引用本文： 郝滋辰, 吳浩, 李陽, 王善正, 陸軍. 大鼠骨髓來源與前交叉韌帶來源 MSCs 體外生物學特性比較研究. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(4): 473-480. doi: 10.7507/1002-1892.201611021 復制
前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）重建術后的腱骨愈合是一個緩慢而復雜的過程，對于患者膝關節功能恢復起至關重要的作用。自然的腱骨愈合過程一般持續數月，并以骨與移植肌腱之間纖維瘢痕組織的形成而結束。不同于正常ACL止點的骨-鈣化的纖維軟骨-纖維軟骨-肌腱特殊結構，術后纖維瘢痕組織較脆弱易于斷裂，并且不能起到良好的緩沖壓力的作用[1-2]。因此，韌帶重建術后患者在功能鍛煉上會受到一定限制，最終影響膝關節功能恢復。為了促進腱骨之間生理學結構的重建，恢復其良好的生物力學特性，研究者們嘗試了大量方法，如富血小板血漿、生長因子、干細胞、轉基因及組織工程等[3-10]，其中 BMSCs 的應用取得了良好療效[5-7]。BMSCs 具有增殖能力強、可多向分化、取材方便、自體來源無排斥反應、生物相容性好等優點，目前已被廣泛應用于促進各種組織修復及再生領域[4-11]。在促進腱骨愈合方面也進行了大量動物實驗，并且取得了積極效果。動物研究表明[5-6]，對于自體肌腱重建的 ACL，采用關節腔注射 BMSCs 或將纖維凝膠作為載體運輸 BMSCs，可明顯加快腱骨愈合進程，并形成類似正常止點的結構而非纖維瘢痕組織，從而促進膝關節功能恢復。
隨著干細胞研究的廣泛深入開展，研究者們成功地從脂肪、肌腱、滑膜等不同組織中分離提取出干細胞，并且發現不同來源的干細胞體外增殖及多向分化的潛能不同，其促進不同組織修復與再生的能力也有一定差別[15-18]。有研究者提出，損傷的 ACL 作為重建手術后的廢棄物可能成為提取 MSCs 的來源，并且該韌帶來源的 MSCs 可能對 ACL 重建術后的腱骨愈合具有意想不到的促進作用；因此他們進行了相關實驗，并成功從 ACL 中成功分離得到 MSCs，發現該細胞同樣具有體外增殖及多向分化能力[19-20]。但目前尚缺乏有關骨髓來源與 ACL 來源 MSCs 的體外生物學特性比較的明確報道。比較這兩種細胞的體外增殖及分化潛能，對于未來臨床促進腱骨愈合的種子細胞選擇具有指導意義。因此，本研究擬體外分離、培養并鑒定大鼠骨髓與 ACL 來源的 MSCs，比較兩種細胞體外增殖能力及多向分化潛能，為進一步體內實驗及臨床細胞治療提供一定基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF 級 6 周齡雄性 BN 大鼠 10 只，體質量 200～220 g，購自上海市西普爾-必凱實驗動物有限公司。實驗過程中對動物處置符合 2006 年科學技術部發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。
Ⅰ 型膠原酶、地塞米松（Sigma 公司，美國）；DMEM 培養基、FBS、胰蛋白酶（HyClone 公司，美國）；SD 大鼠 BMSCs 完全培養基（廣州賽業生物科技有限公司）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）（上海七海復泰生物科技有限公司）；Trizol（Invitrogen 公司，美國）；Synergy Brands green（上海東洋紡生物科技有限公司）；細胞表面標記抗體（上海美天旎生物技術有限公司）；草酸銨結晶紫染色液（上海遠慕生物科技有限公司）；RR047 反轉錄試劑盒（Takara 公司，日本）。
ckx41 顯微鏡（Olympus 公司，日本）；FACS-Calibur 流式細胞儀（Becton Dickinson 公司，美國）；ABI 7900PCR 儀、ABI Stepone Sequence Detection 軟件、Stepone real-time PCR 系統（Applied Biosystems 公司，美國）；51119000Multiskan FC 酶標儀、Nanodrop2000 微量分光光度計（Thermo 公司，美國）。
1.2 細胞分離、培養
1.2.1 ACL 來源 MSCs 分離、培養 取 10 只大鼠頸椎脫臼處死，75% 乙醇浸泡 10 min 消毒。無菌條件下仔細分離 ACL 組織，避免半月板、脂肪、血管及肌肉組織污染，PBS 洗 3 遍，充分剪碎，用無菌鑷子將組織貼在培養皿中，加入 2 mL 含 10%FBS 及 50 U/mL 青霉素+50 mg/mL 鏈霉素的 DMEM 培養基，置入 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養，每 3 天更換 1 次培養基，洗去未貼壁細胞。2 周后，細胞匯合率達 80%～90%，將細胞以 2.5 g/L 胰蛋白酶消化后，按 1∶3 比例傳代培養。每天倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化。取生長狀態良好的第 3 代細胞用于以下觀測。
