引用本文： 董嬌, 黃桂林. 細胞治療與組織工程方法再生涎腺的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(3): 369-373. doi: 10.7507/1002-1892.201611101 復制
頭頸部惡性腫瘤放射治療會導致涎腺功能障礙，進而引起多種嚴重口腔疾病，如猖獗齒、吞咽困難等，嚴重影響患者生活質量[1]。目前，涎腺功能障礙主要采用涎液替代物或口腔催涎劑等藥物治療，不僅存在療效短、需要多次長期用藥、存在不可忽視的副作用等問題，最重要的是治療效果與放射后剩余的涎腺細胞數量密切相關[2]。而細胞治療面臨涎腺干/祖細胞提取困難、干細胞移植相關風險較大、存在倫理問題等不足。其他治療方法還包括放療前手術移位放射區相關腺體或使用放射保護劑，或采用更先進的適形調強放療法；但前者是一種有創操作，后者雖提高了放射治療精準度，可能恢復部分涎腺功能，但頜面部腺體功能損傷難以避免。鑒于此，尋找一種更可行的治療涎腺功能障礙方法具有重要臨床意義。現對近年國內外有關放射治療后涎腺功能障礙治療方法的研究進展作一綜述，以期為相關研究提供參考。
1 利用來自涎腺的成體干細胞進行細胞治療
有研究發現適形調強放療法治療后部分涎腺受損的功能可出現自發恢復，提示涎腺中可能存在成體干細胞[3]。為此，學者們進行了大量研究。2008 年，Lombaert 等[4] 分離小鼠下頜下腺（subman-dibular glands，SMG）并體外培養涎腺微球體，發現其中含有表達干細胞標記物 Sca-1、c-Kit、Musashi-1 的細胞，而且形態學和功能分析表明這些細胞能分化成涎腺導管細胞和分泌黏蛋白及淀粉酶的腺泡細胞；進一步將少量 c-Kit+ 細胞注射至動物腺體內后發現，涎腺形態和功能得到長期恢復，而且在受體涎腺中能分離出供體來源干細胞，這些干細胞傳至第 2 代時可自發形成三維立體微球體結構，體內移植后能緩解放射損傷。之后，Feng 等[5] 分離人腮腺和 SMG 細胞也獲得同樣結果。Feng 等將不同來源分離獲得的細胞進行體外培養后發現，均含有 c-Kit 標記陽性、可獨立擴增并分化的干細胞群。Gorjup 等[6] 認為在涎腺腺泡和導管之間存在一種可分化為腺泡細胞和導管細胞的成體干細胞。這些研究均表明動物和人涎腺中包含干/祖細胞，將其移植至宿主腺體內可以維持自身多向分化能力，并分化成多種特異性涎腺細胞類型。
涎腺干細胞移植修復受損涎腺功能不僅與移植的干/祖細胞有關，還與涎腺中存留的自體干/祖細胞有關。放射線會導致體內的干/祖細胞休眠，但這些細胞能被局部活化因素所激活[7-8]，如各種生物因子和信號通路蛋白等。因此，若給予合適的刺激并且移植區域又存在休眠的干/祖細胞，細胞治療則能獲得較好的局部治療效果。另外，有研究表明涎腺干細胞在涎腺中的分布具有區域特異性，在放射區域中排除含有干/祖細胞的特定區域（如副腮腺靠近主導管和排泄管區域），將大大提高涎腺的再生能力，降低放療后口干癥的風險[9]，有望成為防治口干癥的有效方法。
在有關 c-Kit 標記陽性的細胞群體是否具有與體內相同增殖分化能力的研究中，各種 Kit+ 細胞，如 Kit+CD24+、Kit+CD49f+、Kit+CD24+Sca1+，被逐漸發現具有干/祖細胞潛能，其中 Kit+CD24+（CD49f+/Sca1+）的潛能最大[10-11]。但是涎腺干/祖細胞是否具有其他蛋白標記物，需要進一步研究[10-13]。有研究分離了人小涎腺組織中上皮干/祖細胞和 MSCs，并成功混合培養成生物工程化涎腺，體內移植后觀察到導管分支樣結構的形成，這為涎腺組織特異性干細胞恢復涎腺功能障礙的研究開辟了新思路[14]。該研究中涎腺上皮干細胞高表達 CD29 和 CD49f，涎腺 MSCs 高表達 CD29、CD73、CD90、CD44、CD105 和 CD166。
但涎腺 MSCs 恢復涎腺功能的研究仍存在諸多難題，如頭頸部惡性腫瘤患者涎腺 MSCs 較少，提示利用此類患者活檢標本構建疾病模型或培養放射治療后用于再生治療的涎腺干/祖細胞時，患者年齡是必要考慮因素[5]。臨床上可能需要更多的干/祖細胞來恢復涎腺功能，目前研究表明[15] 使用生長因子或乙醛脫氫酶 3 來增加體外 c-Kit+ 細胞數量可行，但面臨兩大難題：一是人涎腺再生和功能重建所需細胞數量不確定，二是活檢來源細胞體外培養壽命有限。冷藏涎腺 MSCs 以保持其基因穩定性和分泌功能，從而提高體外培養壽命的方法，可能用于基于成體干細胞移植的涎腺再生療法[16]。
