引用本文： 李世偉, 謝曉麗, 楊曉東, 劉利君, 唐學陽. 超聲微泡轉基因技術促增強型綠色熒光蛋白基因在骨缺損處轉染的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(4): 437-442. doi: 10.7507/1002-1892.201611059 復制
外傷、感染及腫瘤等導致的骨缺損是矯形外科治療難題[1-3]，臨床常用的自體或同種異體骨移植修復仍有骨不連發生風險[4]；帶血管蒂骨移植及骨搬運技術治療長段骨缺損有一定優勢，但愈合時間較長[5-6]。如在這些治療方法基礎上輔以刺激骨再生方法，則有望提高骨缺損愈合率以及縮短愈合所需時間。
有研究表明，病毒載體介導的 BMP-2 基因治療可以促進骨缺損愈合[7-8]。但病毒載體轉染存在潛在毒性及免疫原性問題，限制了臨床應用。超聲微泡轉基因技術是一種新型基因轉染方法，具有安全、高效、靶向、易重復等優點[9-10]。目前該技術已用于肝臟、腎臟、血管、跟腱等領域的研究[11-14]，但罕見應用于骨缺損相關研究的報道。超聲微泡轉基因技術轉染效率受超聲基本參數（輻照時間、輻照強度、占空比）影響，不恰當的參數設置不僅會降低轉染效果，甚至會導致組織損傷[11,15-18]。此外，不同組織和器官其適用的超聲參數也不同，骨缺損斷端間早期以纖維骨痂及嵌入的骨骼肌為主，肝臟、腎臟及跟腱等組織的最適參數難以直接應用于骨缺損。為此，本研究旨在探討超聲微泡轉基因技術介導增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因在兔骨缺損處轉染時的最佳輻照時間，以期為該技術用于骨缺損修復奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
3 月齡雄性新西蘭大白兔 30 只，體質量 2.5～3.0 kg，由四川大學動物實驗中心提供。pEGFP-C1 質粒（北京天漠科技有限公司）；戊巴比妥鈉（Sigma 公司，美國）；注射用六氟化硫微泡（商品名：聲諾維；Bracco 公司，意大利）；質粒小提試劑盒（Takara 公司，日本）。超聲治療儀（OG Giken 公司，日本）；光學顯微鏡（Olympus 公司，日本）；熒光顯微鏡（Leica 公司，德國）；透射電鏡（Hitachi 公司，日本）；Image-Pro Plus 6.0 病理圖像分析軟件（Media Cybernetics 公司，美國）。
1.2 實驗方法
1.2.1 EGFP 質粒微泡混懸液配置 pEGFP-C1 質粒轉化大腸桿菌 DH5α，經過篩選，參照質粒小提試劑盒說明書進行提取、純化，使最終質粒濃度為 1 μg/μL，–20℃ 保存。注射用六氟化硫微泡加入生理鹽水震蕩均勻，使其濃度為 5 mg/mL，密度為（2～5）×108 個/mL。將制備的 EGFP 質粒與微泡按體積比 1∶2 混勻，制成 EGFP 質粒微泡混懸液，4℃ 保存。
1.2.2 骨缺損模型制備 取 30 只新西蘭大白兔，耳緣靜脈注射 3% 戊巴比妥鈉溶液（40 mg/kg）麻醉后，仰臥位固定于手術臺，右前肢剃毛，切開皮膚皮下，鈍性分離肌肉，顯露尺骨中段。用線鋸于尺骨中段連同骨膜一并切除，制備長度為 2 cm 的骨缺損模型。術前 30 min 及術后 24、48 h 分別肌肉注射青霉素 40 萬 U 預防感染，麻醉清醒后正常飼養。
1.2.3 EGFP 基因轉染 造模后第 10 天，動物同上法麻醉后固定于手術臺，向骨缺損處注射 EGFP 質粒微泡混懸液（0.3 mL/kg）。注射后立即用超聲治療儀輻照，超聲頻率 1 MHz，超聲強度 0.5 W/cm2，占空比 20%。根據輻照持續時間，將動物模型隨機分為 5 組（n=6），分別持續 1、2、3、4、5 min（分別為 1、2、3、4、5 min 組）[9,19]。轉染后 1 周，經耳緣靜脈注射過量麻醉藥物處死各組動物取材進行觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況 造模后觀察動物存活、進食、活動及切口愈合情況。
1.3.2 大體觀察 轉染后 1 周，按照原切口入路，肉眼觀察骨缺損處軟組織形態特點。
