引用本文： 胡珍珍, 陳彬, 李陽, 姜衛, 文麗紅, 姬付康, 楊曉, 王晉煌, 柳大烈. 曲尼司特對小鼠燒傷后創面愈合的影響及給藥時間研究. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(4): 465-472. doi: 10.7507/1002-1892.201611033 復制
增生性瘢痕是傷口異常愈合導致膠原合成及沉積增加的一種纖維化疾病，是燒傷和創傷后常見并發癥，常伴有疼痛、瘙癢以及關節活動受限[1-2]，嚴重時甚至會影響患者生活質量[3]。曲尼司特作為一種 H1 受體阻滯劑，能有效預防和治療部分纖維化疾病，其中包括增生性瘢痕，因此也被認為是一種新型的抗瘢痕藥物，我們前期臨床研究也得到了相似結果[4]。本研究以深Ⅱ度燒傷小鼠創面作為觀測對象，通過不同時間點進行曲尼司特干預，分析其抑制瘢痕增生的作用機制，以及其抑制瘢痕增生的效果是否與給藥時間有關，也為曲尼司特用于臨床治療瘢痕類疾病奠定理論基礎。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
7～8 周齡清潔級雄性昆明小鼠 66 只，體質量 18～22 g，由南方醫科大學動物實驗中心提供，實驗前適應性喂養 5 d。
曲尼司特膠囊（中國藥科大學制藥有限公司）；兔抗鼠 Ⅰ、Ⅲ型膠原一抗（Abcam 公司，美國）；小鼠 TGF-β1 ELISA 試劑盒（R&D 公司，美國）；小鼠組胺 ELISA 試劑盒（Cayman 公司，美國）。DP70 型光學顯微鏡（Olympus 公司，日本）；H-7000FA 型透射電鏡（Hitachi 公司，日本）。
1.2 實驗方法
1.2.1 動物模型制備 66 只小鼠腹腔注射 10% 水合氯醛（400 mg/kg）麻醉后，剃毛器剔除背部毛發，面積約 2 cm×2 cm。24 h 后小鼠同上法再次麻醉后，固定于燙傷板，將其背部剃毛區域置于 100℃ 水中持續 8 s，制成燒傷面積約 1 cm×1 cm 的深Ⅱ度燒傷模型。模型建立后，每只小鼠腹腔注射乳酸林格液 0.5 mL 抗休克。模型制備后背部創面暴露，不給予外用藥物，分籠喂養，自由進食水。
1.2.2 實驗分組及方法 模型制備后，將 66 只小鼠隨機分為 4 組，分別為對照組（n=18）、早期干預組（n=18）、中期干預組（n=18）和晚期干預組（n=12）。早、中、晚期干預組分別于模型制備后當天、7 d、14 d 開始進行曲尼司特 200 mg/（kg·d）[5]灌胃，對照組于模型制備后當天開始等體積生理鹽水灌胃。對照組及早、中期干預組分別于模型制備后 14、28、42 d，晚期干預組于 28、42 d，隨機選取 6 只小鼠處死后觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察 肉眼觀察各組小鼠創面愈合情況，有無滲血、水腫、感染發生，以及創面開始結痂、脫痂時間；以創面痂殼脫落作為創面愈合標準，記錄創面愈合時間。
1.3.2 組織學及免疫組織化學染色觀察 各時間點取創面新生組織，經甲醛固定、漂洗、脫水等處理后切片。首先，取部分切片常規行 HE 染色，于高倍顯微鏡下觀察創面組織結構，確定標本取自于創面愈合組織，以提高實驗檢測結果準確性。然后，取剩余切片常規行甲苯胺藍、Masson 染色及Ⅰ、Ⅲ型膠原免疫組織化學染色。甲苯胺藍染色切片觀察肥大細胞形態，每張切片取 5 個視野，于 400 倍鏡下人工計數肥大細胞；Masson 染色切片觀察總膠原情況；免疫組織化學染色觀察Ⅰ、Ⅲ型膠原表達情況。取 Masson 染色及免疫組織化學染色切片，于 400 倍鏡下每張切片取 5 個視野拍照，采用 Image Pro Plus 6.0 圖像分析系統測量吸光度（A）值，作為總膠原、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白表達水平的半定量參數，并計算Ⅰ/Ⅲ型膠原含量比值。
1.3.3 ELISA 檢測組胺及 TGF-β1 含量 ① 參照小鼠組胺 ELISA 試劑盒說明書步驟進行操作，使用多克隆抗組胺抗體檢測各樣本 450 nm 波長處A 值，并以組胺標準品系列濃度為 x 軸，對應的 450 nm 波長A 值為 y 軸，在 CurveExpert1.4 軟件中選擇擬合度最好的標準曲線方程計算各樣品中組胺濃度。② 參照小鼠 TG-β1 ELISA 試劑盒說明書步驟進行操作，取上清液采用酶標儀測量 492 nm 波長處A 值，通過標準曲線查得相應 TGF-β1 含量。
