引用本文： 武文杰, 劉浩, 婁紀綱, 楊運北, 戎鑫, 許建中. 國產人工頸椎間盤界面壓力對假體-骨界面骨整合的影響. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(4): 443-450. doi: 10.7507/1002-1892.201610121 復制
近年來，人工頸椎間盤置換手術取得了較好的近期療效[1-2]。但是人工頸椎間盤為終生使用，植入體內后如何獲得長期穩定，避免下沉、移位、脫落等并發癥發生，尚缺乏系統研究。目前各種假體終板-骨界面設計可以提供植入后的即刻穩定性，但后期穩定性則依靠骨長入來實現。骨長入這一過程受到很多因素的影響，如壓力、微動、力學環境等[3-4]。因此，深入研究假體終板-骨界面愈合機制，設計更符合生理結構的人工頸椎間盤假體至關重要[5]。大量研究已證明，壓力對于局部假體終板-骨界面的骨整合有重要影響[6-7]。因此，本實驗通過分析假體植入后終板-骨界面的壓力分布，根據壓力分布特點分析不同壓力區域骨計量學指標，觀察壓力對骨整合的影響；同時分析壓力作用后促進成骨細胞分化增殖信號分子表達水平的變化，觀察假體植入后分子層面骨整合的結果。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
成年雄性山羊 17 只，體質量 20～30 kg，由四川大學動物實驗中心提供。其中 13 只山羊采用國產人工頸椎間盤假體（規格：5 mm×12 mm、5 mm×14 mm；常熟創生醫療器械有限公司）行 C3、4 椎間盤置換術。
DMEM、FBS（Sigma 公司，美國）；1%PSF、去離子蒸餾水（GIBCO 公司，美國）；三氯甲烷、冰異丙醇（Sigma-Aldrich 公司，瑞士）；PCR 引物（Intergen Discovery Products 公司，美國）；質粒小量抽提試劑盒（Macherey-Nagel 公司，德國）；RNA 提取試劑（Invitrogen AG 公司，瑞士）；逆轉錄酶、RNA 酶抑制劑、隨機化六聚引物（Invitrogen 公司，美國）。
Mimics10.0 軟件（Maeterialise 公司，比利時）；Geomagic Studio8.0 軟件（Raindrop 公司，美國）；ABAQUS6.1 分析計算軟件（ABAQUS 公司，美國）；骨分析軟件 Scanco 軟件（Wolfram Research 公司，美國）；64 排螺旋 CT（Siemens 公司，德國）；Micro-CT、不銹鋼小珠（GmbH 公司，德國）； PCR 擴增儀（Roche 公司，瑞士）；多功能分光光度計（Eppendorf 公司，德國）；熒光定量 PCR 儀器（Biosystems 公司，瑞士）。
1.2 三維有限元模型建立及界面壓力分析
取 1 只人工頸椎間盤置換術后 1 周的山羊，采用 64 排螺旋 CT 行 C3、4 CT 掃描。掃描條件：層厚 1 mm，層距 0.33 mm，球管電壓 400 mA、120 kV。掃描后獲得的圖像以 DICOM 格式導入 Mimics10.0 軟件進行三維重建，建立山羊椎體模型。采用定義閾值方法區別不同組織，選取建模所需要組織。利用 Geomagic Studio8.0 軟件進行打磨、填孔及去噪，然后對模型進行切割、填充、變形等進一步處理，最終獲得符合建模要求的幾何模型。將建立的幾何模型導入 ABAQUS6.1 分析計算軟件中進行幾何清理，清除多余的點、線和面。將處理后的幾何模型生成實體，然后進行網格劃分，建立三維有限元模型。在有限元模型基礎上計算界面壓力分布，得出壓力分布云圖。將假體規格數據同上法導入 Mimics10.0 軟件和 Geomagic Studio8.0 軟件中繪制三維圖像，應用 ABAQUS6.1 分析計算軟件建立三維有限元模型。參考文獻[8-9]提出的楊氏彈性模量與泊松比確定椎間盤材料屬性。人工頸椎間盤假體上、下終板材料為鈦合金，楊氏彈性模量為 110 000 MPa，泊松比為 0.3；髓核為高分子聚乙烯，楊氏彈性模量為 800 MPa，泊松比均為 0.3。邊界條件設定主要模擬山羊頭顱質量在靜止狀態時對頸椎的軸向壓力，山羊 C4 椎體下表面各個節點保持固定，在 C3 椎體上表面施加 25 N 軸向壓縮載荷[10]，分析界面壓力分布范圍。
1.3 機械應力刺激對假體終板-骨界面骨組織結構的影響
