引用本文： 儲成艷, 朱亮, 王蘇平, 藍曉艷, 秦華民, 李深. 膠原凝膠構建神經組織工程支架的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(3): 363-368. doi: 10.7507/1002-1892.201611010 復制
研究表明，BMSCs 可用于治療多種中樞神經系統疾病，且療效肯定[1-3]。然而，移植至損傷部位的 BMSCs 成活率低，分化數量更少，難以實現長期有效的組織修復和功能重建作用[4-5]。膠原是細胞外基質的結構蛋白，屬于天然高分子材料，本身無細胞毒性，且具有來源廣泛、組織相容性好、細胞黏附性高、抗張強度適宜及可充分生物降解等特征，被廣泛用作神經組織工程支架材料[6-9]。膠原支架可作為細胞移植的載體，改善移植細胞所處微環境，提高細胞成活率，進而強化細胞移植治療效果。既往研究多采用冷凍干燥法制備膠原支架，形成海綿樣結構材料，通過外科手術如開顱等方式將支架放置于病變部位[10-11]。本研究利用液態膠原在 37℃ 條件下自然形成凝膠的方法，制備膠原凝膠支架，并觀察該支架對 BMSCs 增殖和分化的影響，旨在探索膠原凝膠構建神經組織工程支架的可行性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
1 月齡 SPF 級雄性 SD 大鼠 6 只，體質量 100～150 g，平均 125 g，由大連醫科大學實驗動物中心提供。
綠色熒光蛋白（green fluorescent protein， GFP）陽性（GFP+）大鼠 BMSCs（廣州賽業生物科技有限公司）；鼠尾Ⅰ型膠原（3.78 mg/mL）及抗大鼠 CD29、CD90 抗體（BD 公司，美國）；人抗鼠 PE-CD29、FITC-CD90、FITC-CD44、PE-CD31、FITC-CD45 抗體（Thermo 公司，美國）；L-DMEM（HyClone 公司，美國）；FBS、胰蛋白酶（GIBCO 公司，美國）。玻底培養皿（無錫耐思生物科技有限公司）；JSM-7800F 超高分辨熱場發射掃描電鏡（JEOL 公司，日本）；倒置相差顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、活細胞工作站（Leica 公司，德國）；流式細胞儀（BD 公司，美國）；熒光酶標儀（Perkin-Elmer 公司，芬蘭）。
1.2 大鼠 BMSCs 培養及鑒定
1.2.1 細胞分離培養 采用密度梯度離心法分離培養 BMSCs。操作如下：取 SD 大鼠 6 只，腹腔注射 10% 水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉后，以 75% 乙醇浸泡消毒 10 min，無菌條件下取出兩側股骨、脛骨，PBS 洗 3 次。以含 10% FBS、100 U/mL 青霉素、100 mg/L 鏈霉素的 L-DMEM 培養液沖洗骨髓腔。收集沖洗液，緩慢加至 Percoll 淋巴細胞分離液表面，4℃、2 000×g 梯度離心 25 min。吸取中間界面層細胞，1 000×g 離心 10 min，棄上清。以含 10% FBS 的 L-DMEM 培養液重懸后，接種于培養皿中，37℃、5% CO2 及飽和濕度培養箱中孵育 48 h 后更換培養液，以后每 3 天更換培養液。倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況，待生長融合至 70%～80% 時，用 0.25% 胰蛋白酶-0.01% EDTA 消化貼壁細胞，按 1∶2 比例傳代。
1.2.2 細胞表型鑒定 取第 5 代細胞約 6×106 個，以 1 000×g 離心 5 min，PBS 洗 3 次。以 600 μL PBS 重懸，過濾后分別加入 1 μL 人抗鼠 PE-CD29、FITC-CD90、FITC-CD44 抗體（陽性標記物）以及 PE-CD31、FITC-CD45 抗體（陰性標志物），充分混勻，室溫避光孵育 30 min，利用流式細胞儀檢測表面特異性抗原。
1.3 膠原凝膠支架及膠原凝膠-BMSCs 復合體制備方法