1.3.4 透射電鏡觀察 取術后 28 d 創面新生組織經 3% 戊二醛固定，1% 四氧化鋨再固定，丙酮逐級脫水，Epon812 包埋，半薄切片光學定位，超薄切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察成纖維細胞的超微結構。
1.4 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用 LSD 法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
各組創面愈合大體觀察情況相似。第 2 天開始創面滲出物形成褐色痂殼覆蓋創面，第 3 天創面開始攣縮，第 7 天出現上皮爬行，創面痂殼干燥，并隨時間延長從四周向中心逐漸脫落，約 11 d 后痂殼全部脫落，創面基本愈合。見圖 1。
圖1
各組造模后 14 d 創面愈合大體觀察 a. 對照組；b. 早期干預組；c. 中期干預組；d. 晚期干預組
Figure1.
The general observation of the wound healing in each group at 14 days after modeling a. Control group; b. Early intervention group; c. Medium intervention group; d. Late intervention group
對照組以及早、中、晚期干預組創面愈合時間分別為（10.7±0.7）、（11.2±0.8）、（11.0±0.6）、（10.5±0.4）d，組間比較差異無統計學意義（F=1.105，P=0.371）。
2.2 組織學及免疫組織化學染色觀察
2.2.1 甲苯胺藍染色 鏡下觀察示，肥大細胞細胞質呈紫紅色，細胞核呈藍色，散在于真皮組織及瘢痕組織中，細胞呈圓形、橢圓形或不規則形，部分細胞顏色變淺，呈脫顆粒現象。各組 14 d 時肥大細胞較少，28 d 最多且脫顆粒明顯，42 d 肥大細胞逐漸減少且以脫顆粒狀態為主（圖 2）。各時間點對照組肥大細胞最多，晚期干預組次之，之后分別為中期干預組、早期干預組。除 42 d 時對照組肥大細胞數與晚期干預組比較差異無統計學意義（P>0.05）外，其余各時間點各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
圖2
各組造模后 28 d 創面甲苯胺藍染色觀察（×400） 紅箭頭示靜止狀態下細胞膜完整的肥大細胞，黑箭頭示活躍狀態下脫顆粒的肥大細胞 a. 對照組；b. 早期干預組；c. 中期干預組；d. 晚期干預組
Figure2.
The toluidine blue staining observation of wound in each group at 28 days after modeling (×400) Red arrow indicated static mast cells with intact cell membrane, black arrow indicated active mast cells under degranulation a. Control group; b. Early intervention group; c. Medium intervention group; d. Late intervention group
表1
各時間點各組肥大細胞計數比較（
n=6，個/mm2，
）
Table1.
Comparison of the mast cells number between groups at each time point (
n=6, cells/mm2,
)
2.2.2 Masson染色及免疫組織化學染色觀測 各時間點對照組總膠原含量最高，其次為晚期干預組，之后為中期干預組、早期干預組。除對照組與晚期干預組比較總膠原含量差異無統計學意義外（P>0.05），其余各時間點各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。對照組與晚期干預組以Ⅰ型膠原為主，而早期干預組和中期干預組以Ⅲ型膠原為主。各時間點，對照組Ⅰ/Ⅲ型膠原含量比值最高，其次為晚期干預組，之后為中期干預組、早期干預組，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 3～5 及表 2。
圖3
各組造模后 42 d 創面 Masson 染色觀察（×400） a. 對照組；b. 早期干預組；c. 中期干預組；d. 晚期干預組
Figure3.