于人工頸椎間盤假體置換術后 6、12 個月各取 6 只山羊，處死后取標本，對人工頸椎間盤假體、終板固定嵴和終板-骨界面周圍骨組織進行 Micro-CT 掃描并三維重建。采用骨分析軟件 Scanco 軟件進行假體終板-骨界面骨組織計量學分析。骨組織參數包括[11]：骨體積分數（bone volume fraction，BVF）、骨小梁數目（trabecular number，Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁間隙（trabecular separation，Tb.Sp）、骨密度（bone mineral density，BMD）、骨表面積體積比（bone surface/bone volume，BS/BV）、骨小梁模型因子（trabecular pattern factor，Tb.Pf）。按照 1.3 中建立的三維有限元模型，將假體終板根據壓力分布范圍分為 5 個壓力區，對各區進行以上骨計量學分析。
1.4 機械應力刺激對假體終板-骨界面組織相關基因的影響
1.4.1 標本制備及培養時間選擇 取 4 只正常山羊處死后，切取 C3 椎體下終板和 C4 椎體上終板標本。用直徑 2 mm 空心環鉆在終板上鉆孔，得到直徑 2 mm 的圓柱形骨塊，每個終板獲得 20 個標本。將制備的骨塊置于 DMEM，于 37℃、5%CO2 培養箱培養過夜。于取材后即刻以及培養 24、48 h 各取 4 個樣本（C3 下終板和 C4 上終板各 2 個）進行實時熒光定量PCR檢測。
具體步驟：取樣本采用試劑盒提取總 RNA，并逆轉錄為 cDNA，測量 NF-κB 受體活化因子配體（nuclear factor κB ligand，RANKL）、骨保護素（oste-oprotegerin，OPG）、巨噬細胞集落刺激因子（macro-phage colony-stimulating factor，M-CSF）、TGF-β 基因表達，以 GAPDH 作為內參。各基因引物序列見表 1。PCR 反應條件：50℃、2 min，95℃、10 min，50 個循環，延伸 15 s，60℃、1 min。采用 2–ΔΔCt 法計算目的基因相對表達量[12]。根據結果選擇合適培養時間的樣本進行下一步力學加載測試。
表1
實時熒光定量 PCR 引物序列
Table1.
Primer sequences for real time fluorescent quantitative PCR
1.4.2 力學加載測試 取合適培養時間的 C3 椎體下終板 37 個（C3 下終板組）、C4 椎體上終板 37 個（C4 上終板組），利用生物力學加載設備及圓形探頭對骨塊持續加載壓力，加載模擬人工椎間盤假體植入椎間隙后的壓力值，每個骨塊壓力加載持續 3 h。以三維有限元模型分析得出的終板-界面壓力分布最大值作為力學加載壓力值。力學加載刺激后，樣本立即置于含 1 mL 裂解液的試管內，每個試管內放置 1 個不銹鋼小珠，以 30 Hz 頻率振蕩 3 次，每次持續 30 s。同上法行實時熒光定量 PCR 檢測 RANKL、OPG、M-CSF、TGF-β 基因相對表達量，計算 OPG/RANKL 比值。以培養 24 h 未行力學加載的 C3 椎體下終板 37 個、C4 椎體上終板 37 個作為正常對照。
1.5 統計學方法
采用 SPSSv13.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用配對t 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 三維有限元模型建立及界面壓力分布特點
C3、4 節段三維有限元模型共 183 943 個單元、268 046 個結點。見圖 1。施加 25 N 軸向壓縮載荷后，在靜止狀態時人工頸椎間盤假體上、下終板承受最大壓力分別為 8.00、8.21 Pa。其中上終板壓力較大區域在終板中央偏后，下終板壓力較大區域在終板中部的前方及兩條固定軌道上。按照壓力值大小，將終板分為 5 個區域，以進一步觀察不同區域骨長入情況。見圖 2。
圖1
人工頸椎間盤置換術后山羊 C3、4 節段三維有限元模型a. 正面觀；b. 側面觀
Figure1.
The goat C3, 4 three dimensional finite element model after artificial cervical disc replacement a. Anterior view; b. Lateral view
圖2
人工頸椎間盤假體上、下終板 5 個壓力區
Figure2.