根據鼠尾Ⅰ型膠原說明書方法，將 265 μL 鼠尾Ⅰ型膠原（3.78 mg/mL）、50 μL 10×PBS、6 μL 1 mol/L NaOH 和 179 μL L-DMEM 培養液置于冰上預冷后，依次加入 1.5 mL EP 管中混勻，調整 pH 值至 7.4，置于 37℃、5% CO2 及飽和濕度培養箱中孵育 45 min，制備 500 μL 濃度為 2 mg/mL 的膠原凝膠。
將第 5 代 BMSCs 重懸至密度為 1×106 個/mL，取 179 μL 細胞懸液替代 L-DMEM 培養液，同上法于 24 孔板中制備膠原凝膠-BMSCs 復合體，并同法制備 100 μL 膠原凝膠-GFP+BMSCs 復合體。
1.4 觀測指標
1.4.1 激光共聚焦顯微鏡和活細胞工作站觀察 取 1.3 中制備的 100 μL 膠原凝膠-GFP+BMSCs 復合體，培養 24 h 后于激光共聚焦顯微鏡和活細胞工作站下觀察細胞生長狀況。
1.4.2 掃描電鏡觀察 取 1.3 中制備的 100 μL 膠原凝膠支架及培養 24 h 的膠原凝膠-BMSCs 復合體，2% 戊二醛固定，4℃ 過夜，乙醇梯度脫水，乙酸異戊酯置換乙醇，冷凍干燥，金離子濺射法表面噴金后，掃描電鏡觀察。
1.4.3 細胞增殖檢測 將第 5 代 BMSCs 重懸至密度為 5×105 個/mL，同 1.3 方法制備膠原凝膠-BMSCs 復合體作為實驗組，另取同等數量 BMSCs 作為對照組，分別接種于 24 孔板中，每組設 3 個復孔。于培養 1、3、5、7 d 行 MTT 檢測，酶標儀 490 nm 波長處檢測吸光度（A）值。
1.4.4 組織學觀察 取 1.3 中制備的 100 μL 膠原凝膠支架及培養 24 h、7 d 的膠原凝膠-BMSCs 復合體，置于 4% 甲醛固定，石蠟包埋，切片，片厚 20 μm，二甲苯脫蠟，乙醇脫水，HE染色，鏡下觀察。
1.5 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞形態學觀察及表型鑒定
分離的原代 BMSCs 接種于培養皿，72 h 后首次換液，倒置相差顯微鏡下觀察示少量細胞貼壁生長，單個、散在分布，呈多角形和梭形。5～6 d 后出現多個細胞集落，并以集落方式生長。10～14 d 后首次傳代，傳代后細胞增殖較快，細胞均勻貼壁，呈梭形旋渦狀生長，排列緊密。傳至第 4 代，形態趨于均一，多呈梭形纖維樣。見圖 1。
圖1
BMSCs 形態學觀察 a. 原代 BMSCs（倒置相差顯微鏡×20）；b. 第 4 代 BMSCs（倒置相差顯微鏡×40）
Figure1.
Morphological observation of BMSCs a. Primary cells (Inverted phase contrast microscope×20); b. The 4th passage cells (Inverted phase contrast microscope×40)
流式細胞儀檢測示，第 5 代細胞高表達 CD29（99.7%）、CD90（84.7%）和 CD44（96.0%），低表達 CD45（0.4%）和 CD31（0.8%），符合 BMSCs 的抗原表型特征。見圖 2。
圖2
流式細胞儀檢測第 5 代 BMSCs 表面特異性抗原表達 a. CD29；b. CD90；c. CD44；d. CD45；e. CD31
Figure2.
Identification of the 5th passage BMSCs by flow cytometry a. CD29; b. CD90; c. CD44; d. CD45; e. CD31
2.2 激光共聚焦顯微鏡和活細胞工作站觀察
激光共聚焦顯微鏡及活細胞工作站觀察示，GFP+BMSCs 均勻分布于膠原凝膠支架內，大部分 GFP+BMSCs 呈梭形，部分細胞伸出突起，部分細胞間形成連接，提示 BMSCs 在三維空間中生長良好。見圖 3。
圖3
GFP+BMSCs 在膠原凝膠支架內的形態學觀察 a. 激光共聚焦顯微鏡（×200）；b. 活細胞工作站（×200）；c. 活細胞工作站（×400）
Figure3.