Masson staining observation of wound in each group at 42 days after modeling (×400) a. Control group; b. Early intervention group; c. Medium intervention group; d. Late intervention group
圖4
各組造模后 42 d 創面Ⅰ型膠原免疫組織化學染色觀察（×400） a. 對照組；b. 早期干預組；c. 中期干預組；d. 晚期干預組
Figure4.
The collagen type I immunohistochemical staining observation in each group at 42 days after modeling (×400) a. Control group; b. Early intervention group; c. Medium intervention group; d. Late intervention group
圖5
各組造模后 42 d 創面Ⅲ型膠原免疫組織化學染色觀察（×400） a. 對照組；b. 早期干預組；c. 中期干預組；d. 晚期干預組
Figure5.
The collagen type III immunohistochemical staining observation in each group at 42 days after modeling (×400) a. Control group; b. Early intervention group; c. Medium intervention group; d. Late intervention group
表2
各時間點各組總膠原含量及Ⅰ/Ⅲ型膠原含量比值比較（
n=6，
）
Table2.
Comparison of collagen content and the I/III collagen ratio at each time point (
n=6,
)
2.3 ELISA 檢測
2.3.1 組胺含量 各組 28 d 時創面新生組織中組胺含量最高。各時間點對照組組胺含量最高，其次為晚期干預組，之后分別為中期干預組、早期干預組。除 42 d 對照組與晚期干預組比較差異無統計學意義（P>0.05）外，其余各時間點各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 3。
表3
各時間點各組組胺以及 TGF-β1 含量比較（
n=6，
）
Table3.
Comparison of the histamine content and the TGF-β1 content at each time point (
n=6,
)
2.3.2 TGF-β1 含量 隨時間延長，各組創面新生組織中 TGF-β1 含量呈逐漸下降趨勢。各時間點對照組 TGF-β1 含量最高，其次為晚期干預組，之后分別為中期干預組、早期干預組。各時間點各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 3。
2.4 透射電鏡觀察
對照組：成纖維細胞細胞核內染色質分布均勻，核大、呈長梭形，核仁明顯，細胞質內有豐富的粗面內質網，結構清晰，細胞周圍可見豐富細密排列不規則的膠原纖維。早、中期干預組：與對照組相比，成纖維細胞結構明顯改變，核內染色質分布不均勻，細胞質內粗面內質網不發達或擴張，呈功能異常表現，細胞周圍膠原纖維排列疏松、規則，且早期干預組細胞膜已消失，核仁固縮。晚期干預組：成纖維細胞結構與對照組相近，內質網發達，細胞結構清晰，核仁明顯，但細胞周圍膠原纖維的排列明顯較對照組疏松、有規則，且與早期干預組和中期干預組相比纖維更粗。見圖 6。
圖6
透射電鏡觀察造模后 28 d 各組成纖維細胞超微結構（×15 k） a. 對照組；b. 早期干預組；c. 中期干預組；d. 晚期干預組
Figure6.
The ultrastructure of fibroblasts under transmission electron microscope at 28 days after modeling (×15 k) a. Control group; b. Early intervention group; c. Medium intervention group; d. Late intervention group
