，進一步探討硬化蛋白與膝關節骨關節炎發生、發展的相關性，為深入研究膝關節骨關節炎發生機制以及治療方法提供參考。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗標本
實驗用軟骨下骨標本由 2015 年 3 月—10 月南京醫科大學附屬上海一院臨床醫學院收治的 20 例內翻畸形膝關節骨關節炎患者自愿捐贈。其中，男 8 例，女 12 例；年齡 61～78 歲，平均 67.8 歲。體質量 55.0～67.5 kg，平均 59.8 kg。身高 159.0～171.0 cm，平均 163.4 cm。骨關節炎病程 2～5 年，平均 3.2 年。術前均攝膝關節 X 線片，測量內翻角為 12.0～25.5°，平均 17.6°；Kellgren-Lawrance 分級[10]：Ⅲ級 5 例、Ⅳ級 15 例；均以內側間室病變為主（圖 1a）。根據病史和術前檢查結果，排除類風濕性關節炎、創傷性關節炎，患者均無膝關節手術史。
圖1
實驗標本觀察 a. 術前 X 線片； b. 大體觀察內側軟骨面磨損較外側明顯； c. 大體觀察內側軟骨下骨硬化程度較外側明顯增加
Figure1.
Specimen observation a. Preoperative X-ray film; b. The medial cartilage surface wear was more obvious than the lateral side; c. The medial subchondral bone sclerosis was more obvious than the lateral side
人工全膝關節置換術中切取脛骨平臺時，大體觀察見內側軟骨面磨損以及軟骨下骨硬化程度均較外側明顯增加（圖 1b、c），4 例內側間室關節間隙消失伴嚴重膝關節內翻畸形。生理鹽水沖洗標本，去除半月板及周圍軟組織。用內徑為 1 cm 的圓形孔鉆分別在每例患者內、外側脛骨平臺鉆取 3 塊圓柱狀軟骨和軟骨下骨復合組織進行觀測。
1.2 主要試劑及儀器
GTVision 抗鼠/兔通用型免疫組織化學試劑盒、抗硬化蛋白抗體（Sigma 公司，美國）；Trizol（Invitrogen 公司，美國）；PrimeScriptTMRT Master Mix 試劑盒、SYBR? Fast qPCR Mix 試劑盒（TaKaRa 公司，日本）。Micro-CT（杭州越波生物科技有限公司）；NanoDrop2000 紫外分光光度計（NanoDrop 公司，美國）；ViiA7 實時熒光定量 PCR 儀（ABI 公司，美國）；臺式高速離心機（Thermo 公司，英國）。
1.3 觀測指標
1.3.1 Mirco-CT 觀測 每例患者內、外側各取 1 塊標本，置于 4% 多聚甲醛固定 24 h 后，行 Micro-CT 掃描觀察骨結構變化，計算骨體積分數（bone volume/total volume，BV/TV）、骨小梁數量（trabecular number，Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、結構模型指數（structure model index，SMI）、骨小梁分離度（trabecular separation，Tb.Sp）。
1.3.2 實時熒光定量 PCR 檢測 每例患者內、外側各取 1 塊標本，液氮速凍后，研磨成粉末狀并轉移至離心管，采用 Trizol 一步法提取組織 RNA，NanoDrop2000 紫外分光光度計檢測 RNA 純度后，PrimeScriptTMRT Master Mix 試劑盒進行逆轉錄，SYBR? Fast qPCR Mix 試劑盒行 PCR。反應步驟：50℃ 預變性 2 min，95℃ 變性 30 s，95℃ 退火 5 s，60℃ 延伸 30 s，共 40 個循環，72℃ 延伸 10 min。分別測定目的基因 sost 及內參基因 β-actin 的 Ct 值，采用 2–ΔΔCt 法計算 sost 基因表達量。以每例患者內側軟骨下骨中 sost 基因表達水平為參照，計算外側軟骨下骨 sost 基因表達水平。見表 1。
表1
目的基因引物序列
Table1.