1.2.2 BMSCs 分離、培養 取上述大鼠，無菌條件下獲取大鼠股骨、脛骨，剔除附著肌肉，用咬骨鉗咬斷骨干，注射器吹吸骨髓腔，使骨髓混于 DMEM 培養基；吸取混合液，通過 200 目篩網過濾后置入 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養，48 h 首次半量換液，以后每 3 天換液 1 次，每次換液時用 PBS 洗凈非貼壁細胞。每天在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態及生長情況，待細胞匯合達 80%～90% 時用 PBS 洗滌 2 次，2.5 g/L 胰蛋白酶消化后，按 1∶3 比例傳代培養。取生長狀態良好的第 3 代細胞用于以下觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 流式細胞儀檢測細胞膜免疫表型 取 BMSCs 和 ACL 來源 MSCs，0.25% 胰蛋白酶消化后以細胞培養基終止消化，402×g 離心 5 min 后棄上清，沉淀物用 PBS 洗滌 2 遍，調節細胞濃度為 1×106 個/L，加入抗大鼠 CD34、CD45、CD90 和 CD29 抗體，4℃ 避光孵育 30 min，用 PBS 洗滌多余抗體后采用流式細胞儀分析。
1.3.2 CCK-8 法檢測細胞體外增殖能力 取 BMSCs 和 ACL 來源 MSCs，以 5×103 個/孔接種于 96 孔板中，培養 2 d 后隨機選 3 個復孔，每孔加入 10 μL CCK-8 試劑，混勻后置入 37℃ 培養箱中避光培養約 2 h 后，用酶標儀 450 nm 波長處檢測吸光度（A）值，取均值。
1.3.3 細胞體外克隆形成能力 取 BMSCs 和 ACL 來源 MSCs，0.25% 胰蛋白酶消化后以 300 個/孔接種于 10 孔板中，用含 10%FBS 的 DMEM 培養基培養，每 3 天更換 1 次培養基，培養 14 d 后 PBS 沖洗 3 次，用草酸銨結晶紫染色液常溫染色，隨機取 3 孔，倒置相差顯微鏡下計數每孔內集落數（集落直徑<2 mm 者忽略不計），取均值。
1.3.4 細胞多向分化能力檢測 ① 成骨誘導分化：取 BMSCs 和 ACL 來源 MSCs，以 4×103 個/cm2 密度接種于 6 孔板中，完全培養基培養至細胞匯合達 90%～100%，吸棄培養液，加入成骨誘導培養基（含 10%FBS、1×10–7 mol/L 地塞米松、5×10–5 mol/L 抗壞血酸及 1×10–2 mol/L β-甘油磷酸鈉的 L-DMEM 培養基），37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養，每 3 天換液 1 次，21 d 后吸棄培養液，PBS 洗滌 2 次，10% 乙醇沖洗后清水沖洗 2 次，0.5% 茜素紅染色 10 min，清水洗滌 2 次后風干，倒置相差顯微鏡下觀察鈣結節。
② 成軟骨誘導分化：取 5×105 個 BMSCs 和 ACL 來源 MSCs 置于 15 mL 離心管中，450 r/min 離心 10 min，置于成軟骨誘導液（含 1×10–7 mol/L 地塞米松、1×10–5 mol/L 胰島素、500 μg/L TGF-β、5×10–5 mol/L 抗壞血酸的 H-DMEM 培養基）中，37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養，每 3 天換液 1 次，21 d 后石蠟包埋、切片，甲苯胺藍染色，倒置相差顯微鏡觀察。
③ 成脂誘導分化：取 BMSCs 和 ACL 來源 MSCs，以 5×103 個/cm2 密度接種于 6 孔板中，完全培養基培養，待細胞匯合達 90%～100% 時，吸棄培養液，加入成脂誘導培養基（含 10%FBS、1×10–6 mol/L 地塞米松、2×10–4 mol/L 吲哚美辛、5×10–4 mol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、1×10–5 mol/L 胰島素的 L-DMEM 培養基），每 3 天換液 1 次，21 d 后吸棄培養液，PBS 洗滌 2 次，室溫下 0.3% 油紅 O 染色 2 h，倒置相差顯微鏡觀察紅色脂滴形成情況。
1.3.5 實時熒光定量 PCR 檢測分化相關基因 mRNA 表達 取 BMSCs 和 ACL 來源 MSCs，采用實時熒光定量 PCR 檢測成骨[ALP、骨鈣蛋白（bone gamma-carboxyglutamate protein，Bglap）、RUNX2、BMP-2、分泌性磷蛋白 1（secreted phosphoprotein 1，Spp1）]、成軟骨[Ⅱ 型膠原 α1（collagen type Ⅱ α1，Col2α1）、軟骨聚糖蛋白（Aggrecan，Acan）、Sox9]及成脂[過氧化物酶體增殖物激活受體 γ2（peroxi-some proli-ferator activated receptor γ2，PPARγ2）及 CCAAT/增強子結合蛋白 α（CCAAT-enhancer-bingding protein-α，CEBPα）]誘導分化特定標記物的 mRNA 表達。
具體方法：利用 Trizol 試劑提取總 RNA，每 1×106 個細胞加入 1 mL Trizol 試劑，并加入氯仿 200 μL，用力振搖 15 s，室溫靜置 15 min，4℃ 以 12 000×g 離心 15 min。取上層無色液體轉移至新的 EP 管中，等體積異丙醇沉淀后以 75% 無水乙醇洗滌，取沉淀物加入 20 μL DEPC 水溶解，Nanodrop 微量分光光度計檢測濃度。利用 RR047 反轉錄試劑盒為原料將總 RNA 反轉錄成 cDNA。用實時熒光定量 PCR儀，利用 Stepone real-time PCR 系統檢測各基因表達，以 GAPDH 作為內參基因。各基因引物序列及產物長度見表 1。PCR 循環程序：95℃、10 min；95℃、5 s，60℃、1 min，45 個循環。用 ABI Stepone Sequence Detection 系統軟件分析，采用 2–ΔΔCt 法分析各基因 mRNA 相對表達量。
表1
實時熒光定量 PCR 基因引物序列及產物長度
Table1.