3 討論
研究表明，瘢痕是由于創面愈合過程中炎性反應過度、膠原沉積過量以及傷口收縮劇烈所致[6-8]。傷口愈合過程是一個連續而又重疊的動態過程，傳統分為3個時期，分別為炎性反應期、纖維組織增殖期和瘢痕組織重塑期。創面形成初始進入炎性反應階段，此時成纖維細胞遷移進入傷口并產生膠原，協助新生的肉芽組織取代血栓形成；進入纖維組織增殖期后，真皮組織中的成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，促使傷口收縮，減小創面面積，促使傷口表皮化完成；最后交叉編織排列的成熟膠原纖維代替平行排列的不成熟膠原纖維，使傷口更牢固，完成最后的修復重塑過程。肌成纖維細胞及膠原含量過高導致肉芽組織生長過量，表明瘢痕愈合過程中炎性反應期延長及表皮化延遲，而重塑階段若未正常進行，則會導致非成熟膠原纖維異常增多[9]。
TGF-β1 是細胞因子家族成員之一，主要通過T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞以及骨髓中的血小板和前體細胞分泌，并參與一系列生物過程的調節，對傷口愈合及瘢痕增生均有重要作用[10]。TGF-β1 被認為是引起瘢痕增生的最重要細胞因子，在皮膚傷口愈合過程中 TGF-β1 增加會導致瘢痕增生，其促瘢痕增生的作用主要通過 3 個途徑實現[10-11]：其一，通過刺激成纖維細胞增殖來促進膠原蛋白大量合成；其二，誘導成纖維細胞分化為肌成纖維細胞；其三，促進細胞外基質蛋白的異常沉積。與正常皮膚組織相比，瘢痕組織中膠原含量明顯增加，且以排列紊亂的Ⅰ型膠原為主，瘢痕中Ⅰ型膠原越多，質地越硬[5]。TGF-β1 不能直接促進膠原降解，但是可調整Ⅰ/Ⅲ型膠原比例，所以直接抑制 TGF-β1 的活性，可調整瘢痕中Ⅰ/Ⅲ型膠原比例而不會減少總膠原含量。有研究表明，抑制 TGF-β1 的生物學活性可能調整瘢痕組織的纖維化紊亂，且動物實驗已證實，局部外用 TGF-β1 抑制劑可促使瘢痕成熟并改變瘢痕的組織學特征[12]。
肥大細胞是固有的炎性反應細胞，當皮膚受損傷時能迅速活化以參與機體的各種免疫反應，其活性主要通過脫顆粒反應實現[13]。肥大細胞是炎性反應的重要細胞，且炎性反應與瘢痕增生有密切關系，瘢痕愈合的傷口中肥大細胞數及脫顆粒率顯著升高，而無瘢痕愈合的傷口則相反[14]。肥大細胞促進瘢痕增生主要是通過貯存、釋放組胺等活性物質，刺激微血管內皮細胞增殖活化形成大量微血管來促進成纖維細胞增殖，動物模型已證實，阻止肥大細胞脫顆粒或中和肥大細胞介質的釋放能有效抑制瘢痕增生[13,15]。組胺通常以非活化的形式存在于肥大細胞和嗜堿性粒細胞中，當機體受到創傷和抗原抗體反應等外界刺激后，局部組織以活化的形式分離出組胺并通過脫顆粒釋放到細胞外，參與早期炎性反應。同時，組胺還是一種有效的促有絲分裂劑，可刺激成纖維細胞生長，同時導致膠原合成及膠原沉積增加，促進瘢痕形成[16-17]。
曲尼司特被認為是新一代抗纖維化增殖的藥物，其抑制瘢痕增生的能力在臨床上已得到一定程度證實[18]。目前研究發現其作用機制主要是：穩定肥大細胞細胞膜，阻止肥大細胞脫顆粒釋放組胺等化學介質；抑制成纖維細胞的聚集和增殖，選擇性抑制膠原合成，抑制 TGF-β1 的釋放及其受體的表達，從而有效抑制瘢痕增生[19]。
本研究結果顯示，各組創面愈合時間并無顯著差異，其原因可能是其他細胞途徑代償了 TGF-β1 促傷口愈合的作用，最終使傷口正常愈合，因此本研究所采用劑量的曲尼司特不足以對創面愈合造成影響。創面新生組織病理檢測發現，早期干預組小鼠肥大細胞數、總膠原含量、Ⅰ/Ⅲ型膠原含量比值、TGF-β1 含量、組胺含量均明顯低于對照組、中期干預組和晚期干預組；早期干預組、中期干預組、晚期干預組成纖維細胞超微結構與對照組相比，呈現不同程度改變，且越早開始干預的成纖維細胞結構改變越顯著。結合陳彬等[4]的臨床研究表明，曲尼司特能減輕并改善瘢痕的臨床表現特征，提示曲尼司特影響瘢痕形成的作用開始于瘢痕形成早期。
綜上述，曲尼司特干預對小鼠創面愈合時間無明顯影響，但燒傷后即刻進行曲尼司特干預能明顯降低愈傷組織中肥大細胞數量，并阻止肥大細胞活化脫顆粒釋放組胺，抑制細胞因子 TGF-β1 的表達，抑制成纖維細胞膠原合成能力及調節膠原合成比例，有顯著抑制瘢痕增生的作用。但本實驗樣本量小，觀察時間較短，給藥方式等其他因素對小鼠造成的刺激可能會影響實驗結果準確性，這些不足有待在今后研究中進一步完善。