Morphology of GFP+BMSCs in collagen scaffold a. Under confocal microscopy (×200); b. Under live cell station (×200); c. Under live cell station (×400)
2.3 掃描電鏡觀察
掃描電鏡觀察示，膠原凝膠支架呈多孔纖維網狀結構，可為 BMSCs 提供黏附界面和生長支撐。膠原凝膠-BMSCs 復合體培養 24 h 后，可見支架表面和內部均有細胞黏附生長，BMSCs 形態多樣，伸出突起。見圖 4。
圖4
掃描電鏡觀察 a. 膠原凝膠支架（×5 000）；b. 膠原凝膠支架（×20 k）；c. 膠原凝膠-BMSCs 復合體（×5 000）；d. 膠原凝膠-BMSCs 復合體（×20 k）
Figure4.
Scaffold observed under SEM a. Collagen scaffold (×5 000); b. Collagen scaffold (×20 k); c. Collagen scaffold-BMSCs complex (×5 000); d. Collagen scaffold-BMSCs complex (×20 k)
2.4 細胞增殖檢測
培養 1 d 時兩組A 值比較差異無統計學意義（t=0.972，P=0.326）。培養 3、5、7 d 時實驗組A 值均高于對照組，其中 3 d 時組間比較差異無統計學意義（t=3.165，P=0.083），5、7 d 時組間比較差異有統計學意義（t=4.472，P=0.011；t=4.819，P=0.009）。見圖 5。
圖5
MTT 檢測細胞增殖情況
Figure5.
The proliferation of BMSCs by MTT
2.5 組織學觀察
鏡下見，HE 染色后膠原凝膠支架呈均質淡粉染細絲樣物質。膠原凝膠-BMSCs 復合體培養 24 h 后細胞均勻分布；7 d 時 BMSCs 形態多樣，部分細胞伸出細長突起，具有體外培養的神經元樣形態。見圖 6。
圖6
組織學觀察 a. 膠原凝膠支架（HE×200）；b. 膠原凝膠-BMSCs 復合體培養 24 h（HE×50）；c. 膠原凝膠-BMSCs 復合體培養 24 h（HE×200） 箭頭示神經元樣的 BMSCs；d. 膠原凝膠-BMSCs 復合體培養 7 d（HE×400） 箭頭示神經元樣的 BMSCs
Figure6.
Histological observation a. Collagen scaffold (HE×200); b. Collagen scaffold-BMSCs complex at 24 hours after culture (HE×50); c. Collagen scaffold-BMSCs complex at 24 hours after culture (HE×200) Arrow indicated the BMSCs showing neuron-like cell morphology; d. Collagen scaffold-BMSCs complex at 7 days after culture (HE×400) Arrow indicated the BMSCs showing neuron-like cell morphology
3 討論
除了需滿足一般支架材料的特征外，理想的神經組織工程支架材料還應具備以下特點[12-14]：① 適宜的形態大小和空間結構，有利于細胞生長和損傷組織修復，如神經突起的生長、血管的新生等；② 支架材料彈性和硬度應與宿主組織相似，利于誘導 MSCs 向神經細胞方向分化。生物支架不僅能為移植細胞提供良好的微環境，還可通過 Rho 激酶、局部黏著斑激酶、酪氨酸激酶 A 等生物分子活化干細胞內信號通路、調控相關基因的表達[15]。還有研究表明，支架材料可直接作用于細胞骨架，影響細胞的生物學行為[16]。