1.3.3 熒光顯微鏡觀察 取骨缺損處軟組織，OTC 包埋劑包埋，—20℃ 連續切片，切片厚度 5 μm，丙酮固定、晾干，DAPI 染色后在熒光顯微鏡下觀察切片中綠色熒光表達情況。每只兔選取 3 張綠色熒光表達最強切片，于 200 倍鏡下每張切片隨機選取 5 個熒光表達最強的視野，采圖后用 Image-Pro Plus 6.0 病理圖像分析軟件進行分析，計算吸光度（A）值，取均值。
1.3.4 組織學觀察 取骨缺損處軟組織，于 4% 多聚甲醛固定 24 h，脫水、透明、包埋、切片，片厚 4 μm，常規 HE 染色后，光鏡下觀察組織細胞形態特點。
1.3.5 透射電鏡觀察 取液氮保存的骨缺損處軟組織，經固定、脫水、浸透包埋后切片，片厚 70 nm，枸櫞酸鉛染色后用透射電鏡觀察組織細胞形態特點。
1.4 統計學方法
采用 SPSS16.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用 Tamhane 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
各組動物均存活至實驗完成。所有動物麻醉清醒后恢復自由飲水和進食。1 周內各組動物術肢均活動受限；4 d 內術肢有腫脹，4 d 后腫脹逐漸消失。切口均愈合良好，無滲液及化膿。
2.2 大體觀察
大體觀察各組無明顯差異，骨缺損斷面處均有軟組織生長，兩斷面間未連接，周圍肌肉部分內陷填充于骨缺損斷端之間。
2.3 熒光顯微鏡觀察
各組兔骨缺損處均有綠色熒光表達，其中 2 min 組表達最強，其次依次為 4 min 組、3 min 組、5 min 組，1 min 組表達最弱，見圖 1。1、2、3、4、5 min 組A 值分別為 0.030±0.001、0.046±0.004、0.034±0.002、0.039±0.004、0.032±0.001；2 min 組明顯高于其他各組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；1 min 組低于 3、4、5 min 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；3、4、5 min 組間差異無統計學意義（P>0.05）。
圖1
各組熒光顯微鏡觀察（×200） a. 1 min 組；b. 2 min 組；c. 3 min 組；d. 4 min 組；e. 5 min 組
Figure1.
Fluorescence microscope observation of each group (×200) a. 1 minute group; b. 2 minutes group; c. 3 minutes group; d. 4 minutes group; e. 5 minutes group
2.4 組織學觀察
1 min 組及 2 min 組組織稍水腫，可見少量炎性細胞浸潤，未見細胞溶解、核碎裂及炎性細胞吞噬等肌細胞壞死現象。3 min 組及 4 min 組組織明顯水腫，可見較多炎性細胞浸潤，偶見肌細胞被炎性細胞吞噬。5 min 組組織水腫程度和 3、4 min 組相似，但肌纖維減少，結締組織增生，可見到更多炎性細胞浸潤及肌細胞被炎性細胞吞噬。見圖 2。
圖2
各組組織學觀察（HE×200） a. 1 min 組；b. 2 min 組；c. 3 min 組；d. 4 min 組；e. 5 min 組
Figure2.
Histological observation of each group (HE×200) a. 1 minute group; b. 2 minutes group; c. 3 minutes group; d. 4 minutes group; e. 5 minutes group
2.5 透射電鏡觀察
1 min 組小部分肌細胞呈損傷后修復狀態，肌絲排列尚整齊，可見肌絲間隙增寬，線粒體形態基本正常，偶見肌漿網呈空泡狀腫脹。2 min 組和 1 min 組表現相似，但可見少量線粒體略腫脹。3 min 組更多肌細胞呈變性后修復狀態，肌絲排列尚整齊，肌絲間隙寬，肌質網、線粒體等細胞器腫脹程度較 2 min 組明顯，偶見線粒體嵴消失。4、5 min 組肌絲排列紊亂，可見肌絲溶解、肌絲間隙增寬，肌質網、線粒體腫脹。見圖 3。
圖3
各組透射電鏡觀察（×1 500） a. 1 min 組；b. 2 min 組；c. 3 min 組；d. 4 min 組；e. 5 min 組
Figure3.