Primer sequence of target gene
1.3.3 免疫組織化學染色觀察 每例患者內、外側各取 1 塊標本，置于 4% 多聚甲醛固定 24 h，10% EDTA 脫鈣液脫鈣 4 周，脫水包埋，4 μm 厚切片，免疫組織化學染色后鏡下觀察，細胞質呈棕黃色顆粒狀沉積為硬化蛋白陽性細胞。于 200 倍鏡下，內、外側標本各隨機選取 5 張切片，每張切片取 5 個視野進行細胞計數，計算陽性細胞占全部細胞百分比。
1.4 統計學方法
采用 SPSS12.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用配對t 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 Micro-CT 觀測
掃描觀察顯示，與外側軟骨下骨相比，內側軟骨下骨骨量增加，孔隙減少（圖 2）。骨結構參數測量顯示，內側軟骨下骨 BV/TV、Tb.N、Tb.Th 較外側顯著增高，SMI、Tb.Sp 較外側顯著降低，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 2。
圖2
Mirco-CT 觀察 a、b. 內側軟骨下骨； c、d. 外側軟骨下骨
Figure2.
Micro-CT observation a, b. The medial subchondral bone; c, d. The lateral subchondral bone
表2
內、外側軟骨下骨骨結構參數比較（
n=20，
）
Table2.
Comparison of bone structure parameters between the lateral and medial subchondral bone (
n=20,
)
2.2 實時熒光定量 PCR 檢測
內側軟骨下骨中 sost 基因表達為 1.000，與外側（4.157±2.790）相比顯著降低，比較差異有統計學意義（t=2.371，P=0.040）。
2.3 免疫組織化學染色觀察
鏡下觀察見，與內側軟骨下骨相比，外側軟骨下骨中陽性細胞顯著增多（圖 3）。內側軟骨下骨中硬化蛋白表達陽性細胞所占百分比為 7.20%±0.04%，較外側軟骨下骨（52.00%±0.19%）顯著降低，比較差異有統計學意義（t=5.094，P=0.005）。
圖3
免疫組織化學染色觀察 a. 內側軟骨下骨（×100）； b. 內側軟骨下骨（×200）； c. 外側軟骨下骨（×100）； d. 外側軟骨下骨（×200）
Figure3.
Immunohistochemical staining observation a. The medial subchondral bone (×100); b. The medial subchondral bone (×200); c. The lateral subchondral bone (×100); d. The lateral subchondral bone (×200)
3 討論
本研究通過比較骨關節炎患者的膝關節內、外側脛骨平臺軟骨下骨骨結構改變以及硬化蛋白表達水平差異，發現與外側軟骨下骨相比，在骨關節炎更嚴重的內側軟骨下骨中，骨量明顯增加且硬化蛋白表達水平降低。有研究發現，在小鼠骨關節炎模型中，隨著骨關節炎的進展，軟骨下骨骨重塑表現為早期骨吸收增加、晚期成骨增加，并且這些骨結構改變發生在軟骨退變之前，因此認為軟骨下骨的改變可能是骨關節炎發生、發展的重要因素[11]。研究顯示，隨著骨關節炎的進展，軟骨下骨中的礦物質/膠原比值呈漸進性下降趨勢，骨硬度和彈性模量也隨之降低[11]，這也可能導致骨關節炎進一步發展。本研究標本大體觀察和X線片檢查發現，患者內側骨關節炎程度較外側嚴重，標本關節軟骨磨損程度和軟骨下骨骨硬化程度均顯著高于外側，與既往相關研究報道的軟骨下骨成骨增加與骨關節炎進展成正相關的結果[12]一致。另外，Micro-CT 觀測結果也表明，內、外側軟骨下骨骨結構改變存在明顯差異。內側軟骨下骨成骨較外側明顯增加，表現為 BV/TV、Tb.N、Tb.Th 顯著增高，而 SMI、Tb.Sp 顯著降低，與 Finnil? 等[13]的研究結果一致。以上結果均提示骨關節炎越嚴重，軟骨下骨骨增生、骨硬化程度越明顯。