Five pressure areas of disc prosthesis upper and lower plates
2.2 機械應力刺激對假體終板-骨界面骨組織結構的影響
Micro-CT 掃描觀察示，假體植入后 6 個月，壓力較大區域骨小梁密度相對較大，部分骨小梁在假體固定軌道齒狀突起之間附著。與 6 個月時相比，12 個月時在對應壓力較大區域骨小梁密度更大，更多骨小梁長入假體涂層界面之間。見圖 3。
圖3
假體植入后 6、12 個月 Micro-CT 掃描冠狀面圖像 a. 6 個月；b. 12 個月
Figure3.
Coronal image of Micro-CT at 6 and 12 months after prosthesis replacement a. At 6 months; b. At 12 months
骨分析軟件測量人工椎間盤上、下終板不同壓力分布區域的骨計量學指標顯示，假體植入后 12 個月，上、下終板各區域 BMD、Tb.Th、BVF、Tb.N 均較 6 個月時增加，而 BS/BV、Tb.Sp、Tb.Pf 均降低，比較差異有統計學意義（P<0.05）。同一時間點，同一終板不同區域比較，隨著區域壓力增大，BVF、BMD、Tb.N 及 Tb.Th 增加，Tb.Sp、Tb.Pf 和 BS/BV 降低，比較差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
假體植入后上、下終板不同壓力區域骨計量分析 a. BVF；b. Tb.N；c. Tb.Th；d. Tb.Sp；e. BMD；f. BS/BV；g. Tb.Pf
Figure4.
Bone measurement analysis of upper and lower plates in different pressure areas a. BVF; b. Tb.N; c. Tb.Th; d. Tb.Sp; e. BMD; f. BS/BV; g. Tb.Pf
2.3 機械應力刺激對假體終板-骨界面組織相關基因影響
2.3.1 培養時間選擇 培養后 24、48 h RANKL、OPG 及 TGF-β 基因相對表達量與取材后即刻比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；培養后 24、48 h 以上基因相對表達量比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 2。故選擇培養 24 h 樣本進行力學加載測試。
表2
不同培養時間骨組織相關基因表達比較（
n=4，
）
Table2.
Comparison of bone related gene expressions at different culture time (
n=4，
)
2.3.2 力學加載后的基因表達測定 與對應正常對照組相比，C3 下終板組 RANKL、OPG 基因相對表達量以及 OPG/RANKL 上調，比較差異有統計學意義（P<0.05）；TGF-β 基因相對表達量上調，M-CSF 基因下調，但差異無統計學意義（P>0.05）。C4 上終板組 RANKL、OPG 基因相對表達量以及 OPG/RANKL 均上調，比較差異有統計學意義（P<0.05）；TGF-β 基因相對表達量上調，M-CSF 基因無明顯改變，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 5。
圖5
正常及壓力加載后上、下終板骨組織相關基因表達變化
Figure5.
The related gene expression changes of upper and lower end-plates under normal and load condition
3 討論
3.1 不同椎間盤界面壓力分布特點及壓力范圍比較