Transmission electron microscope observation of each group (×1 500) a. 1 minute group; b. 2 minutes group; c. 3 minutes group; d. 4 minutes group; e. 5 minutes group
3 討論
超聲微泡轉基因技術作為一種非病毒載體可將目的基因轉染至多種組織及細胞[11-14]。骨缺損部位存在組織破壞與修復，針對這樣的組織給予一定強度、不同時間的超聲輻照促進微泡破碎，是否能促進基因的有效轉染與表達，或是否加重骨缺損部位的組織損害，是采用 BMP-2 等相關成骨基因轉染治療骨缺損研究中必須考慮的問題。
基因轉染效率和超聲總能量相關，即超聲強度、輻照時間、占空比都是轉染效率的影響因素[9,17,20]。有研究表明，隨著輻照時間延長，細胞基因轉染率升高，但同時細胞成活率降低[11,17-18,20]。但也有研究表明，在促進目的基因有效轉染的條件下，無目前可探測的損傷[9,21]。不同研究間的矛盾可能是由于超聲參數、動物年齡、動物種類及靶器官的差異所造成的。Qiu 等[9] 在研究超聲微泡轉基因技術促 EGFP 基因在兔跟腱組織轉染的實驗中，使用的占空比與我們實驗相同，但輻照時間更長，超聲強度更高，也未發現細胞損傷。Delalande 等[19] 使用超聲微泡轉基因技術促進基因在小鼠跟腱的表達，結果顯示在頻率 1 MHz、占空比 40% 的條件下，輻照 10 min 可以安全無毒促進基因轉染與表達。
本實驗顯示，接受不同時間超聲輻照后，各組兔骨缺損部位均觀察到組織損傷。隨著超聲輻照時間的增加，骨缺損處軟組織的炎性反應逐漸加重。其損傷可能既包括手術造模引起的破壞，也包括超聲輻照微泡破碎造成的組織細胞損害。由于各組除輻照時間外實驗條件相同，可以認為組間破壞程度的逐漸加重與輻照時間延長直接相關。
超聲微泡轉基因技術促基因轉染的主要原理是微泡在超聲輻照下產生空化效應，使細胞膜通透性可逆性地增加，從而增強微泡對基因的轉移[10,22]。本實驗中雖然超聲輻照時間為 2 min 時，組織細胞損傷較 1 min 時明顯，但其最終獲得的目的基因表達強度卻最強，超聲輻照時間為 3、4、5 min 時目的基因表達無統計學差異。究其原因，可能是 2 min 輻照時間所產生的能量恰好使足夠多的微泡產生空化效應，從而使目的基因最大量的進入靶細胞。當輻照時間不足 2 min 時，可能不足以使足夠多的微泡產生空化效應，因而進入細胞內的目的基因數量較前者減少。而輻照時間超過 2 min 時，雖然進入細胞的基因已達到閾值，但隨著輻照時間的延長，過強的能量給組織帶來的損傷逐漸加重，從而影響靶細胞的基因表達。
總之，利用超聲微泡轉基因技術促 EGFP 在兔尺骨骨缺損處表達時，超聲微泡破碎會給組織帶來一定損傷，并且損傷的程度隨著超聲輻照時間的延長而加重，而目的基因表達強度不因此而依次增強。考慮到組織損傷低水平而基因轉染效能最強化的要求，兔骨缺損活體超聲微泡破碎技術轉基因實驗研究中，在合適的輻射強度等實驗條件下，宜選擇 2 min 輻照時間。在后續實驗中我們將進一步篩選最適的輻照強度及占空比等超聲參數，并在此基礎上利用超聲微泡轉基因技術促 BMP-2 基因在兔骨缺損處轉染，從而誘導骨再生，以期為臨床骨缺損修復提供新的思路。
外傷、感染及腫瘤等導致的骨缺損是矯形外科治療難題[1-3]，臨床常用的自體或同種異體骨移植修復仍有骨不連發生風險[4]；帶血管蒂骨移植及骨搬運技術治療長段骨缺損有一定優勢，但愈合時間較長[5-6]。如在這些治療方法基礎上輔以刺激骨再生方法，則有望提高骨缺損愈合率以及縮短愈合所需時間。