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增生性瘢痕是傷口異常愈合導致膠原合成及沉積增加的一種纖維化疾病，是燒傷和創傷后常見并發癥，常伴有疼痛、瘙癢以及關節活動受限[1-2]，嚴重時甚至會影響患者生活質量[3]。曲尼司特作為一種 H1 受體阻滯劑，能有效預防和治療部分纖維化疾病，其中包括增生性瘢痕，因此也被認為是一種新型的抗瘢痕藥物，我們前期臨床研究也得到了相似結果[4]。本研究以深Ⅱ度燒傷小鼠創面作為觀測對象，通過不同時間點進行曲尼司特干預，分析其抑制瘢痕增生的作用機制，以及其抑制瘢痕增生的效果是否與給藥時間有關，也為曲尼司特用于臨床治療瘢痕類疾病奠定理論基礎。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
7～8 周齡清潔級雄性昆明小鼠 66 只，體質量 18～22 g，由南方醫科大學動物實驗中心提供，實驗前適應性喂養 5 d。
曲尼司特膠囊（中國藥科大學制藥有限公司）；兔抗鼠 Ⅰ、Ⅲ型膠原一抗（Abcam 公司，美國）；小鼠 TGF-β1 ELISA 試劑盒（R&D 公司，美國）；小鼠組胺 ELISA 試劑盒（Cayman 公司，美國）。DP70 型光學顯微鏡（Olympus 公司，日本）；H-7000FA 型透射電鏡（Hitachi 公司，日本）。
1.2 實驗方法
1.2.1 動物模型制備 66 只小鼠腹腔注射 10% 水合氯醛（400 mg/kg）麻醉后，剃毛器剔除背部毛發，面積約 2 cm×2 cm。24 h 后小鼠同上法再次麻醉后，固定于燙傷板，將其背部剃毛區域置于 100℃ 水中持續 8 s，制成燒傷面積約 1 cm×1 cm 的深Ⅱ度燒傷模型。模型建立后，每只小鼠腹腔注射乳酸林格液 0.5 mL 抗休克。模型制備后背部創面暴露，不給予外用藥物，分籠喂養，自由進食水。
1.2.2 實驗分組及方法 模型制備后，將 66 只小鼠隨機分為 4 組，分別為對照組（n=18）、早期干預組（n=18）、中期干預組（n=18）和晚期干預組（n=12）。早、中、晚期干預組分別于模型制備后當天、7 d、14 d 開始進行曲尼司特 200 mg/（kg·d）[5]灌胃，對照組于模型制備后當天開始等體積生理鹽水灌胃。對照組及早、中期干預組分別于模型制備后 14、28、42 d，晚期干預組于 28、42 d，隨機選取 6 只小鼠處死后觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察 肉眼觀察各組小鼠創面愈合情況，有無滲血、水腫、感染發生，以及創面開始結痂、脫痂時間；以創面痂殼脫落作為創面愈合標準，記錄創面愈合時間。
1.3.2 組織學及免疫組織化學染色觀察 各時間點取創面新生組織，經甲醛固定、漂洗、脫水等處理后切片。首先，取部分切片常規行 HE 染色，于高倍顯微鏡下觀察創面組織結構，確定標本取自于創面愈合組織，以提高實驗檢測結果準確性。然后，取剩余切片常規行甲苯胺藍、Masson 染色及Ⅰ、Ⅲ型膠原免疫組織化學染色。甲苯胺藍染色切片觀察肥大細胞形態，每張切片取 5 個視野，于 400 倍鏡下人工計數肥大細胞；Masson 染色切片觀察總膠原情況；免疫組織化學染色觀察Ⅰ、Ⅲ型膠原表達情況。取 Masson 染色及免疫組織化學染色切片，于 400 倍鏡下每張切片取 5 個視野拍照，采用 Image Pro Plus 6.0 圖像分析系統測量吸光度（A）值，作為總膠原、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白表達水平的半定量參數，并計算Ⅰ/Ⅲ型膠原含量比值。
1.3.3 ELISA 檢測組胺及 TGF-β1 含量 ① 參照小鼠組胺 ELISA 試劑盒說明書步驟進行操作，使用多克隆抗組胺抗體檢測各樣本 450 nm 波長處A 值，并以組胺標準品系列濃度為 x 軸，對應的 450 nm 波長A 值為 y 軸，在 CurveExpert1.4 軟件中選擇擬合度最好的標準曲線方程計算各樣品中組胺濃度。② 參照小鼠 TG-β1 ELISA 試劑盒說明書步驟進行操作，取上清液采用酶標儀測量 492 nm 波長處A 值，通過標準曲線查得相應 TGF-β1 含量。
1.3.4 透射電鏡觀察 取術后 28 d 創面新生組織經 3% 戊二醛固定，1% 四氧化鋨再固定，丙酮逐級脫水，Epon812 包埋，半薄切片光學定位，超薄切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察成纖維細胞的超微結構。