膠原是一種應用廣泛的組織工程支架材料，它可通過促進 BMSCs 的 Oct4、Sox2、Rex-1 和 Nanog 等轉錄因子的表達，以維持其干細胞特性[17]。Qu 等[18]利用基因表達譜分析得出膠原支架還可上調 BMSCs 與神經再生、血管新生等相關基因的表達。與單純 BMSCs 療法相比，復合膠原支架可通過多種途徑進一步改善腦外傷引起的神經功能缺失，如縮小病變區范圍、增強病變區血管新生、提高移植細胞存活率、促進神經軸突再生及突觸形成等[4,10,19-21]。在大鼠脊髓損傷的治療研究中，Cholas 等[22]發現單純將膠原支架植入損傷部位也有助于損傷神經功能的恢復，提示膠原支架復合 BMSCs 有望用于治療神經系統疾病。
本實驗利用膠原在 37℃ 條件下自然形成凝膠支架，制備簡便，條件容易控制。掃描電鏡觀察示膠原凝膠支架具有適宜于細胞生長的纖維網狀結構；與 BMSCs 混合培養后，細胞在支架內部生長狀況良好；此外，MTT 檢測提示膠原凝膠支架還能促進細胞增殖。HE 染色還觀察到部分 BMSCs 具有體外培養的神經元樣形態，這與 2006 年 Engler 等[23]研究結論一致，他們提出膠原支架的物理特性對細胞的生物學行為有重要影響，特別是細胞分化方向，硬度在 0.1～1.0 kPa 時最有利于 BMSCs 向神經方向分化[24]，并且可直接注射至病變部位，減少了對機體的創傷。
本實驗所用 BMSCs 是由密度梯度離心法提取，具有自我復制能力強和多向分化潛能特點，可分化為神經細胞。相對于臍帶及外周血來源的 MSCs、誘導多能干細胞和胚胎干細胞，BMSCs 易于分離培養及擴增，同時避免了倫理學、免疫排斥、潛在致瘤性等問題[25-26]。無論是基礎研究還是臨床試驗，BMSCs 均已顯現出其治療神經系統疾病的巨大前景。最近的臨床試驗再次印證了 BMSCs 移植治療對卒中后功能恢復的顯著療效[27]。
綜上述，膠原凝膠支架具有良好的生物相容性，可作為神經組織工程支架材料，有望用于神經系統疾病的治療研究。下一步我們擬將膠原凝膠-BMSCs 復合體直接注射至病變部位，觀察該體系對神經損傷的治療效果，并進一步探索其治療機制。
研究表明，BMSCs 可用于治療多種中樞神經系統疾病，且療效肯定[1-3]。然而，移植至損傷部位的 BMSCs 成活率低，分化數量更少，難以實現長期有效的組織修復和功能重建作用[4-5]。膠原是細胞外基質的結構蛋白，屬于天然高分子材料，本身無細胞毒性，且具有來源廣泛、組織相容性好、細胞黏附性高、抗張強度適宜及可充分生物降解等特征，被廣泛用作神經組織工程支架材料[6-9]。膠原支架可作為細胞移植的載體，改善移植細胞所處微環境，提高細胞成活率，進而強化細胞移植治療效果。既往研究多采用冷凍干燥法制備膠原支架，形成海綿樣結構材料，通過外科手術如開顱等方式將支架放置于病變部位[10-11]。本研究利用液態膠原在 37℃ 條件下自然形成凝膠的方法，制備膠原凝膠支架，并觀察該支架對 BMSCs 增殖和分化的影響，旨在探索膠原凝膠構建神經組織工程支架的可行性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
1 月齡 SPF 級雄性 SD 大鼠 6 只，體質量 100～150 g，平均 125 g，由大連醫科大學實驗動物中心提供。
綠色熒光蛋白（green fluorescent protein， GFP）陽性（GFP+）大鼠 BMSCs（廣州賽業生物科技有限公司）；鼠尾Ⅰ型膠原（3.78 mg/mL）及抗大鼠 CD29、CD90 抗體（BD 公司，美國）；人抗鼠 PE-CD29、FITC-CD90、FITC-CD44、PE-CD31、FITC-CD45 抗體（Thermo 公司，美國）；L-DMEM（HyClone 公司，美國）；FBS、胰蛋白酶（GIBCO 公司，美國）。玻底培養皿（無錫耐思生物科技有限公司）；JSM-7800F 超高分辨熱場發射掃描電鏡（JEOL 公司，日本）；倒置相差顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、活細胞工作站（Leica 公司，德國）；流式細胞儀（BD 公司，美國）；熒光酶標儀（Perkin-Elmer 公司，芬蘭）。
1.2 大鼠 BMSCs 培養及鑒定