有研究表明，病毒載體介導的 BMP-2 基因治療可以促進骨缺損愈合[7-8]。但病毒載體轉染存在潛在毒性及免疫原性問題，限制了臨床應用。超聲微泡轉基因技術是一種新型基因轉染方法，具有安全、高效、靶向、易重復等優點[9-10]。目前該技術已用于肝臟、腎臟、血管、跟腱等領域的研究[11-14]，但罕見應用于骨缺損相關研究的報道。超聲微泡轉基因技術轉染效率受超聲基本參數（輻照時間、輻照強度、占空比）影響，不恰當的參數設置不僅會降低轉染效果，甚至會導致組織損傷[11,15-18]。此外，不同組織和器官其適用的超聲參數也不同，骨缺損斷端間早期以纖維骨痂及嵌入的骨骼肌為主，肝臟、腎臟及跟腱等組織的最適參數難以直接應用于骨缺損。為此，本研究旨在探討超聲微泡轉基因技術介導增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因在兔骨缺損處轉染時的最佳輻照時間，以期為該技術用于骨缺損修復奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
3 月齡雄性新西蘭大白兔 30 只，體質量 2.5～3.0 kg，由四川大學動物實驗中心提供。pEGFP-C1 質粒（北京天漠科技有限公司）；戊巴比妥鈉（Sigma 公司，美國）；注射用六氟化硫微泡（商品名：聲諾維；Bracco 公司，意大利）；質粒小提試劑盒（Takara 公司，日本）。超聲治療儀（OG Giken 公司，日本）；光學顯微鏡（Olympus 公司，日本）；熒光顯微鏡（Leica 公司，德國）；透射電鏡（Hitachi 公司，日本）；Image-Pro Plus 6.0 病理圖像分析軟件（Media Cybernetics 公司，美國）。
1.2 實驗方法
1.2.1 EGFP 質粒微泡混懸液配置 pEGFP-C1 質粒轉化大腸桿菌 DH5α，經過篩選，參照質粒小提試劑盒說明書進行提取、純化，使最終質粒濃度為 1 μg/μL，–20℃ 保存。注射用六氟化硫微泡加入生理鹽水震蕩均勻，使其濃度為 5 mg/mL，密度為（2～5）×108 個/mL。將制備的 EGFP 質粒與微泡按體積比 1∶2 混勻，制成 EGFP 質粒微泡混懸液，4℃ 保存。
1.2.2 骨缺損模型制備 取 30 只新西蘭大白兔，耳緣靜脈注射 3% 戊巴比妥鈉溶液（40 mg/kg）麻醉后，仰臥位固定于手術臺，右前肢剃毛，切開皮膚皮下，鈍性分離肌肉，顯露尺骨中段。用線鋸于尺骨中段連同骨膜一并切除，制備長度為 2 cm 的骨缺損模型。術前 30 min 及術后 24、48 h 分別肌肉注射青霉素 40 萬 U 預防感染，麻醉清醒后正常飼養。
1.2.3 EGFP 基因轉染 造模后第 10 天，動物同上法麻醉后固定于手術臺，向骨缺損處注射 EGFP 質粒微泡混懸液（0.3 mL/kg）。注射后立即用超聲治療儀輻照，超聲頻率 1 MHz，超聲強度 0.5 W/cm2，占空比 20%。根據輻照持續時間，將動物模型隨機分為 5 組（n=6），分別持續 1、2、3、4、5 min（分別為 1、2、3、4、5 min 組）[9,19]。轉染后 1 周，經耳緣靜脈注射過量麻醉藥物處死各組動物取材進行觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況 造模后觀察動物存活、進食、活動及切口愈合情況。
1.3.2 大體觀察 轉染后 1 周，按照原切口入路，肉眼觀察骨缺損處軟組織形態特點。
1.3.3 熒光顯微鏡觀察 取骨缺損處軟組織，OTC 包埋劑包埋，—20℃ 連續切片，切片厚度 5 μm，丙酮固定、晾干，DAPI 染色后在熒光顯微鏡下觀察切片中綠色熒光表達情況。每只兔選取 3 張綠色熒光表達最強切片，于 200 倍鏡下每張切片隨機選取 5 個熒光表達最強的視野，采圖后用 Image-Pro Plus 6.0 病理圖像分析軟件進行分析，計算吸光度（A）值，取均值。
1.3.4 組織學觀察 取骨缺損處軟組織，于 4% 多聚甲醛固定 24 h，脫水、透明、包埋、切片，片厚 4 μm，常規 HE 染色后，光鏡下觀察組織細胞形態特點。