目前，雖然有多種人工椎間盤假體應用于臨床，但是關于不同假體終板界面壓力分布特點的研究較少，而壓力對于局部骨界面的骨整合具有重要影響。一定范圍內的壓力可能促進局部骨代謝，但壓力過大可能導致骨吸收，嚴重影響假體遠期穩定性。有學者對 Bryan、Prestige-LP 和 PreDisc-C 假體植入 C5、6 椎間隙后，C6 上終板壓力分布特點進行分析，發現 Bryan 假體壓力主要分布在終板中央區域，且壓力較小；Prestige-LP 假體壓力主要集中在兩條固定軌道和終板后方，PreDisc-C 假體集中于中央軌道，且后兩種假體壓力較 Bryan 假體明顯增大[8]。此外，Prestige-LP 假體應力主要集中在終板后側，即使在前屈狀態下，終板后側壓力仍最大，他們認為這可能與該假體運動中心在終板后側有關[8]。本研究發現，國產人工頸椎間盤假體上終板壓力較大區域在終板中央偏后，最大壓力為 8.00 Pa；假體下終板壓力較大區域在終板中部的前方及兩條固定軌道上，最大壓力為 8.21 Pa；分析結果與 Prestige-LP 假體相似。Bryan 假體界面壓力較小可能與終板設計無固定軌道、髓核為聚氨酯材料有關，而 Prestige-LP 和 PreDisc-C 假體高壓力分布與髓核硬度更大有關。本研究采用國產人工頸椎間盤假體，下終板應力分布主要在中央區域，同時壓力比 Bryan 假體大，比 Prestige-LP 和 PreDisc-C 假體小，這可能與髓核材料（高分子聚乙烯）的應力分散作用和髓核位置有關。
3.2 壓力對成骨細胞和破骨細胞增殖的影響
骨是一種獨特的材料，它具有與其所受載荷相適應的質量和結構[13-14]。載荷誘導的骨牽拉作用以及骨構建與重塑狀態，均受應力大小、應變頻率及應變速率的影響[11,15]。研究表明，骨量保持可有兩種方式：一種方式是高應變低加載周期，例如以 2 000 微應變應力給予 1 d 4 次循環加載[16]；另一種方式是低應變高加載周期，例如以 400 微應變應力給予 1 d 10 000 次循環加載[17]。此外，還有實驗證實應變與應變速率的增加可能影響成骨細胞的增殖[18]。
1995 年 Suda 等提出一個未知信號分子對破骨細胞的形成至關重要[19]。該分子通過成骨細胞或基質細胞的配體和受體介導促進破骨細胞分化[20]。之后，破骨細胞分化因子經研究證實并命名為 RANKL，是人破骨細胞形成不可或缺的信號分子[21-23]。同時，RANKL 也是后期破骨細胞分化成熟的關鍵調節因子，其在機械刺激和激素作用后通過成骨細胞表達[24]。RANKL 在一些骨病理狀態下高表達，例如類風濕性關節炎和牙周炎[25-26]。在這些疾病中，當細胞被激活后，外周血 T 細胞產生大量 RANKL[27]，然而在假體周圍骨溶解區域T細胞含量很少，不會成為 RNAKL 的主要來源。此外，在類風濕關節炎病理狀態下，成纖維細胞被證實是 RNAKL 的主要來源[28]，這可能是成纖維組織在假體周圍形成并刺激破骨細胞增殖的主要原因。
OPG 由成骨細胞分泌，是 RANKL 的反意受體，在體內外對破骨細胞的生成具有強烈抑制作用[29]。本研究結果提示持續壓力可以增加 OPG 表達，這表明在人工頸椎間盤假體植入體內后，在壓力作用下，假體周圍成骨細胞數量和活性增加。我們也觀察到加載壓力后，RANKL 表達水平隨 OPG 上升而增加，同時 OPG 可與 RANK 競爭 RANKL 受體，所以 OPG 表達變化調節 RANKL 表達水平，影響破骨細胞的生成。研究表明，骨重塑率可能由 RANKL 與 OPG 的比值決定[30]。本研究加載壓力后終板 OPG 與 RANKL 的表達趨勢雖然一致，但是 OPG/RANKL 比值較正常對照明顯上調（P<0.05），表明假體終板-骨界面的骨轉化率增加。假體植入后早期，界面壓力可以促進局部骨整合的進程，延緩假體接觸界面的骨吸收，防止出現假體下沉和松動。
破骨細胞和成骨細胞活性在體內關聯十分緊密，破骨細胞活性增加可能引起成骨細胞反應。與此類似，壓力加載也可能影響成骨細胞的增殖。因此，本研究也分析了促進骨生成的信號分子 TGF-β 表達水平變化。TGF-β 通過成骨細胞表達，對成骨細胞和破骨細胞的影響截然相反。在骨細胞分化早期，TGF-β 通過成骨細胞趨化作用和促進成骨細胞增殖能力兩方面促進骨形成[31]。本研究觀察發現，在壓力刺激后終板 TGF-β 表達上調，表明壓力刺激對成骨細胞的增殖有影響。此外，一些研究也發現 TGF-β 可以通過增加 RANKL 的敏感性來促進破骨細胞的形成[32-33]，也可以通過下調 RANKL 與 OPG 的比值來抑制破骨細胞生成[33]。本研究中 OPG/RANKL 上調，同時 TGF-β 表達上調，與上述變化趨勢一致。表明壓力可以引起表達成骨細胞、破骨細胞相關基因水平的變化，對假體周圍骨整合有重要作用。