Primer sequences and product length for real-time fluo-rescent quantitative PCR
1.4 統計學方法
采用 GraphPad Prism5.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞形態學觀察
倒置相差顯微鏡觀察示，原代 BMSCs 及原代 ACL 來源 MSCs 均呈較均一的長梭形，混雜少許其他細胞，經換液、傳代后細胞逐漸純化；傳至第 3 代細胞形態均一，為長梭形，螺旋狀生長。見圖 1。
圖1
大鼠 BMSCs 和 ACL 來源 MSCs 形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100） a. 原代 BMSCs；b. 第 3 代 BMSCs；c. 原代 ACL 來源 MSCs；d. 第 3 代 ACL 來源 MSCs
Figure1.
Morphology observation of rat BMSCs and ACL-MSCs (Inverted phase contrast microscope×100) a. Primary BMSCs; b. The 3rd passage BMSCs; c. Primary ACL-MSCs; d. The 3rd passage ACL-MSCs
2.2 流式細胞儀檢測細胞膜免疫表型
兩種細胞均表現為 CD29 及 CD90 陽性，CD34 及 CD45 陰性。見圖 2。初步說明這兩種細胞具有 MSCs 特性。
圖2
大鼠 BMSCs 與 ACL 來源 MSCs 細胞膜免疫表型流式細胞術檢測 從左至右依次為 CD29、CD34、CD45、CD90 a. BMSCs；b. ACL 來源 MSCs
Figure2.
Immunophenotypic characterization of rat BMSCs and ACL-MSCs by flow cytometry From left to right for CD29, CD34, CD45, and CD90 respectively a. BMSCs; b. ACL-MSCs
2.3 細胞增殖能力及體外克隆形成能力檢測
CCK-8 法檢測示，ACL 來源 MSCs 的A 值為 1.11±0.08，顯著高于 BMSCs 的 0.78±0.05，差異有統計學意義（t=3.599，P=0.023）。ACL 來源 MSCs 的細胞集落數為（53.00±5.51）個/孔，明顯多于 BMSCs 的（30.67±4.84）個/孔，差異有統計學意義（t=3.045，P=0.038）。見圖 3。
圖3
培養 14 d 大鼠 BMSCs 和 ACL 來源 MSCs 克隆形成能力比較 a. BMSCs；b. ACL 來源 MSCs
Figure3.
Comparison of colony formation ability of rat BMSCs and ACL-MSCs at 14 days after culture a. BMSCs; b. ACL-MSCs
2.4 細胞多向分化能力檢測
經成骨、成軟骨、成脂體外誘導培養 21 d 后，BMSCs 及 ACL 來源 MSCs 均表現為茜素紅、甲苯胺藍及油紅 O 染色陽性。見圖 4。
圖4
大鼠 BMSCs 及 ACL 來源 MSCs 體外誘導分化鑒定（倒置相差顯微鏡×100） 從左至右依次為茜素紅染色、甲苯胺藍染色、油紅 O 染色 a. BMSCs；b. ACL 來源 MSCs
Figure4.
Differentiation potential of rat BMSCs and ACL-MSCs (Inverted phase contrast microscope×100) From left to right for alizarin red staining, toluidine blue staining, and oil red O staining respectively a. BMSCs; b. ACL-MSCs
2.5 實時熒光定量 PCR 檢測分化相關基因 mRNA 表達
成骨標記物中，ACL 來源 MSCs 的 BMP-2、Spp1 mRNA 相對表達量顯著高于 BMSCs，而 BMSCs 的 ALP、Bglap、RUNX2 mRNA 相對表達量顯著高于 ACL 來源 MSCs，差異均有統計學意義（P<0.01）。成軟骨標記物中，ACL 來源 MSCs 的 Col2α1、Acan 及 Sox9 mRNA 相對表達量均顯著高于 BMSCs，差異均有統計學意義（P<0.01）。成脂標記物中，ACL 來源 MSCs 的 PPARγ2 mRNA 相對表達量顯著高于 BMSCs，而 BMSCs 的 CEBPα mRNA 相對表達量顯著高于 ACL 來源 MSCs，差異均有統計學意義（P<0.01）。見表 2。
表2
實時熒光定量 PCR 檢測兩種細胞分化相關基因 mRNA 表達（
n=10，
）
Table2.