1.3.5 透射電鏡觀察 取液氮保存的骨缺損處軟組織，經固定、脫水、浸透包埋后切片，片厚 70 nm，枸櫞酸鉛染色后用透射電鏡觀察組織細胞形態特點。
1.4 統計學方法
采用 SPSS16.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用 Tamhane 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
各組動物均存活至實驗完成。所有動物麻醉清醒后恢復自由飲水和進食。1 周內各組動物術肢均活動受限；4 d 內術肢有腫脹，4 d 后腫脹逐漸消失。切口均愈合良好，無滲液及化膿。
2.2 大體觀察
大體觀察各組無明顯差異，骨缺損斷面處均有軟組織生長，兩斷面間未連接，周圍肌肉部分內陷填充于骨缺損斷端之間。
2.3 熒光顯微鏡觀察
各組兔骨缺損處均有綠色熒光表達，其中 2 min 組表達最強，其次依次為 4 min 組、3 min 組、5 min 組，1 min 組表達最弱，見圖 1。1、2、3、4、5 min 組A 值分別為 0.030±0.001、0.046±0.004、0.034±0.002、0.039±0.004、0.032±0.001；2 min 組明顯高于其他各組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；1 min 組低于 3、4、5 min 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；3、4、5 min 組間差異無統計學意義（P>0.05）。
圖1
各組熒光顯微鏡觀察（×200） a. 1 min 組；b. 2 min 組；c. 3 min 組；d. 4 min 組；e. 5 min 組
Figure1.
Fluorescence microscope observation of each group (×200) a. 1 minute group; b. 2 minutes group; c. 3 minutes group; d. 4 minutes group; e. 5 minutes group
2.4 組織學觀察
1 min 組及 2 min 組組織稍水腫，可見少量炎性細胞浸潤，未見細胞溶解、核碎裂及炎性細胞吞噬等肌細胞壞死現象。3 min 組及 4 min 組組織明顯水腫，可見較多炎性細胞浸潤，偶見肌細胞被炎性細胞吞噬。5 min 組組織水腫程度和 3、4 min 組相似，但肌纖維減少，結締組織增生，可見到更多炎性細胞浸潤及肌細胞被炎性細胞吞噬。見圖 2。
圖2
各組組織學觀察（HE×200） a. 1 min 組；b. 2 min 組；c. 3 min 組；d. 4 min 組；e. 5 min 組
Figure2.
Histological observation of each group (HE×200) a. 1 minute group; b. 2 minutes group; c. 3 minutes group; d. 4 minutes group; e. 5 minutes group
2.5 透射電鏡觀察
1 min 組小部分肌細胞呈損傷后修復狀態，肌絲排列尚整齊，可見肌絲間隙增寬，線粒體形態基本正常，偶見肌漿網呈空泡狀腫脹。2 min 組和 1 min 組表現相似，但可見少量線粒體略腫脹。3 min 組更多肌細胞呈變性后修復狀態，肌絲排列尚整齊，肌絲間隙寬，肌質網、線粒體等細胞器腫脹程度較 2 min 組明顯，偶見線粒體嵴消失。4、5 min 組肌絲排列紊亂，可見肌絲溶解、肌絲間隙增寬，肌質網、線粒體腫脹。見圖 3。
圖3
各組透射電鏡觀察（×1 500） a. 1 min 組；b. 2 min 組；c. 3 min 組；d. 4 min 組；e. 5 min 組
Figure3.