綜上述，壓力在一定范圍內可以促進人工頸椎間盤假體終板-骨界面骨整合，增強假體穩定性，在界面壓力作用下，表達成骨細胞增殖的基因含量增加，提示國產人工頸椎間盤具有良好的骨整合效果。但本研究存在以下不足：僅選擇了最大壓力值進行力學加載實驗，未明確壓力對于成骨細胞、破骨細胞作用的臨界值；且僅通過體外模擬力學加載觀察骨細胞增殖情況，不能完全符合體內環境，因此該椎間盤假體植入體內后的穩定性有待進一步研究明確。
近年來，人工頸椎間盤置換手術取得了較好的近期療效[1-2]。但是人工頸椎間盤為終生使用，植入體內后如何獲得長期穩定，避免下沉、移位、脫落等并發癥發生，尚缺乏系統研究。目前各種假體終板-骨界面設計可以提供植入后的即刻穩定性，但后期穩定性則依靠骨長入來實現。骨長入這一過程受到很多因素的影響，如壓力、微動、力學環境等[3-4]。因此，深入研究假體終板-骨界面愈合機制，設計更符合生理結構的人工頸椎間盤假體至關重要[5]。大量研究已證明，壓力對于局部假體終板-骨界面的骨整合有重要影響[6-7]。因此，本實驗通過分析假體植入后終板-骨界面的壓力分布，根據壓力分布特點分析不同壓力區域骨計量學指標，觀察壓力對骨整合的影響；同時分析壓力作用后促進成骨細胞分化增殖信號分子表達水平的變化，觀察假體植入后分子層面骨整合的結果。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
成年雄性山羊 17 只，體質量 20～30 kg，由四川大學動物實驗中心提供。其中 13 只山羊采用國產人工頸椎間盤假體（規格：5 mm×12 mm、5 mm×14 mm；常熟創生醫療器械有限公司）行 C3、4 椎間盤置換術。
DMEM、FBS（Sigma 公司，美國）；1%PSF、去離子蒸餾水（GIBCO 公司，美國）；三氯甲烷、冰異丙醇（Sigma-Aldrich 公司，瑞士）；PCR 引物（Intergen Discovery Products 公司，美國）；質粒小量抽提試劑盒（Macherey-Nagel 公司，德國）；RNA 提取試劑（Invitrogen AG 公司，瑞士）；逆轉錄酶、RNA 酶抑制劑、隨機化六聚引物（Invitrogen 公司，美國）。
Mimics10.0 軟件（Maeterialise 公司，比利時）；Geomagic Studio8.0 軟件（Raindrop 公司，美國）；ABAQUS6.1 分析計算軟件（ABAQUS 公司，美國）；骨分析軟件 Scanco 軟件（Wolfram Research 公司，美國）；64 排螺旋 CT（Siemens 公司，德國）；Micro-CT、不銹鋼小珠（GmbH 公司，德國）； PCR 擴增儀（Roche 公司，瑞士）；多功能分光光度計（Eppendorf 公司，德國）；熒光定量 PCR 儀器（Biosystems 公司，瑞士）。
1.2 三維有限元模型建立及界面壓力分析
取 1 只人工頸椎間盤置換術后 1 周的山羊，采用 64 排螺旋 CT 行 C3、4 CT 掃描。掃描條件：層厚 1 mm，層距 0.33 mm，球管電壓 400 mA、120 kV。掃描后獲得的圖像以 DICOM 格式導入 Mimics10.0 軟件進行三維重建，建立山羊椎體模型。采用定義閾值方法區別不同組織，選取建模所需要組織。利用 Geomagic Studio8.0 軟件進行打磨、填孔及去噪，然后對模型進行切割、填充、變形等進一步處理，最終獲得符合建模要求的幾何模型。將建立的幾何模型導入 ABAQUS6.1 分析計算軟件中進行幾何清理，清除多余的點、線和面。將處理后的幾何模型生成實體，然后進行網格劃分，建立三維有限元模型。在有限元模型基礎上計算界面壓力分布，得出壓力分布云圖。將假體規格數據同上法導入 Mimics10.0 軟件和 Geomagic Studio8.0 軟件中繪制三維圖像，應用 ABAQUS6.1 分析計算軟件建立三維有限元模型。參考文獻[8-9]提出的楊氏彈性模量與泊松比確定椎間盤材料屬性。人工頸椎間盤假體上、下終板材料為鈦合金，楊氏彈性模量為 110 000 MPa，泊松比為 0.3；髓核為高分子聚乙烯，楊氏彈性模量為 800 MPa，泊松比均為 0.3。邊界條件設定主要模擬山羊頭顱質量在靜止狀態時對頸椎的軸向壓力，山羊 C4 椎體下表面各個節點保持固定，在 C3 椎體上表面施加 25 N 軸向壓縮載荷[10]，分析界面壓力分布范圍。
1.3 機械應力刺激對假體終板-骨界面骨組織結構的影響