The mRNA expressions of differentiation related genes by real-time fluorescent quantitative PCR (
n=10,
)
3 討論
MSCs 因其良好的再生、增殖及多向分化潛能，目前已被廣泛研究并應用于組織工程和細胞療法中[11-14]。從早期的 BMSCs、胚胎干細胞到后來的肌腱、脂肪甚至韌帶等來源的干細胞，越來越多不同組織來源干細胞進入研究者們的視野。大量動物實驗證明這些來源于不同組織的 MSCs 在體外增殖及多向分化潛能上有所差異[15-19]，這種差異導致其應用于不同組織修復與再生的效果不同。ACL 來源 MSCs 由于發現相對較晚[19-20]，關于其生物學特性的相關研究尚不完善，其體外增殖、細胞表型及多向分化潛能尚存在爭議[21-25]。因此，本研究擬分離、培養并鑒定 ACL 來源 MSCs 及 BMSCs，比較兩種細胞的體外細胞膜表型、增殖及多向分化潛能，為進一步臨床應用提供依據。
3.1 細胞形態及體外增殖潛能
從形態學上看，原代的兩種細胞主要以長梭形為主，混雜有少許其他形狀細胞，考慮為培養過程中受到其他細胞污染所致。通過傳代、純化后，第 3 代兩種細胞開始表現出均一的長梭形，細胞形態基本一致，均符合 MSCs 的形態學特征[26]。該實驗結果與目前已知的國內外相關研究結果基本相符[19-25]。
對于 ACL 來源 MSCs 與 BMSCs 的體外增殖潛能比較，研究者們目前尚無統一意見。根據 Cheng 等[22,24]的研究結果顯示，ACL 來源 MSCs 具有比 BMSCs 更強的體外增殖潛力；而Steinert 等[21]的研究則相反，認為 BMSCs 在體外增殖方面表現更好。根據本實驗結果，ACL 來源 MSCs 表現出比 BMSCs 更優良的體外增殖特性，在臨床及實驗應用方面更具有優勢。該研究結果的差異可能與細胞分離、培養及傳代方法不同有關。
3.2 細胞膜免疫表型
根據目前已知國內外的文獻報道，BMSCs 與 ACL 來源 MSCs 作為一種非造血的 MSCs，其細胞表型應具有 MSCs 的特性，即表達 CD29、CD90、CD105 等非造血干細胞標記物，不表達 CD45、CD34 造血干細胞標記物[19,21-22,25,27-28]。本實驗應用流式細胞學技術檢測第 3 代 ACL 來源 MSCs 及 BMSCs 表面抗原 CD29、CD34、CD45 和 CD90 的表達，結果表明兩種細胞高表達 CD29、CD90，極低表達 CD45 與 CD34，與文獻報道基本一致，可初步鑒定分離細胞為 MSCs。目前，有研究報道在受損的人 ACL 中存在豐富的 CD34+、CD45–血管干細胞，該發現與本實驗及其他相關研究報道有差別[29-31]，考慮可能與取材對象、受傷時間及取材部位有關。本研究所用 ACL 由切斷大鼠韌帶止點獲得，并且切斷后立即使用，而其他研究可能使用來源于人體的斷裂韌帶殘端，且受傷有一定時間導致受傷組織出現血管化，因而存在 CD34+干細胞，該結論需進一步研究證明。
3.3 體外多向分化潛能
由于目前國際上對于體外分離培養 MSCs 的鑒定主要根據其細胞形態、貼壁生長特性、細胞表型及體外誘導多向分化的能力[26]，因此本實驗在觀察細胞形態及鑒定細胞表型的基礎上，進一步進行體外誘導多向分化來鑒定 MSCs。結果表明，經 21 d 體外誘導分化后，BMSCs 和 ACL 來源 MSCs 均可成骨、成脂、成軟骨分化，提示從 ACL 組織和骨髓組織中分離出來的細胞符合 MSCs 國際定義標準。
多向分化潛能是 MSCs 可用于組織修復與再生的基礎，根據不同分化潛能選擇性地應用種子細胞有利于促進組織的修復與再生。ACL 來源 MSCs 作為一種最近發現的 MSCs，其體外多向分化特性還存在一定爭議。Ghebes 等[23]的研究表明，ACL 來源 MSCs 向軟骨細胞及脂肪細胞分化的潛能比肌腱 MSCs 高。而 Cheng 等[24]的研究則比較了 BMSCs 與 ACL 來源 MSCs 的體外多向分化潛能，表明 BMSCs 在成骨分化潛能上強于 ACL 來源 MSCs，而成軟骨或成脂分化則無明顯差別。Steinert 等[21]的研究又得出了不同結果，他認為 BMSCs 比 ACL 來源 MSCs 具有更強的成軟骨分化能力，而在成骨分化能力上與 ACL 來源 MSCs 無明顯差別。由此可見，目前研究者們對于 ACL 來源 MSCs 的體外多向分化潛能尚未達成共識。本實驗從基因水平上比較了 ACL 來源 MSCs 和 BMSCs 體外多向分化潛能的差異。結果表明，ACL 來源 MSCs 的體外成軟骨分化相關基因（Colα1、Sox9 和 Acan）表達水平明顯高于 BMSCs（P<0.01），說明 ACL 來源 MSCs 在體外條件下具有更強的成軟骨分化潛能，在相同條件下更容易成軟骨分化。
不同細胞來源甚至不同培養環境來源的 MSCs 在表型、細胞內的成分如 RNA 和蛋白以及功能方面有差異[15-19]。細胞的增殖及分化過程是一個多種因素共同作用的過程，與細胞內的蛋白及 miRNA 等分子的調控有密切關系[32-34]。因此，我們推測該研究中涉及到的兩種來源 MSCs 在體外增殖及分化潛能上的差異主要由于不同的細胞表型及成分導致。該結果也提示我們分析不同來源的 MSCs 表型及成分有利于深入了解細胞增殖及分化機制，對于再生醫學領域種子細胞的選擇有指導意義。