Transmission electron microscope observation of each group (×1 500) a. 1 minute group; b. 2 minutes group; c. 3 minutes group; d. 4 minutes group; e. 5 minutes group
3 討論
超聲微泡轉基因技術作為一種非病毒載體可將目的基因轉染至多種組織及細胞[11-14]。骨缺損部位存在組織破壞與修復，針對這樣的組織給予一定強度、不同時間的超聲輻照促進微泡破碎，是否能促進基因的有效轉染與表達，或是否加重骨缺損部位的組織損害，是采用 BMP-2 等相關成骨基因轉染治療骨缺損研究中必須考慮的問題。
基因轉染效率和超聲總能量相關，即超聲強度、輻照時間、占空比都是轉染效率的影響因素[9,17,20]。有研究表明，隨著輻照時間延長，細胞基因轉染率升高，但同時細胞成活率降低[11,17-18,20]。但也有研究表明，在促進目的基因有效轉染的條件下，無目前可探測的損傷[9,21]。不同研究間的矛盾可能是由于超聲參數、動物年齡、動物種類及靶器官的差異所造成的。Qiu 等[9] 在研究超聲微泡轉基因技術促 EGFP 基因在兔跟腱組織轉染的實驗中，使用的占空比與我們實驗相同，但輻照時間更長，超聲強度更高，也未發現細胞損傷。Delalande 等[19] 使用超聲微泡轉基因技術促進基因在小鼠跟腱的表達，結果顯示在頻率 1 MHz、占空比 40% 的條件下，輻照 10 min 可以安全無毒促進基因轉染與表達。
本實驗顯示，接受不同時間超聲輻照后，各組兔骨缺損部位均觀察到組織損傷。隨著超聲輻照時間的增加，骨缺損處軟組織的炎性反應逐漸加重。其損傷可能既包括手術造模引起的破壞，也包括超聲輻照微泡破碎造成的組織細胞損害。由于各組除輻照時間外實驗條件相同，可以認為組間破壞程度的逐漸加重與輻照時間延長直接相關。
超聲微泡轉基因技術促基因轉染的主要原理是微泡在超聲輻照下產生空化效應，使細胞膜通透性可逆性地增加，從而增強微泡對基因的轉移[10,22]。本實驗中雖然超聲輻照時間為 2 min 時，組織細胞損傷較 1 min 時明顯，但其最終獲得的目的基因表達強度卻最強，超聲輻照時間為 3、4、5 min 時目的基因表達無統計學差異。究其原因，可能是 2 min 輻照時間所產生的能量恰好使足夠多的微泡產生空化效應，從而使目的基因最大量的進入靶細胞。當輻照時間不足 2 min 時，可能不足以使足夠多的微泡產生空化效應，因而進入細胞內的目的基因數量較前者減少。而輻照時間超過 2 min 時，雖然進入細胞的基因已達到閾值，但隨著輻照時間的延長，過強的能量給組織帶來的損傷逐漸加重，從而影響靶細胞的基因表達。
總之，利用超聲微泡轉基因技術促 EGFP 在兔尺骨骨缺損處表達時，超聲微泡破碎會給組織帶來一定損傷，并且損傷的程度隨著超聲輻照時間的延長而加重，而目的基因表達強度不因此而依次增強。考慮到組織損傷低水平而基因轉染效能最強化的要求，兔骨缺損活體超聲微泡破碎技術轉基因實驗研究中，在合適的輻射強度等實驗條件下，宜選擇 2 min 輻照時間。在后續實驗中我們將進一步篩選最適的輻照強度及占空比等超聲參數，并在此基礎上利用超聲微泡轉基因技術促 BMP-2 基因在兔骨缺損處轉染，從而誘導骨再生，以期為臨床骨缺損修復提供新的思路。