于人工頸椎間盤假體置換術后 6、12 個月各取 6 只山羊，處死后取標本，對人工頸椎間盤假體、終板固定嵴和終板-骨界面周圍骨組織進行 Micro-CT 掃描并三維重建。采用骨分析軟件 Scanco 軟件進行假體終板-骨界面骨組織計量學分析。骨組織參數包括[11]：骨體積分數（bone volume fraction，BVF）、骨小梁數目（trabecular number，Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁間隙（trabecular separation，Tb.Sp）、骨密度（bone mineral density，BMD）、骨表面積體積比（bone surface/bone volume，BS/BV）、骨小梁模型因子（trabecular pattern factor，Tb.Pf）。按照 1.3 中建立的三維有限元模型，將假體終板根據壓力分布范圍分為 5 個壓力區，對各區進行以上骨計量學分析。
1.4 機械應力刺激對假體終板-骨界面組織相關基因的影響
1.4.1 標本制備及培養時間選擇 取 4 只正常山羊處死后，切取 C3 椎體下終板和 C4 椎體上終板標本。用直徑 2 mm 空心環鉆在終板上鉆孔，得到直徑 2 mm 的圓柱形骨塊，每個終板獲得 20 個標本。將制備的骨塊置于 DMEM，于 37℃、5%CO2 培養箱培養過夜。于取材后即刻以及培養 24、48 h 各取 4 個樣本（C3 下終板和 C4 上終板各 2 個）進行實時熒光定量PCR檢測。
具體步驟：取樣本采用試劑盒提取總 RNA，并逆轉錄為 cDNA，測量 NF-κB 受體活化因子配體（nuclear factor κB ligand，RANKL）、骨保護素（oste-oprotegerin，OPG）、巨噬細胞集落刺激因子（macro-phage colony-stimulating factor，M-CSF）、TGF-β 基因表達，以 GAPDH 作為內參。各基因引物序列見表 1。PCR 反應條件：50℃、2 min，95℃、10 min，50 個循環，延伸 15 s，60℃、1 min。采用 2–ΔΔCt 法計算目的基因相對表達量[12]。根據結果選擇合適培養時間的樣本進行下一步力學加載測試。
表1
實時熒光定量 PCR 引物序列
Table1.
Primer sequences for real time fluorescent quantitative PCR
1.4.2 力學加載測試 取合適培養時間的 C3 椎體下終板 37 個（C3 下終板組）、C4 椎體上終板 37 個（C4 上終板組），利用生物力學加載設備及圓形探頭對骨塊持續加載壓力，加載模擬人工椎間盤假體植入椎間隙后的壓力值，每個骨塊壓力加載持續 3 h。以三維有限元模型分析得出的終板-界面壓力分布最大值作為力學加載壓力值。力學加載刺激后，樣本立即置于含 1 mL 裂解液的試管內，每個試管內放置 1 個不銹鋼小珠，以 30 Hz 頻率振蕩 3 次，每次持續 30 s。同上法行實時熒光定量 PCR 檢測 RANKL、OPG、M-CSF、TGF-β 基因相對表達量，計算 OPG/RANKL 比值。以培養 24 h 未行力學加載的 C3 椎體下終板 37 個、C4 椎體上終板 37 個作為正常對照。
1.5 統計學方法
采用 SPSSv13.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用配對t 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 三維有限元模型建立及界面壓力分布特點
C3、4 節段三維有限元模型共 183 943 個單元、268 046 個結點。見圖 1。施加 25 N 軸向壓縮載荷后，在靜止狀態時人工頸椎間盤假體上、下終板承受最大壓力分別為 8.00、8.21 Pa。其中上終板壓力較大區域在終板中央偏后，下終板壓力較大區域在終板中部的前方及兩條固定軌道上。按照壓力值大小，將終板分為 5 個區域，以進一步觀察不同區域骨長入情況。見圖 2。
圖1
人工頸椎間盤置換術后山羊 C3、4 節段三維有限元模型a. 正面觀；b. 側面觀
Figure1.
The goat C3, 4 three dimensional finite element model after artificial cervical disc replacement a. Anterior view; b. Lateral view
圖2
人工頸椎間盤假體上、下終板 5 個壓力區
Figure2.