綜上述，ACL 來源 MSCs 和 BMSCs 都具有 MSCs 的某些生物學共性，但也表現出一定差異，即 ACL 來源 MSCs 具有更強的體外增殖能力，表達更高水平的成軟骨分化標記基因，更易于分化為軟骨細胞。因此，ACL 來源 MSCs 是一種促進交叉韌帶術后腱骨愈合以及進行軟骨修復非常有前景的細胞。但本研究也存在一些局限性：① 雖然將取材于相同大鼠的 ACL 來源 MSCs 和 BMSCs 進行比較，避免了因細胞來源及內在原因導致的誤差，但在對兩種細胞進行表型分析時，僅挑選公認的 MSCs 特異性表型進行分析，未充分全面分析兩種細胞的表型。② 在進行細胞體外多向分化能力比較時，僅進行了基因水平的比較，缺乏免疫組織化學相關的比較。③ 關于 ACL 來源 MSCs 及 BMSCs 的增殖及誘導分化能力的比較均在體外條件下進行，結果具有一定局限性。因此，未來我們將進一步全面分析兩種細胞的表型，同時盡可能進行細胞成分分析，以明確影響增殖及分化的原因；對兩種細胞體外分化潛能進行組織染色、定量分析，比較兩種細胞體外分化潛能；另外，進行相關的動物體內實驗，探索兩種細胞對于促進腱骨愈合的療效差異。
前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）重建術后的腱骨愈合是一個緩慢而復雜的過程，對于患者膝關節功能恢復起至關重要的作用。自然的腱骨愈合過程一般持續數月，并以骨與移植肌腱之間纖維瘢痕組織的形成而結束。不同于正常ACL止點的骨-鈣化的纖維軟骨-纖維軟骨-肌腱特殊結構，術后纖維瘢痕組織較脆弱易于斷裂，并且不能起到良好的緩沖壓力的作用[1-2]。因此，韌帶重建術后患者在功能鍛煉上會受到一定限制，最終影響膝關節功能恢復。為了促進腱骨之間生理學結構的重建，恢復其良好的生物力學特性，研究者們嘗試了大量方法，如富血小板血漿、生長因子、干細胞、轉基因及組織工程等[3-10]，其中 BMSCs 的應用取得了良好療效[5-7]。BMSCs 具有增殖能力強、可多向分化、取材方便、自體來源無排斥反應、生物相容性好等優點，目前已被廣泛應用于促進各種組織修復及再生領域[4-11]。在促進腱骨愈合方面也進行了大量動物實驗，并且取得了積極效果。動物研究表明[5-6]，對于自體肌腱重建的 ACL，采用關節腔注射 BMSCs 或將纖維凝膠作為載體運輸 BMSCs，可明顯加快腱骨愈合進程，并形成類似正常止點的結構而非纖維瘢痕組織，從而促進膝關節功能恢復。
隨著干細胞研究的廣泛深入開展，研究者們成功地從脂肪、肌腱、滑膜等不同組織中分離提取出干細胞，并且發現不同來源的干細胞體外增殖及多向分化的潛能不同，其促進不同組織修復與再生的能力也有一定差別[15-18]。有研究者提出，損傷的 ACL 作為重建手術后的廢棄物可能成為提取 MSCs 的來源，并且該韌帶來源的 MSCs 可能對 ACL 重建術后的腱骨愈合具有意想不到的促進作用；因此他們進行了相關實驗，并成功從 ACL 中成功分離得到 MSCs，發現該細胞同樣具有體外增殖及多向分化能力[19-20]。但目前尚缺乏有關骨髓來源與 ACL 來源 MSCs 的體外生物學特性比較的明確報道。比較這兩種細胞的體外增殖及分化潛能，對于未來臨床促進腱骨愈合的種子細胞選擇具有指導意義。因此，本研究擬體外分離、培養并鑒定大鼠骨髓與 ACL 來源的 MSCs，比較兩種細胞體外增殖能力及多向分化潛能，為進一步體內實驗及臨床細胞治療提供一定基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF 級 6 周齡雄性 BN 大鼠 10 只，體質量 200～220 g，購自上海市西普爾-必凱實驗動物有限公司。實驗過程中對動物處置符合 2006 年科學技術部發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。
Ⅰ 型膠原酶、地塞米松（Sigma 公司，美國）；DMEM 培養基、FBS、胰蛋白酶（HyClone 公司，美國）；SD 大鼠 BMSCs 完全培養基（廣州賽業生物科技有限公司）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）（上海七海復泰生物科技有限公司）；Trizol（Invitrogen 公司，美國）；Synergy Brands green（上海東洋紡生物科技有限公司）；細胞表面標記抗體（上海美天旎生物技術有限公司）；草酸銨結晶紫染色液（上海遠慕生物科技有限公司）；RR047 反轉錄試劑盒（Takara 公司，日本）。
ckx41 顯微鏡（Olympus 公司，日本）；FACS-Calibur 流式細胞儀（Becton Dickinson 公司，美國）；ABI 7900PCR 儀、ABI Stepone Sequence Detection 軟件、Stepone real-time PCR 系統（Applied Biosystems 公司，美國）；51119000Multiskan FC 酶標儀、Nanodrop2000 微量分光光度計（Thermo 公司，美國）。
1.2 細胞分離、培養
1.2.1 ACL 來源 MSCs 分離、培養 取 10 只大鼠頸椎脫臼處死，75% 乙醇浸泡 10 min 消毒。無菌條件下仔細分離 ACL 組織，避免半月板、脂肪、血管及肌肉組織污染，PBS 洗 3 遍，充分剪碎，用無菌鑷子將組織貼在培養皿中，加入 2 mL 含 10%FBS 及 50 U/mL 青霉素+50 mg/mL 鏈霉素的 DMEM 培養基，置入 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養，每 3 天更換 1 次培養基，洗去未貼壁細胞。2 周后，細胞匯合率達 80%～90%，將細胞以 2.5 g/L 胰蛋白酶消化后，按 1∶3 比例傳代培養。每天倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化。取生長狀態良好的第 3 代細胞用于以下觀測。