1.2.1 細胞分離培養 采用密度梯度離心法分離培養 BMSCs。操作如下：取 SD 大鼠 6 只，腹腔注射 10% 水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉后，以 75% 乙醇浸泡消毒 10 min，無菌條件下取出兩側股骨、脛骨，PBS 洗 3 次。以含 10% FBS、100 U/mL 青霉素、100 mg/L 鏈霉素的 L-DMEM 培養液沖洗骨髓腔。收集沖洗液，緩慢加至 Percoll 淋巴細胞分離液表面，4℃、2 000×g 梯度離心 25 min。吸取中間界面層細胞，1 000×g 離心 10 min，棄上清。以含 10% FBS 的 L-DMEM 培養液重懸后，接種于培養皿中，37℃、5% CO2 及飽和濕度培養箱中孵育 48 h 后更換培養液，以后每 3 天更換培養液。倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況，待生長融合至 70%～80% 時，用 0.25% 胰蛋白酶-0.01% EDTA 消化貼壁細胞，按 1∶2 比例傳代。
1.2.2 細胞表型鑒定 取第 5 代細胞約 6×106 個，以 1 000×g 離心 5 min，PBS 洗 3 次。以 600 μL PBS 重懸，過濾后分別加入 1 μL 人抗鼠 PE-CD29、FITC-CD90、FITC-CD44 抗體（陽性標記物）以及 PE-CD31、FITC-CD45 抗體（陰性標志物），充分混勻，室溫避光孵育 30 min，利用流式細胞儀檢測表面特異性抗原。
1.3 膠原凝膠支架及膠原凝膠-BMSCs 復合體制備方法
根據鼠尾Ⅰ型膠原說明書方法，將 265 μL 鼠尾Ⅰ型膠原（3.78 mg/mL）、50 μL 10×PBS、6 μL 1 mol/L NaOH 和 179 μL L-DMEM 培養液置于冰上預冷后，依次加入 1.5 mL EP 管中混勻，調整 pH 值至 7.4，置于 37℃、5% CO2 及飽和濕度培養箱中孵育 45 min，制備 500 μL 濃度為 2 mg/mL 的膠原凝膠。
將第 5 代 BMSCs 重懸至密度為 1×106 個/mL，取 179 μL 細胞懸液替代 L-DMEM 培養液，同上法于 24 孔板中制備膠原凝膠-BMSCs 復合體，并同法制備 100 μL 膠原凝膠-GFP+BMSCs 復合體。
1.4 觀測指標
1.4.1 激光共聚焦顯微鏡和活細胞工作站觀察 取 1.3 中制備的 100 μL 膠原凝膠-GFP+BMSCs 復合體，培養 24 h 后于激光共聚焦顯微鏡和活細胞工作站下觀察細胞生長狀況。
1.4.2 掃描電鏡觀察 取 1.3 中制備的 100 μL 膠原凝膠支架及培養 24 h 的膠原凝膠-BMSCs 復合體，2% 戊二醛固定，4℃ 過夜，乙醇梯度脫水，乙酸異戊酯置換乙醇，冷凍干燥，金離子濺射法表面噴金后，掃描電鏡觀察。
1.4.3 細胞增殖檢測 將第 5 代 BMSCs 重懸至密度為 5×105 個/mL，同 1.3 方法制備膠原凝膠-BMSCs 復合體作為實驗組，另取同等數量 BMSCs 作為對照組，分別接種于 24 孔板中，每組設 3 個復孔。于培養 1、3、5、7 d 行 MTT 檢測，酶標儀 490 nm 波長處檢測吸光度（A）值。
1.4.4 組織學觀察 取 1.3 中制備的 100 μL 膠原凝膠支架及培養 24 h、7 d 的膠原凝膠-BMSCs 復合體，置于 4% 甲醛固定，石蠟包埋，切片，片厚 20 μm，二甲苯脫蠟，乙醇脫水，HE染色，鏡下觀察。
1.5 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞形態學觀察及表型鑒定
分離的原代 BMSCs 接種于培養皿，72 h 后首次換液，倒置相差顯微鏡下觀察示少量細胞貼壁生長，單個、散在分布，呈多角形和梭形。5～6 d 后出現多個細胞集落，并以集落方式生長。10～14 d 后首次傳代，傳代后細胞增殖較快，細胞均勻貼壁，呈梭形旋渦狀生長，排列緊密。傳至第 4 代，形態趨于均一，多呈梭形纖維樣。見圖 1。
圖1
BMSCs 形態學觀察 a. 原代 BMSCs（倒置相差顯微鏡×20）；b. 第 4 代 BMSCs（倒置相差顯微鏡×40）
Figure1.