Five pressure areas of disc prosthesis upper and lower plates
2.2 機械應力刺激對假體終板-骨界面骨組織結構的影響
Micro-CT 掃描觀察示，假體植入后 6 個月，壓力較大區域骨小梁密度相對較大，部分骨小梁在假體固定軌道齒狀突起之間附著。與 6 個月時相比，12 個月時在對應壓力較大區域骨小梁密度更大，更多骨小梁長入假體涂層界面之間。見圖 3。
圖3
假體植入后 6、12 個月 Micro-CT 掃描冠狀面圖像 a. 6 個月；b. 12 個月
Figure3.
Coronal image of Micro-CT at 6 and 12 months after prosthesis replacement a. At 6 months; b. At 12 months
骨分析軟件測量人工椎間盤上、下終板不同壓力分布區域的骨計量學指標顯示，假體植入后 12 個月，上、下終板各區域 BMD、Tb.Th、BVF、Tb.N 均較 6 個月時增加，而 BS/BV、Tb.Sp、Tb.Pf 均降低，比較差異有統計學意義（P<0.05）。同一時間點，同一終板不同區域比較，隨著區域壓力增大，BVF、BMD、Tb.N 及 Tb.Th 增加，Tb.Sp、Tb.Pf 和 BS/BV 降低，比較差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
假體植入后上、下終板不同壓力區域骨計量分析 a. BVF；b. Tb.N；c. Tb.Th；d. Tb.Sp；e. BMD；f. BS/BV；g. Tb.Pf
Figure4.
Bone measurement analysis of upper and lower plates in different pressure areas a. BVF; b. Tb.N; c. Tb.Th; d. Tb.Sp; e. BMD; f. BS/BV; g. Tb.Pf
2.3 機械應力刺激對假體終板-骨界面組織相關基因影響
2.3.1 培養時間選擇 培養后 24、48 h RANKL、OPG 及 TGF-β 基因相對表達量與取材后即刻比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；培養后 24、48 h 以上基因相對表達量比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 2。故選擇培養 24 h 樣本進行力學加載測試。
表2
不同培養時間骨組織相關基因表達比較（
n=4，
）
Table2.
Comparison of bone related gene expressions at different culture time (
n=4，
)
2.3.2 力學加載后的基因表達測定 與對應正常對照組相比，C3 下終板組 RANKL、OPG 基因相對表達量以及 OPG/RANKL 上調，比較差異有統計學意義（P<0.05）；TGF-β 基因相對表達量上調，M-CSF 基因下調，但差異無統計學意義（P>0.05）。C4 上終板組 RANKL、OPG 基因相對表達量以及 OPG/RANKL 均上調，比較差異有統計學意義（P<0.05）；TGF-β 基因相對表達量上調，M-CSF 基因無明顯改變，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 5。
圖5
正常及壓力加載后上、下終板骨組織相關基因表達變化
Figure5.
The related gene expression changes of upper and lower end-plates under normal and load condition
3 討論
3.1 不同椎間盤界面壓力分布特點及壓力范圍比較
目前，雖然有多種人工椎間盤假體應用于臨床，但是關于不同假體終板界面壓力分布特點的研究較少，而壓力對于局部骨界面的骨整合具有重要影響。一定范圍內的壓力可能促進局部骨代謝，但壓力過大可能導致骨吸收，嚴重影響假體遠期穩定性。有學者對 Bryan、Prestige-LP 和 PreDisc-C 假體植入 C5、6 椎間隙后，C6 上終板壓力分布特點進行分析，發現 Bryan 假體壓力主要分布在終板中央區域，且壓力較小；Prestige-LP 假體壓力主要集中在兩條固定軌道和終板后方，PreDisc-C 假體集中于中央軌道，且后兩種假體壓力較 Bryan 假體明顯增大[8]。