1.4 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用 LSD 法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
各組創面愈合大體觀察情況相似。第 2 天開始創面滲出物形成褐色痂殼覆蓋創面，第 3 天創面開始攣縮，第 7 天出現上皮爬行，創面痂殼干燥，并隨時間延長從四周向中心逐漸脫落，約 11 d 后痂殼全部脫落，創面基本愈合。見圖 1。
圖1
各組造模后 14 d 創面愈合大體觀察 a. 對照組；b. 早期干預組；c. 中期干預組；d. 晚期干預組
Figure1.
The general observation of the wound healing in each group at 14 days after modeling a. Control group; b. Early intervention group; c. Medium intervention group; d. Late intervention group
對照組以及早、中、晚期干預組創面愈合時間分別為（10.7±0.7）、（11.2±0.8）、（11.0±0.6）、（10.5±0.4）d，組間比較差異無統計學意義（F=1.105，P=0.371）。
2.2 組織學及免疫組織化學染色觀察
2.2.1 甲苯胺藍染色 鏡下觀察示，肥大細胞細胞質呈紫紅色，細胞核呈藍色，散在于真皮組織及瘢痕組織中，細胞呈圓形、橢圓形或不規則形，部分細胞顏色變淺，呈脫顆粒現象。各組 14 d 時肥大細胞較少，28 d 最多且脫顆粒明顯，42 d 肥大細胞逐漸減少且以脫顆粒狀態為主（圖 2）。各時間點對照組肥大細胞最多，晚期干預組次之，之后分別為中期干預組、早期干預組。除 42 d 時對照組肥大細胞數與晚期干預組比較差異無統計學意義（P>0.05）外，其余各時間點各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
圖2
各組造模后 28 d 創面甲苯胺藍染色觀察（×400） 紅箭頭示靜止狀態下細胞膜完整的肥大細胞，黑箭頭示活躍狀態下脫顆粒的肥大細胞 a. 對照組；b. 早期干預組；c. 中期干預組；d. 晚期干預組
Figure2.
The toluidine blue staining observation of wound in each group at 28 days after modeling (×400) Red arrow indicated static mast cells with intact cell membrane, black arrow indicated active mast cells under degranulation a. Control group; b. Early intervention group; c. Medium intervention group; d. Late intervention group
表1
各時間點各組肥大細胞計數比較（
n=6，個/mm2，
）
Table1.
Comparison of the mast cells number between groups at each time point (
n=6, cells/mm2,
)
2.2.2 Masson染色及免疫組織化學染色觀測 各時間點對照組總膠原含量最高，其次為晚期干預組，之后為中期干預組、早期干預組。除對照組與晚期干預組比較總膠原含量差異無統計學意義外（P>0.05），其余各時間點各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。對照組與晚期干預組以Ⅰ型膠原為主，而早期干預組和中期干預組以Ⅲ型膠原為主。各時間點，對照組Ⅰ/Ⅲ型膠原含量比值最高，其次為晚期干預組，之后為中期干預組、早期干預組，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 3～5 及表 2。
圖3
各組造模后 42 d 創面 Masson 染色觀察（×400） a. 對照組；b. 早期干預組；c. 中期干預組；d. 晚期干預組
Figure3.