1.2.2 BMSCs 分離、培養 取上述大鼠，無菌條件下獲取大鼠股骨、脛骨，剔除附著肌肉，用咬骨鉗咬斷骨干，注射器吹吸骨髓腔，使骨髓混于 DMEM 培養基；吸取混合液，通過 200 目篩網過濾后置入 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養，48 h 首次半量換液，以后每 3 天換液 1 次，每次換液時用 PBS 洗凈非貼壁細胞。每天在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態及生長情況，待細胞匯合達 80%～90% 時用 PBS 洗滌 2 次，2.5 g/L 胰蛋白酶消化后，按 1∶3 比例傳代培養。取生長狀態良好的第 3 代細胞用于以下觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 流式細胞儀檢測細胞膜免疫表型 取 BMSCs 和 ACL 來源 MSCs，0.25% 胰蛋白酶消化后以細胞培養基終止消化，402×g 離心 5 min 后棄上清，沉淀物用 PBS 洗滌 2 遍，調節細胞濃度為 1×106 個/L，加入抗大鼠 CD34、CD45、CD90 和 CD29 抗體，4℃ 避光孵育 30 min，用 PBS 洗滌多余抗體后采用流式細胞儀分析。
1.3.2 CCK-8 法檢測細胞體外增殖能力 取 BMSCs 和 ACL 來源 MSCs，以 5×103 個/孔接種于 96 孔板中，培養 2 d 后隨機選 3 個復孔，每孔加入 10 μL CCK-8 試劑，混勻后置入 37℃ 培養箱中避光培養約 2 h 后，用酶標儀 450 nm 波長處檢測吸光度（A）值，取均值。
1.3.3 細胞體外克隆形成能力 取 BMSCs 和 ACL 來源 MSCs，0.25% 胰蛋白酶消化后以 300 個/孔接種于 10 孔板中，用含 10%FBS 的 DMEM 培養基培養，每 3 天更換 1 次培養基，培養 14 d 后 PBS 沖洗 3 次，用草酸銨結晶紫染色液常溫染色，隨機取 3 孔，倒置相差顯微鏡下計數每孔內集落數（集落直徑<2 mm 者忽略不計），取均值。
1.3.4 細胞多向分化能力檢測 ① 成骨誘導分化：取 BMSCs 和 ACL 來源 MSCs，以 4×103 個/cm2 密度接種于 6 孔板中，完全培養基培養至細胞匯合達 90%～100%，吸棄培養液，加入成骨誘導培養基（含 10%FBS、1×10–7 mol/L 地塞米松、5×10–5 mol/L 抗壞血酸及 1×10–2 mol/L β-甘油磷酸鈉的 L-DMEM 培養基），37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養，每 3 天換液 1 次，21 d 后吸棄培養液，PBS 洗滌 2 次，10% 乙醇沖洗后清水沖洗 2 次，0.5% 茜素紅染色 10 min，清水洗滌 2 次后風干，倒置相差顯微鏡下觀察鈣結節。
② 成軟骨誘導分化：取 5×105 個 BMSCs 和 ACL 來源 MSCs 置于 15 mL 離心管中，450 r/min 離心 10 min，置于成軟骨誘導液（含 1×10–7 mol/L 地塞米松、1×10–5 mol/L 胰島素、500 μg/L TGF-β、5×10–5 mol/L 抗壞血酸的 H-DMEM 培養基）中，37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養，每 3 天換液 1 次，21 d 后石蠟包埋、切片，甲苯胺藍染色，倒置相差顯微鏡觀察。
③ 成脂誘導分化：取 BMSCs 和 ACL 來源 MSCs，以 5×103 個/cm2 密度接種于 6 孔板中，完全培養基培養，待細胞匯合達 90%～100% 時，吸棄培養液，加入成脂誘導培養基（含 10%FBS、1×10–6 mol/L 地塞米松、2×10–4 mol/L 吲哚美辛、5×10–4 mol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、1×10–5 mol/L 胰島素的 L-DMEM 培養基），每 3 天換液 1 次，21 d 后吸棄培養液，PBS 洗滌 2 次，室溫下 0.3% 油紅 O 染色 2 h，倒置相差顯微鏡觀察紅色脂滴形成情況。
1.3.5 實時熒光定量 PCR 檢測分化相關基因 mRNA 表達 取 BMSCs 和 ACL 來源 MSCs，采用實時熒光定量 PCR 檢測成骨[ALP、骨鈣蛋白（bone gamma-carboxyglutamate protein，Bglap）、RUNX2、BMP-2、分泌性磷蛋白 1（secreted phosphoprotein 1，Spp1）]、成軟骨[Ⅱ 型膠原 α1（collagen type Ⅱ α1，Col2α1）、軟骨聚糖蛋白（Aggrecan，Acan）、Sox9]及成脂[過氧化物酶體增殖物激活受體 γ2（peroxi-some proli-ferator activated receptor γ2，PPARγ2）及 CCAAT/增強子結合蛋白 α（CCAAT-enhancer-bingding protein-α，CEBPα）]誘導分化特定標記物的 mRNA 表達。
具體方法：利用 Trizol 試劑提取總 RNA，每 1×106 個細胞加入 1 mL Trizol 試劑，并加入氯仿 200 μL，用力振搖 15 s，室溫靜置 15 min，4℃ 以 12 000×g 離心 15 min。取上層無色液體轉移至新的 EP 管中，等體積異丙醇沉淀后以 75% 無水乙醇洗滌，取沉淀物加入 20 μL DEPC 水溶解，Nanodrop 微量分光光度計檢測濃度。利用 RR047 反轉錄試劑盒為原料將總 RNA 反轉錄成 cDNA。用實時熒光定量 PCR儀，利用 Stepone real-time PCR 系統檢測各基因表達，以 GAPDH 作為內參基因。各基因引物序列及產物長度見表 1。PCR 循環程序：95℃、10 min；95℃、5 s，60℃、1 min，45 個循環。用 ABI Stepone Sequence Detection 系統軟件分析，采用 2–ΔΔCt 法分析各基因 mRNA 相對表達量。
表1
實時熒光定量 PCR 基因引物序列及產物長度
Table1.