硬化蛋白主要由成熟骨細胞分泌，既往研究證實骨關節炎軟骨下骨中骨細胞硬化蛋白表達減少可能是引起局部骨硬化的重要因素，在骨關節炎發生、發展中發揮重要作用[14]。體內、體外實驗研究均提示，局部應力增加使骨細胞硬化蛋白表達減少[15-16]，應力負荷的改變可能是影響軟骨下骨中硬化蛋白表達的重要因素。在內翻畸形膝關節骨關節炎發生、發展過程中，膝關節內側間室退變逐漸加重，膝內翻導致內側間室應力負荷增加，可能進一步影響內側軟骨下骨中硬化蛋白表達水平，兩者互為影響因素。因此，我們認為膝內翻畸形的發生雖然與下肢力線、骨關節炎進展等因素有關，也可能與內、外側軟骨下骨中硬化蛋白表達水平改變有一定聯系。
在明確內翻畸形膝關節骨關節炎軟骨下骨結構變化的基礎上，我們以硬化蛋白為基點，進一步探究軟骨下骨結構變化的原因。據文獻報道，骨關節炎軟骨下骨中骨重塑的改變與成骨、破骨失衡有關，其中 sost 基因編碼的硬化蛋白是一種重要的骨重塑調節因子[14,17]。研究發現，軟骨下骨中 sost 的表達與骨關節炎具有相關性[18]。硬化蛋白可以通過阻斷 Wnt/β-catenin 信號通路抑制成骨細胞的活性，減少成骨活動，其抑制劑可以抑制硬化蛋白的活性從而刺激成骨[14]。因此，硬化蛋白抑制劑在治療骨折不愈合與骨質疏松方面具有廣闊前景[19-21]。本研究免疫組織化學染色以及實時熒光定量 PCR 檢測提示，骨關節炎越嚴重、軟骨下骨硬化越明顯，硬化蛋白表達水平越低，說明硬化蛋白可能通過調節軟骨下骨骨重塑進而影響骨關節炎進程。這一結果對于臨床判斷骨關節炎軟骨下骨骨重塑情況具有指導意義。
綜上所述，硬化蛋白是影響軟骨下骨骨重塑的重要因素，與膝關節骨關節炎的發生、進展密切相關。膝關節軟骨下骨的骨結構改變與關節炎進展、結構破壞以及關節置換緊密相關[22]，因此軟骨下骨有望作為治療骨關節炎的重要靶組織，硬化蛋白也可能作為治療的靶分子而發揮作用。
骨關節炎是以軟骨退變、軟骨下骨硬化、骨贅形成和關節滑膜炎性反應為特征的退行性疾病，我國膝關節骨關節炎患者往往表現為膝內翻畸形。近年，學者們開始探討軟骨下骨骨重塑在骨關節炎發生、發展中的作用[1]。有學者提出軟骨下骨硬化導致上方軟骨承受負荷增加，可能是引起骨關節炎的重要機制[2-3]。軟骨下骨與軟骨之間通過神經、血管相連并進行信息傳遞和物質交換[4-5]。越來越多的基礎和臨床研究發現，軟骨下骨骨重塑與骨關節炎密切相關[6-7]。
骨關節炎中軟骨下骨的骨重塑主要表現為成骨活躍、破骨抑制，進而表現為骨量增加、骨硬化。硬化蛋白是一個主要由成熟骨細胞分泌的成骨抑制因子，它由位于 17 號染色體上的 sost 基因編碼[8]。與正常關節軟骨下骨相比，骨關節炎關節的軟骨下骨中硬化蛋白表達水平顯著降低[9]，提示硬化蛋白與骨關節炎的發生、發展具有相關性。但在同一關節不同部位以及不同程度骨關節炎中硬化蛋白表達差異及其意義尚缺少研究。本研究擬通過自身對照，比較內翻畸形膝關節內、外側脛骨平臺軟骨下骨中硬化蛋白表達差異，以及軟骨下骨骨結構改變情況，進一步探討硬化蛋白與膝關節骨關節炎發生、發展的相關性，為深入研究膝關節骨關節炎發生機制以及治療方法提供參考。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗標本
實驗用軟骨下骨標本由 2015 年 3 月—10 月南京醫科大學附屬上海一院臨床醫學院收治的 20 例內翻畸形膝關節骨關節炎患者自愿捐贈。其中，男 8 例，女 12 例；年齡 61～78 歲，平均 67.8 歲。體質量 55.0～67.5 kg，平均 59.8 kg。身高 159.0～171.0 cm，平均 163.4 cm。骨關節炎病程 2～5 年，平均 3.2 年。術前均攝膝關節 X 線片，測量內翻角為 12.0～25.5°，平均 17.6°；Kellgren-Lawrance 分級[10]：Ⅲ級 5 例、Ⅳ級 15 例；均以內側間室病變為主（圖 1a）。根據病史和術前檢查結果，排除類風濕性關節炎、創傷性關節炎，患者均無膝關節手術史。
圖1
實驗標本觀察 a. 術前 X 線片； b. 大體觀察內側軟骨面磨損較外側明顯； c. 大體觀察內側軟骨下骨硬化程度較外側明顯增加
Figure1.