Masson staining observation of wound in each group at 42 days after modeling (×400) a. Control group; b. Early intervention group; c. Medium intervention group; d. Late intervention group
圖4
各組造模后 42 d 創面Ⅰ型膠原免疫組織化學染色觀察（×400） a. 對照組；b. 早期干預組；c. 中期干預組；d. 晚期干預組
Figure4.
The collagen type I immunohistochemical staining observation in each group at 42 days after modeling (×400) a. Control group; b. Early intervention group; c. Medium intervention group; d. Late intervention group
圖5
各組造模后 42 d 創面Ⅲ型膠原免疫組織化學染色觀察（×400） a. 對照組；b. 早期干預組；c. 中期干預組；d. 晚期干預組
Figure5.
The collagen type III immunohistochemical staining observation in each group at 42 days after modeling (×400) a. Control group; b. Early intervention group; c. Medium intervention group; d. Late intervention group
表2
各時間點各組總膠原含量及Ⅰ/Ⅲ型膠原含量比值比較（
n=6，
）
Table2.
Comparison of collagen content and the I/III collagen ratio at each time point (
n=6,
)
2.3 ELISA 檢測
2.3.1 組胺含量 各組 28 d 時創面新生組織中組胺含量最高。各時間點對照組組胺含量最高，其次為晚期干預組，之后分別為中期干預組、早期干預組。除 42 d 對照組與晚期干預組比較差異無統計學意義（P>0.05）外，其余各時間點各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 3。
表3
各時間點各組組胺以及 TGF-β1 含量比較（
n=6，
）
Table3.
Comparison of the histamine content and the TGF-β1 content at each time point (
n=6,
)
2.3.2 TGF-β1 含量 隨時間延長，各組創面新生組織中 TGF-β1 含量呈逐漸下降趨勢。各時間點對照組 TGF-β1 含量最高，其次為晚期干預組，之后分別為中期干預組、早期干預組。各時間點各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 3。
2.4 透射電鏡觀察
對照組：成纖維細胞細胞核內染色質分布均勻，核大、呈長梭形，核仁明顯，細胞質內有豐富的粗面內質網，結構清晰，細胞周圍可見豐富細密排列不規則的膠原纖維。早、中期干預組：與對照組相比，成纖維細胞結構明顯改變，核內染色質分布不均勻，細胞質內粗面內質網不發達或擴張，呈功能異常表現，細胞周圍膠原纖維排列疏松、規則，且早期干預組細胞膜已消失，核仁固縮。晚期干預組：成纖維細胞結構與對照組相近，內質網發達，細胞結構清晰，核仁明顯，但細胞周圍膠原纖維的排列明顯較對照組疏松、有規則，且與早期干預組和中期干預組相比纖維更粗。見圖 6。
圖6
透射電鏡觀察造模后 28 d 各組成纖維細胞超微結構（×15 k） a. 對照組；b. 早期干預組；c. 中期干預組；d. 晚期干預組
Figure6.
The ultrastructure of fibroblasts under transmission electron microscope at 28 days after modeling (×15 k) a. Control group; b. Early intervention group; c. Medium intervention group; d. Late intervention group
3 討論