Primer sequences and product length for real-time fluo-rescent quantitative PCR
1.4 統計學方法
采用 GraphPad Prism5.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞形態學觀察
倒置相差顯微鏡觀察示，原代 BMSCs 及原代 ACL 來源 MSCs 均呈較均一的長梭形，混雜少許其他細胞，經換液、傳代后細胞逐漸純化；傳至第 3 代細胞形態均一，為長梭形，螺旋狀生長。見圖 1。
圖1
大鼠 BMSCs 和 ACL 來源 MSCs 形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100） a. 原代 BMSCs；b. 第 3 代 BMSCs；c. 原代 ACL 來源 MSCs；d. 第 3 代 ACL 來源 MSCs
Figure1.
Morphology observation of rat BMSCs and ACL-MSCs (Inverted phase contrast microscope×100) a. Primary BMSCs; b. The 3rd passage BMSCs; c. Primary ACL-MSCs; d. The 3rd passage ACL-MSCs
2.2 流式細胞儀檢測細胞膜免疫表型
兩種細胞均表現為 CD29 及 CD90 陽性，CD34 及 CD45 陰性。見圖 2。初步說明這兩種細胞具有 MSCs 特性。
圖2
大鼠 BMSCs 與 ACL 來源 MSCs 細胞膜免疫表型流式細胞術檢測 從左至右依次為 CD29、CD34、CD45、CD90 a. BMSCs；b. ACL 來源 MSCs
Figure2.
Immunophenotypic characterization of rat BMSCs and ACL-MSCs by flow cytometry From left to right for CD29, CD34, CD45, and CD90 respectively a. BMSCs; b. ACL-MSCs
2.3 細胞增殖能力及體外克隆形成能力檢測
CCK-8 法檢測示，ACL 來源 MSCs 的A 值為 1.11±0.08，顯著高于 BMSCs 的 0.78±0.05，差異有統計學意義（t=3.599，P=0.023）。ACL 來源 MSCs 的細胞集落數為（53.00±5.51）個/孔，明顯多于 BMSCs 的（30.67±4.84）個/孔，差異有統計學意義（t=3.045，P=0.038）。見圖 3。
圖3
培養 14 d 大鼠 BMSCs 和 ACL 來源 MSCs 克隆形成能力比較 a. BMSCs；b. ACL 來源 MSCs
Figure3.
Comparison of colony formation ability of rat BMSCs and ACL-MSCs at 14 days after culture a. BMSCs; b. ACL-MSCs
2.4 細胞多向分化能力檢測
經成骨、成軟骨、成脂體外誘導培養 21 d 后，BMSCs 及 ACL 來源 MSCs 均表現為茜素紅、甲苯胺藍及油紅 O 染色陽性。見圖 4。
圖4
大鼠 BMSCs 及 ACL 來源 MSCs 體外誘導分化鑒定（倒置相差顯微鏡×100） 從左至右依次為茜素紅染色、甲苯胺藍染色、油紅 O 染色 a. BMSCs；b. ACL 來源 MSCs
Figure4.
Differentiation potential of rat BMSCs and ACL-MSCs (Inverted phase contrast microscope×100) From left to right for alizarin red staining, toluidine blue staining, and oil red O staining respectively a. BMSCs; b. ACL-MSCs
2.5 實時熒光定量 PCR 檢測分化相關基因 mRNA 表達
成骨標記物中，ACL 來源 MSCs 的 BMP-2、Spp1 mRNA 相對表達量顯著高于 BMSCs，而 BMSCs 的 ALP、Bglap、RUNX2 mRNA 相對表達量顯著高于 ACL 來源 MSCs，差異均有統計學意義（P<0.01）。成軟骨標記物中，ACL 來源 MSCs 的 Col2α1、Acan 及 Sox9 mRNA 相對表達量均顯著高于 BMSCs，差異均有統計學意義（P<0.01）。成脂標記物中，ACL 來源 MSCs 的 PPARγ2 mRNA 相對表達量顯著高于 BMSCs，而 BMSCs 的 CEBPα mRNA 相對表達量顯著高于 ACL 來源 MSCs，差異均有統計學意義（P<0.01）。見表 2。
表2
實時熒光定量 PCR 檢測兩種細胞分化相關基因 mRNA 表達（
n=10，
）
Table2.
The mRNA expressions of differentiation related genes by real-time fluorescent quantitative PCR (
n=10,
)
3 討論
MSCs 因其良好的再生、增殖及多向分化潛能，目前已被廣泛研究并應用于組織工程和細胞療法中[11-14]。從早期的 BMSCs、胚胎干細胞到后來的肌腱、脂肪甚至韌帶等來源的干細胞，越來越多不同組織來源干細胞進入研究者們的視野。大量動物實驗證明這些來源于不同組織的 MSCs 在體外增殖及多向分化潛能上有所差異[15-19]，這種差異導致其應用于不同組織修復與再生的效果不同。ACL 來源 MSCs 由于發現相對較晚[19-20]，關于其生物學特性的相關研究尚不完善，其體外增殖、細胞表型及多向分化潛能尚存在爭議[21-25]。因此，本研究擬分離、培養并鑒定 ACL 來源 MSCs 及 BMSCs，比較兩種細胞的體外細胞膜表型、增殖及多向分化潛能，為進一步臨床應用提供依據。