此外，Prestige-LP 假體應力主要集中在終板后側，即使在前屈狀態下，終板后側壓力仍最大，他們認為這可能與該假體運動中心在終板后側有關[8]。本研究發現，國產人工頸椎間盤假體上終板壓力較大區域在終板中央偏后，最大壓力為 8.00 Pa；假體下終板壓力較大區域在終板中部的前方及兩條固定軌道上，最大壓力為 8.21 Pa；分析結果與 Prestige-LP 假體相似。Bryan 假體界面壓力較小可能與終板設計無固定軌道、髓核為聚氨酯材料有關，而 Prestige-LP 和 PreDisc-C 假體高壓力分布與髓核硬度更大有關。本研究采用國產人工頸椎間盤假體，下終板應力分布主要在中央區域，同時壓力比 Bryan 假體大，比 Prestige-LP 和 PreDisc-C 假體小，這可能與髓核材料（高分子聚乙烯）的應力分散作用和髓核位置有關。
3.2 壓力對成骨細胞和破骨細胞增殖的影響
骨是一種獨特的材料，它具有與其所受載荷相適應的質量和結構[13-14]。載荷誘導的骨牽拉作用以及骨構建與重塑狀態，均受應力大小、應變頻率及應變速率的影響[11,15]。研究表明，骨量保持可有兩種方式：一種方式是高應變低加載周期，例如以 2 000 微應變應力給予 1 d 4 次循環加載[16]；另一種方式是低應變高加載周期，例如以 400 微應變應力給予 1 d 10 000 次循環加載[17]。此外，還有實驗證實應變與應變速率的增加可能影響成骨細胞的增殖[18]。
1995 年 Suda 等提出一個未知信號分子對破骨細胞的形成至關重要[19]。該分子通過成骨細胞或基質細胞的配體和受體介導促進破骨細胞分化[20]。之后，破骨細胞分化因子經研究證實并命名為 RANKL，是人破骨細胞形成不可或缺的信號分子[21-23]。同時，RANKL 也是后期破骨細胞分化成熟的關鍵調節因子，其在機械刺激和激素作用后通過成骨細胞表達[24]。RANKL 在一些骨病理狀態下高表達，例如類風濕性關節炎和牙周炎[25-26]。在這些疾病中，當細胞被激活后，外周血 T 細胞產生大量 RANKL[27]，然而在假體周圍骨溶解區域T細胞含量很少，不會成為 RNAKL 的主要來源。此外，在類風濕關節炎病理狀態下，成纖維細胞被證實是 RNAKL 的主要來源[28]，這可能是成纖維組織在假體周圍形成并刺激破骨細胞增殖的主要原因。
OPG 由成骨細胞分泌，是 RANKL 的反意受體，在體內外對破骨細胞的生成具有強烈抑制作用[29]。本研究結果提示持續壓力可以增加 OPG 表達，這表明在人工頸椎間盤假體植入體內后，在壓力作用下，假體周圍成骨細胞數量和活性增加。我們也觀察到加載壓力后，RANKL 表達水平隨 OPG 上升而增加，同時 OPG 可與 RANK 競爭 RANKL 受體，所以 OPG 表達變化調節 RANKL 表達水平，影響破骨細胞的生成。研究表明，骨重塑率可能由 RANKL 與 OPG 的比值決定[30]。本研究加載壓力后終板 OPG 與 RANKL 的表達趨勢雖然一致，但是 OPG/RANKL 比值較正常對照明顯上調（P<0.05），表明假體終板-骨界面的骨轉化率增加。假體植入后早期，界面壓力可以促進局部骨整合的進程，延緩假體接觸界面的骨吸收，防止出現假體下沉和松動。
破骨細胞和成骨細胞活性在體內關聯十分緊密，破骨細胞活性增加可能引起成骨細胞反應。與此類似，壓力加載也可能影響成骨細胞的增殖。因此，本研究也分析了促進骨生成的信號分子 TGF-β 表達水平變化。TGF-β 通過成骨細胞表達，對成骨細胞和破骨細胞的影響截然相反。在骨細胞分化早期，TGF-β 通過成骨細胞趨化作用和促進成骨細胞增殖能力兩方面促進骨形成[31]。本研究觀察發現，在壓力刺激后終板 TGF-β 表達上調，表明壓力刺激對成骨細胞的增殖有影響。此外，一些研究也發現 TGF-β 可以通過增加 RANKL 的敏感性來促進破骨細胞的形成[32-33]，也可以通過下調 RANKL 與 OPG 的比值來抑制破骨細胞生成[33]。本研究中 OPG/RANKL 上調，同時 TGF-β 表達上調，與上述變化趨勢一致。表明壓力可以引起表達成骨細胞、破骨細胞相關基因水平的變化，對假體周圍骨整合有重要作用。
綜上述，壓力在一定范圍內可以促進人工頸椎間盤假體終板-骨界面骨整合，增強假體穩定性，在界面壓力作用下，表達成骨細胞增殖的基因含量增加，提示國產人工頸椎間盤具有良好的骨整合效果。但本研究存在以下不足：僅選擇了最大壓力值進行力學加載實驗，未明確壓力對于成骨細胞、破骨細胞作用的臨界值；且僅通過體外模擬力學加載觀察骨細胞增殖情況，不能完全符合體內環境，因此該椎間盤假體植入體內后的穩定性有待進一步研究明確。