研究表明，瘢痕是由于創面愈合過程中炎性反應過度、膠原沉積過量以及傷口收縮劇烈所致[6-8]。傷口愈合過程是一個連續而又重疊的動態過程，傳統分為3個時期，分別為炎性反應期、纖維組織增殖期和瘢痕組織重塑期。創面形成初始進入炎性反應階段，此時成纖維細胞遷移進入傷口并產生膠原，協助新生的肉芽組織取代血栓形成；進入纖維組織增殖期后，真皮組織中的成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，促使傷口收縮，減小創面面積，促使傷口表皮化完成；最后交叉編織排列的成熟膠原纖維代替平行排列的不成熟膠原纖維，使傷口更牢固，完成最后的修復重塑過程。肌成纖維細胞及膠原含量過高導致肉芽組織生長過量，表明瘢痕愈合過程中炎性反應期延長及表皮化延遲，而重塑階段若未正常進行，則會導致非成熟膠原纖維異常增多[9]。
TGF-β1 是細胞因子家族成員之一，主要通過T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞以及骨髓中的血小板和前體細胞分泌，并參與一系列生物過程的調節，對傷口愈合及瘢痕增生均有重要作用[10]。TGF-β1 被認為是引起瘢痕增生的最重要細胞因子，在皮膚傷口愈合過程中 TGF-β1 增加會導致瘢痕增生，其促瘢痕增生的作用主要通過 3 個途徑實現[10-11]：其一，通過刺激成纖維細胞增殖來促進膠原蛋白大量合成；其二，誘導成纖維細胞分化為肌成纖維細胞；其三，促進細胞外基質蛋白的異常沉積。與正常皮膚組織相比，瘢痕組織中膠原含量明顯增加，且以排列紊亂的Ⅰ型膠原為主，瘢痕中Ⅰ型膠原越多，質地越硬[5]。TGF-β1 不能直接促進膠原降解，但是可調整Ⅰ/Ⅲ型膠原比例，所以直接抑制 TGF-β1 的活性，可調整瘢痕中Ⅰ/Ⅲ型膠原比例而不會減少總膠原含量。有研究表明，抑制 TGF-β1 的生物學活性可能調整瘢痕組織的纖維化紊亂，且動物實驗已證實，局部外用 TGF-β1 抑制劑可促使瘢痕成熟并改變瘢痕的組織學特征[12]。
肥大細胞是固有的炎性反應細胞，當皮膚受損傷時能迅速活化以參與機體的各種免疫反應，其活性主要通過脫顆粒反應實現[13]。肥大細胞是炎性反應的重要細胞，且炎性反應與瘢痕增生有密切關系，瘢痕愈合的傷口中肥大細胞數及脫顆粒率顯著升高，而無瘢痕愈合的傷口則相反[14]。肥大細胞促進瘢痕增生主要是通過貯存、釋放組胺等活性物質，刺激微血管內皮細胞增殖活化形成大量微血管來促進成纖維細胞增殖，動物模型已證實，阻止肥大細胞脫顆粒或中和肥大細胞介質的釋放能有效抑制瘢痕增生[13,15]。組胺通常以非活化的形式存在于肥大細胞和嗜堿性粒細胞中，當機體受到創傷和抗原抗體反應等外界刺激后，局部組織以活化的形式分離出組胺并通過脫顆粒釋放到細胞外，參與早期炎性反應。同時，組胺還是一種有效的促有絲分裂劑，可刺激成纖維細胞生長，同時導致膠原合成及膠原沉積增加，促進瘢痕形成[16-17]。
曲尼司特被認為是新一代抗纖維化增殖的藥物，其抑制瘢痕增生的能力在臨床上已得到一定程度證實[18]。目前研究發現其作用機制主要是：穩定肥大細胞細胞膜，阻止肥大細胞脫顆粒釋放組胺等化學介質；抑制成纖維細胞的聚集和增殖，選擇性抑制膠原合成，抑制 TGF-β1 的釋放及其受體的表達，從而有效抑制瘢痕增生[19]。
本研究結果顯示，各組創面愈合時間并無顯著差異，其原因可能是其他細胞途徑代償了 TGF-β1 促傷口愈合的作用，最終使傷口正常愈合，因此本研究所采用劑量的曲尼司特不足以對創面愈合造成影響。創面新生組織病理檢測發現，早期干預組小鼠肥大細胞數、總膠原含量、Ⅰ/Ⅲ型膠原含量比值、TGF-β1 含量、組胺含量均明顯低于對照組、中期干預組和晚期干預組；早期干預組、中期干預組、晚期干預組成纖維細胞超微結構與對照組相比，呈現不同程度改變，且越早開始干預的成纖維細胞結構改變越顯著。結合陳彬等[4]的臨床研究表明，曲尼司特能減輕并改善瘢痕的臨床表現特征，提示曲尼司特影響瘢痕形成的作用開始于瘢痕形成早期。
綜上述，曲尼司特干預對小鼠創面愈合時間無明顯影響，但燒傷后即刻進行曲尼司特干預能明顯降低愈傷組織中肥大細胞數量，并阻止肥大細胞活化脫顆粒釋放組胺，抑制細胞因子 TGF-β1 的表達，抑制成纖維細胞膠原合成能力及調節膠原合成比例，有顯著抑制瘢痕增生的作用。但本實驗樣本量小，觀察時間較短，給藥方式等其他因素對小鼠造成的刺激可能會影響實驗結果準確性，這些不足有待在今后研究中進一步完善。
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