Specimen observation a. Preoperative X-ray film; b. The medial cartilage surface wear was more obvious than the lateral side; c. The medial subchondral bone sclerosis was more obvious than the lateral side
人工全膝關節置換術中切取脛骨平臺時，大體觀察見內側軟骨面磨損以及軟骨下骨硬化程度均較外側明顯增加（圖 1b、c），4 例內側間室關節間隙消失伴嚴重膝關節內翻畸形。生理鹽水沖洗標本，去除半月板及周圍軟組織。用內徑為 1 cm 的圓形孔鉆分別在每例患者內、外側脛骨平臺鉆取 3 塊圓柱狀軟骨和軟骨下骨復合組織進行觀測。
1.2 主要試劑及儀器
GTVision 抗鼠/兔通用型免疫組織化學試劑盒、抗硬化蛋白抗體（Sigma 公司，美國）；Trizol（Invitrogen 公司，美國）；PrimeScriptTMRT Master Mix 試劑盒、SYBR? Fast qPCR Mix 試劑盒（TaKaRa 公司，日本）。Micro-CT（杭州越波生物科技有限公司）；NanoDrop2000 紫外分光光度計（NanoDrop 公司，美國）；ViiA7 實時熒光定量 PCR 儀（ABI 公司，美國）；臺式高速離心機（Thermo 公司，英國）。
1.3 觀測指標
1.3.1 Mirco-CT 觀測 每例患者內、外側各取 1 塊標本，置于 4% 多聚甲醛固定 24 h 后，行 Micro-CT 掃描觀察骨結構變化，計算骨體積分數（bone volume/total volume，BV/TV）、骨小梁數量（trabecular number，Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、結構模型指數（structure model index，SMI）、骨小梁分離度（trabecular separation，Tb.Sp）。
1.3.2 實時熒光定量 PCR 檢測 每例患者內、外側各取 1 塊標本，液氮速凍后，研磨成粉末狀并轉移至離心管，采用 Trizol 一步法提取組織 RNA，NanoDrop2000 紫外分光光度計檢測 RNA 純度后，PrimeScriptTMRT Master Mix 試劑盒進行逆轉錄，SYBR? Fast qPCR Mix 試劑盒行 PCR。反應步驟：50℃ 預變性 2 min，95℃ 變性 30 s，95℃ 退火 5 s，60℃ 延伸 30 s，共 40 個循環，72℃ 延伸 10 min。分別測定目的基因 sost 及內參基因 β-actin 的 Ct 值，采用 2–ΔΔCt 法計算 sost 基因表達量。以每例患者內側軟骨下骨中 sost 基因表達水平為參照，計算外側軟骨下骨 sost 基因表達水平。見表 1。
表1
目的基因引物序列
Table1.
Primer sequence of target gene
1.3.3 免疫組織化學染色觀察 每例患者內、外側各取 1 塊標本，置于 4% 多聚甲醛固定 24 h，10% EDTA 脫鈣液脫鈣 4 周，脫水包埋，4 μm 厚切片，免疫組織化學染色后鏡下觀察，細胞質呈棕黃色顆粒狀沉積為硬化蛋白陽性細胞。于 200 倍鏡下，內、外側標本各隨機選取 5 張切片，每張切片取 5 個視野進行細胞計數，計算陽性細胞占全部細胞百分比。
1.4 統計學方法
采用 SPSS12.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用配對t 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 Micro-CT 觀測
掃描觀察顯示，與外側軟骨下骨相比，內側軟骨下骨骨量增加，孔隙減少（圖 2）。骨結構參數測量顯示，內側軟骨下骨 BV/TV、Tb.N、Tb.Th 較外側顯著增高，SMI、Tb.Sp 較外側顯著降低，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 2。
圖2
Mirco-CT 觀察 a、b. 內側軟骨下骨； c、d. 外側軟骨下骨
Figure2.
Micro-CT observation a, b. The medial subchondral bone; c, d. The lateral subchondral bone
表2
內、外側軟骨下骨骨結構參數比較（
n=20，
）
Table2.
Comparison of bone structure parameters between the lateral and medial subchondral bone (
n=20,
)
2.2 實時熒光定量 PCR 檢測
內側軟骨下骨中 sost 基因表達為 1.000，與外側（4.157±2.790）相比顯著降低，比較差異有統計學意義（t=2.371，P=0.040）。
2.3 免疫組織化學染色觀察
鏡下觀察見，與內側軟骨下骨相比，外側軟骨下骨中陽性細胞顯著增多（圖 3）。內側軟骨下骨中硬化蛋白表達陽性細胞所占百分比為 7.20%±0.04%，較外側軟骨下骨（52.00%±0.19%）顯著降低，比較差異有統計學意義（t=5.094，P=0.005）。
圖3
免疫組織化學染色觀察 a. 內側軟骨下骨（×100）； b. 內側軟骨下骨（×200）； c. 外側軟骨下骨（×100）； d. 外側軟骨下骨（×200）
Figure3.