Morphological observation of BMSCs a. Primary cells (Inverted phase contrast microscope×20); b. The 4th passage cells (Inverted phase contrast microscope×40)
流式細胞儀檢測示，第 5 代細胞高表達 CD29（99.7%）、CD90（84.7%）和 CD44（96.0%），低表達 CD45（0.4%）和 CD31（0.8%），符合 BMSCs 的抗原表型特征。見圖 2。
圖2
流式細胞儀檢測第 5 代 BMSCs 表面特異性抗原表達 a. CD29；b. CD90；c. CD44；d. CD45；e. CD31
Figure2.
Identification of the 5th passage BMSCs by flow cytometry a. CD29; b. CD90; c. CD44; d. CD45; e. CD31
2.2 激光共聚焦顯微鏡和活細胞工作站觀察
激光共聚焦顯微鏡及活細胞工作站觀察示，GFP+BMSCs 均勻分布于膠原凝膠支架內，大部分 GFP+BMSCs 呈梭形，部分細胞伸出突起，部分細胞間形成連接，提示 BMSCs 在三維空間中生長良好。見圖 3。
圖3
GFP+BMSCs 在膠原凝膠支架內的形態學觀察 a. 激光共聚焦顯微鏡（×200）；b. 活細胞工作站（×200）；c. 活細胞工作站（×400）
Figure3.
Morphology of GFP+BMSCs in collagen scaffold a. Under confocal microscopy (×200); b. Under live cell station (×200); c. Under live cell station (×400)
2.3 掃描電鏡觀察
掃描電鏡觀察示，膠原凝膠支架呈多孔纖維網狀結構，可為 BMSCs 提供黏附界面和生長支撐。膠原凝膠-BMSCs 復合體培養 24 h 后，可見支架表面和內部均有細胞黏附生長，BMSCs 形態多樣，伸出突起。見圖 4。
圖4
掃描電鏡觀察 a. 膠原凝膠支架（×5 000）；b. 膠原凝膠支架（×20 k）；c. 膠原凝膠-BMSCs 復合體（×5 000）；d. 膠原凝膠-BMSCs 復合體（×20 k）
Figure4.
Scaffold observed under SEM a. Collagen scaffold (×5 000); b. Collagen scaffold (×20 k); c. Collagen scaffold-BMSCs complex (×5 000); d. Collagen scaffold-BMSCs complex (×20 k)
2.4 細胞增殖檢測
培養 1 d 時兩組A 值比較差異無統計學意義（t=0.972，P=0.326）。培養 3、5、7 d 時實驗組A 值均高于對照組，其中 3 d 時組間比較差異無統計學意義（t=3.165，P=0.083），5、7 d 時組間比較差異有統計學意義（t=4.472，P=0.011；t=4.819，P=0.009）。見圖 5。
圖5
MTT 檢測細胞增殖情況
Figure5.