3.1 細胞形態及體外增殖潛能
從形態學上看，原代的兩種細胞主要以長梭形為主，混雜有少許其他形狀細胞，考慮為培養過程中受到其他細胞污染所致。通過傳代、純化后，第 3 代兩種細胞開始表現出均一的長梭形，細胞形態基本一致，均符合 MSCs 的形態學特征[26]。該實驗結果與目前已知的國內外相關研究結果基本相符[19-25]。
對于 ACL 來源 MSCs 與 BMSCs 的體外增殖潛能比較，研究者們目前尚無統一意見。根據 Cheng 等[22,24]的研究結果顯示，ACL 來源 MSCs 具有比 BMSCs 更強的體外增殖潛力；而Steinert 等[21]的研究則相反，認為 BMSCs 在體外增殖方面表現更好。根據本實驗結果，ACL 來源 MSCs 表現出比 BMSCs 更優良的體外增殖特性，在臨床及實驗應用方面更具有優勢。該研究結果的差異可能與細胞分離、培養及傳代方法不同有關。
3.2 細胞膜免疫表型
根據目前已知國內外的文獻報道，BMSCs 與 ACL 來源 MSCs 作為一種非造血的 MSCs，其細胞表型應具有 MSCs 的特性，即表達 CD29、CD90、CD105 等非造血干細胞標記物，不表達 CD45、CD34 造血干細胞標記物[19,21-22,25,27-28]。本實驗應用流式細胞學技術檢測第 3 代 ACL 來源 MSCs 及 BMSCs 表面抗原 CD29、CD34、CD45 和 CD90 的表達，結果表明兩種細胞高表達 CD29、CD90，極低表達 CD45 與 CD34，與文獻報道基本一致，可初步鑒定分離細胞為 MSCs。目前，有研究報道在受損的人 ACL 中存在豐富的 CD34+、CD45–血管干細胞，該發現與本實驗及其他相關研究報道有差別[29-31]，考慮可能與取材對象、受傷時間及取材部位有關。本研究所用 ACL 由切斷大鼠韌帶止點獲得，并且切斷后立即使用，而其他研究可能使用來源于人體的斷裂韌帶殘端，且受傷有一定時間導致受傷組織出現血管化，因而存在 CD34+干細胞，該結論需進一步研究證明。
3.3 體外多向分化潛能
由于目前國際上對于體外分離培養 MSCs 的鑒定主要根據其細胞形態、貼壁生長特性、細胞表型及體外誘導多向分化的能力[26]，因此本實驗在觀察細胞形態及鑒定細胞表型的基礎上，進一步進行體外誘導多向分化來鑒定 MSCs。結果表明，經 21 d 體外誘導分化后，BMSCs 和 ACL 來源 MSCs 均可成骨、成脂、成軟骨分化，提示從 ACL 組織和骨髓組織中分離出來的細胞符合 MSCs 國際定義標準。
多向分化潛能是 MSCs 可用于組織修復與再生的基礎，根據不同分化潛能選擇性地應用種子細胞有利于促進組織的修復與再生。ACL 來源 MSCs 作為一種最近發現的 MSCs，其體外多向分化特性還存在一定爭議。Ghebes 等[23]的研究表明，ACL 來源 MSCs 向軟骨細胞及脂肪細胞分化的潛能比肌腱 MSCs 高。而 Cheng 等[24]的研究則比較了 BMSCs 與 ACL 來源 MSCs 的體外多向分化潛能，表明 BMSCs 在成骨分化潛能上強于 ACL 來源 MSCs，而成軟骨或成脂分化則無明顯差別。Steinert 等[21]的研究又得出了不同結果，他認為 BMSCs 比 ACL 來源 MSCs 具有更強的成軟骨分化能力，而在成骨分化能力上與 ACL 來源 MSCs 無明顯差別。由此可見，目前研究者們對于 ACL 來源 MSCs 的體外多向分化潛能尚未達成共識。本實驗從基因水平上比較了 ACL 來源 MSCs 和 BMSCs 體外多向分化潛能的差異。結果表明，ACL 來源 MSCs 的體外成軟骨分化相關基因（Colα1、Sox9 和 Acan）表達水平明顯高于 BMSCs（P<0.01），說明 ACL 來源 MSCs 在體外條件下具有更強的成軟骨分化潛能，在相同條件下更容易成軟骨分化。
不同細胞來源甚至不同培養環境來源的 MSCs 在表型、細胞內的成分如 RNA 和蛋白以及功能方面有差異[15-19]。細胞的增殖及分化過程是一個多種因素共同作用的過程，與細胞內的蛋白及 miRNA 等分子的調控有密切關系[32-34]。因此，我們推測該研究中涉及到的兩種來源 MSCs 在體外增殖及分化潛能上的差異主要由于不同的細胞表型及成分導致。該結果也提示我們分析不同來源的 MSCs 表型及成分有利于深入了解細胞增殖及分化機制，對于再生醫學領域種子細胞的選擇有指導意義。
綜上述，ACL 來源 MSCs 和 BMSCs 都具有 MSCs 的某些生物學共性，但也表現出一定差異，即 ACL 來源 MSCs 具有更強的體外增殖能力，表達更高水平的成軟骨分化標記基因，更易于分化為軟骨細胞。因此，ACL 來源 MSCs 是一種促進交叉韌帶術后腱骨愈合以及進行軟骨修復非常有前景的細胞。但本研究也存在一些局限性：① 雖然將取材于相同大鼠的 ACL 來源 MSCs 和 BMSCs 進行比較，避免了因細胞來源及內在原因導致的誤差，但在對兩種細胞進行表型分析時，僅挑選公認的 MSCs 特異性表型進行分析，未充分全面分析兩種細胞的表型。② 在進行細胞體外多向分化能力比較時，僅進行了基因水平的比較，缺乏免疫組織化學相關的比較。③ 關于 ACL 來源 MSCs 及 BMSCs 的增殖及誘導分化能力的比較均在體外條件下進行，結果具有一定局限性。因此，未來我們將進一步全面分析兩種細胞的表型，同時盡可能進行細胞成分分析，以明確影響增殖及分化的原因；對兩種細胞體外分化潛能進行組織染色、定量分析，比較兩種細胞體外分化潛能；另外，進行相關的動物體內實驗，探索兩種細胞對于促進腱骨愈合的療效差異。