Immunohistochemical staining observation a. The medial subchondral bone (×100); b. The medial subchondral bone (×200); c. The lateral subchondral bone (×100); d. The lateral subchondral bone (×200)
3 討論
本研究通過比較骨關節炎患者的膝關節內、外側脛骨平臺軟骨下骨骨結構改變以及硬化蛋白表達水平差異，發現與外側軟骨下骨相比，在骨關節炎更嚴重的內側軟骨下骨中，骨量明顯增加且硬化蛋白表達水平降低。有研究發現，在小鼠骨關節炎模型中，隨著骨關節炎的進展，軟骨下骨骨重塑表現為早期骨吸收增加、晚期成骨增加，并且這些骨結構改變發生在軟骨退變之前，因此認為軟骨下骨的改變可能是骨關節炎發生、發展的重要因素[11]。研究顯示，隨著骨關節炎的進展，軟骨下骨中的礦物質/膠原比值呈漸進性下降趨勢，骨硬度和彈性模量也隨之降低[11]，這也可能導致骨關節炎進一步發展。本研究標本大體觀察和X線片檢查發現，患者內側骨關節炎程度較外側嚴重，標本關節軟骨磨損程度和軟骨下骨骨硬化程度均顯著高于外側，與既往相關研究報道的軟骨下骨成骨增加與骨關節炎進展成正相關的結果[12]一致。另外，Micro-CT 觀測結果也表明，內、外側軟骨下骨骨結構改變存在明顯差異。內側軟骨下骨成骨較外側明顯增加，表現為 BV/TV、Tb.N、Tb.Th 顯著增高，而 SMI、Tb.Sp 顯著降低，與 Finnil? 等[13]的研究結果一致。以上結果均提示骨關節炎越嚴重，軟骨下骨骨增生、骨硬化程度越明顯。
硬化蛋白主要由成熟骨細胞分泌，既往研究證實骨關節炎軟骨下骨中骨細胞硬化蛋白表達減少可能是引起局部骨硬化的重要因素，在骨關節炎發生、發展中發揮重要作用[14]。體內、體外實驗研究均提示，局部應力增加使骨細胞硬化蛋白表達減少[15-16]，應力負荷的改變可能是影響軟骨下骨中硬化蛋白表達的重要因素。在內翻畸形膝關節骨關節炎發生、發展過程中，膝關節內側間室退變逐漸加重，膝內翻導致內側間室應力負荷增加，可能進一步影響內側軟骨下骨中硬化蛋白表達水平，兩者互為影響因素。因此，我們認為膝內翻畸形的發生雖然與下肢力線、骨關節炎進展等因素有關，也可能與內、外側軟骨下骨中硬化蛋白表達水平改變有一定聯系。
在明確內翻畸形膝關節骨關節炎軟骨下骨結構變化的基礎上，我們以硬化蛋白為基點，進一步探究軟骨下骨結構變化的原因。據文獻報道，骨關節炎軟骨下骨中骨重塑的改變與成骨、破骨失衡有關，其中 sost 基因編碼的硬化蛋白是一種重要的骨重塑調節因子[14,17]。研究發現，軟骨下骨中 sost 的表達與骨關節炎具有相關性[18]。硬化蛋白可以通過阻斷 Wnt/β-catenin 信號通路抑制成骨細胞的活性，減少成骨活動，其抑制劑可以抑制硬化蛋白的活性從而刺激成骨[14]。因此，硬化蛋白抑制劑在治療骨折不愈合與骨質疏松方面具有廣闊前景[19-21]。本研究免疫組織化學染色以及實時熒光定量 PCR 檢測提示，骨關節炎越嚴重、軟骨下骨硬化越明顯，硬化蛋白表達水平越低，說明硬化蛋白可能通過調節軟骨下骨骨重塑進而影響骨關節炎進程。這一結果對于臨床判斷骨關節炎軟骨下骨骨重塑情況具有指導意義。
綜上所述，硬化蛋白是影響軟骨下骨骨重塑的重要因素，與膝關節骨關節炎的發生、進展密切相關。膝關節軟骨下骨的骨結構改變與關節炎進展、結構破壞以及關節置換緊密相關[22]，因此軟骨下骨有望作為治療骨關節炎的重要靶組織，硬化蛋白也可能作為治療的靶分子而發揮作用。