The proliferation of BMSCs by MTT
2.5 組織學觀察
鏡下見，HE 染色后膠原凝膠支架呈均質淡粉染細絲樣物質。膠原凝膠-BMSCs 復合體培養 24 h 后細胞均勻分布；7 d 時 BMSCs 形態多樣，部分細胞伸出細長突起，具有體外培養的神經元樣形態。見圖 6。
圖6
組織學觀察 a. 膠原凝膠支架（HE×200）；b. 膠原凝膠-BMSCs 復合體培養 24 h（HE×50）；c. 膠原凝膠-BMSCs 復合體培養 24 h（HE×200） 箭頭示神經元樣的 BMSCs；d. 膠原凝膠-BMSCs 復合體培養 7 d（HE×400） 箭頭示神經元樣的 BMSCs
Figure6.
Histological observation a. Collagen scaffold (HE×200); b. Collagen scaffold-BMSCs complex at 24 hours after culture (HE×50); c. Collagen scaffold-BMSCs complex at 24 hours after culture (HE×200) Arrow indicated the BMSCs showing neuron-like cell morphology; d. Collagen scaffold-BMSCs complex at 7 days after culture (HE×400) Arrow indicated the BMSCs showing neuron-like cell morphology
3 討論
除了需滿足一般支架材料的特征外，理想的神經組織工程支架材料還應具備以下特點[12-14]：① 適宜的形態大小和空間結構，有利于細胞生長和損傷組織修復，如神經突起的生長、血管的新生等；② 支架材料彈性和硬度應與宿主組織相似，利于誘導 MSCs 向神經細胞方向分化。生物支架不僅能為移植細胞提供良好的微環境，還可通過 Rho 激酶、局部黏著斑激酶、酪氨酸激酶 A 等生物分子活化干細胞內信號通路、調控相關基因的表達[15]。還有研究表明，支架材料可直接作用于細胞骨架，影響細胞的生物學行為[16]。
膠原是一種應用廣泛的組織工程支架材料，它可通過促進 BMSCs 的 Oct4、Sox2、Rex-1 和 Nanog 等轉錄因子的表達，以維持其干細胞特性[17]。Qu 等[18]利用基因表達譜分析得出膠原支架還可上調 BMSCs 與神經再生、血管新生等相關基因的表達。與單純 BMSCs 療法相比，復合膠原支架可通過多種途徑進一步改善腦外傷引起的神經功能缺失，如縮小病變區范圍、增強病變區血管新生、提高移植細胞存活率、促進神經軸突再生及突觸形成等[4,10,19-21]。在大鼠脊髓損傷的治療研究中，Cholas 等[22]發現單純將膠原支架植入損傷部位也有助于損傷神經功能的恢復，提示膠原支架復合 BMSCs 有望用于治療神經系統疾病。
本實驗利用膠原在 37℃ 條件下自然形成凝膠支架，制備簡便，條件容易控制。掃描電鏡觀察示膠原凝膠支架具有適宜于細胞生長的纖維網狀結構；與 BMSCs 混合培養后，細胞在支架內部生長狀況良好；此外，MTT 檢測提示膠原凝膠支架還能促進細胞增殖。HE 染色還觀察到部分 BMSCs 具有體外培養的神經元樣形態，這與 2006 年 Engler 等[23]研究結論一致，他們提出膠原支架的物理特性對細胞的生物學行為有重要影響，特別是細胞分化方向，硬度在 0.1～1.0 kPa 時最有利于 BMSCs 向神經方向分化[24]，并且可直接注射至病變部位，減少了對機體的創傷。
本實驗所用 BMSCs 是由密度梯度離心法提取，具有自我復制能力強和多向分化潛能特點，可分化為神經細胞。相對于臍帶及外周血來源的 MSCs、誘導多能干細胞和胚胎干細胞，BMSCs 易于分離培養及擴增，同時避免了倫理學、免疫排斥、潛在致瘤性等問題[25-26]。無論是基礎研究還是臨床試驗，BMSCs 均已顯現出其治療神經系統疾病的巨大前景。最近的臨床試驗再次印證了 BMSCs 移植治療對卒中后功能恢復的顯著療效[27]。
綜上述，膠原凝膠支架具有良好的生物相容性，可作為神經組織工程支架材料，有望用于神經系統疾病的治療研究。下一步我們擬將膠原凝膠-BMSCs 復合體直接注射至病變部位，觀察該體系對神經損傷的治療效果，并進一步探索其治療機制。