2 其他組織來源的干細胞在細胞治療中的應用
目前，已有大量利用骨髓基質干細胞、骨髓間充質干細胞、人脂肪來源 MSCs、羊膜細胞、胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）、誘導型多潛能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）等干細胞進行細胞治療并恢復放射性涎腺損傷的研究。有研究在體外觀察到骨髓間充質干細胞向涎腺腺泡細胞轉化[17]；雙室共培養人羊膜上皮細胞與腺泡細胞可得到高表達淀粉酶的腺泡樣細胞，并能改善輻射損傷小鼠唾液腺組織的功能[18]。但以上研究所采用的干細胞在體內的具體作用機制尚不清楚，可能是通過旁分泌的促增殖和促分化作用，促進剩余涎腺中功能細胞的恢復或干/祖細胞的激活[19]，目前已明確了若干可能相關的信號通路。研究表明，角質細胞生長因子或 FGF-7 能夠增加放射模型體內涎腺干/祖細胞數量[20]，Wnt/β-catenin[21]、Notch 信號通路[22] 和 SHH[23] 信號分子也被發現具有相似功能，EGF、IGF-1、FGF-2[24]、IL-6[25]、EDA/EDAR 活化因子[26] 都能減少細胞凋亡，促進細胞增殖。
鑒于上述干細胞可能不會有效分化為涎腺細胞，其他干/祖細胞類型如 ESCs 和 iPSCs 可能作為一種新的細胞來源，已有研究將小鼠 ESCs 和人涎腺來源成纖維細胞三維共培養，結果發現 ESCs 向涎腺細胞轉化且涎腺相關標記物表達增多，體內移植后發現新生涎腺組織[27]。但這種重建組織功能的機制尚未明確。iPSCs 和 EPCs 類似，具有多向分化潛能，但是 iPSCs 的優勢更突出，它們可以利用成人的細胞培養獲得，避免用人類胚胎存在的倫理問題；另外，iPSCs 可從罹患疾病的患者提取組織或細胞進行培養獲得，可根據患者基因，利用其病變組織發育成特定細胞系，設計“個性化”治療方案[28]，最大程度減輕免疫排斥反應。因此，在進一步評估 ESCs 和 iPSCs 形成涎腺細胞的基因組穩定性和致瘤性等問題后，其有望成為細胞療法治療涎腺放射性功能損傷的細胞來源[29]。
值得注意的是，組織和器官不是從單一一種干細胞發育而來，因此利用這種干細胞分化方法可能與體內器官發生、發育過程背道而馳。如 ESCs 形成的極化大腦皮質樣組織具有和真實大腦相同的分層結構和胚層特異性神經元的分化，但其體外胚層形成的過程卻與體內觀察完全相反[30]。因此，如何運用各種組織來源的干/祖細胞需要進一步研究。
3 利用組織工程技術構建涎腺類器官
類器官是指在結構和功能上類似于來源器官或組織的微小器官。Lancaster 等[31] 認為類器官是源于多能干細胞或器官祖細胞，包含目標器官中至少一種細胞類型，能夠自組裝為器官樣結構，具有其生理結構和功能特征，并且具有胚層特異性的擬器官體。在類器官形成過程中，自組裝是關鍵。自組裝是指在無外力干預條件下，干細胞或多細胞依靠各組分間的相互作用自我分化為多種結構的過程，這一過程依賴生理性的內源機制自發產生。比如在胚胎鼠唾液腺上皮細胞的三維培養中可見自發形成的分支樣或芽狀結構[32]，這依賴于細胞與基質間以及細胞與細胞間包括多種細胞因子及信號通路的共同參與。而且這一內源機制并非固定不變，時間、空間的變化都增加了其復雜性和多樣性。類器官培養是一種三維培養，現在已構建成功的三維類器官培養實例很多，如結腸、前列腺、肝臟、心臟、胰腺、視網膜、乳腺、腦垂體、腦、肺等。部分已應用于臨床細胞治療或損傷修復等，以及用于藥物篩選、組織再生和疾病建模等方面研究[33]。
利用組織工程技術構建涎腺類器官需要 3 個重要組成成分：細胞與細胞間的接觸、細胞與細胞外基質（extracellular matrix，ECM）成分的接觸，以及能使上述兩種物質更好發揮作用的活性三維支架。理想情況下，組織工程支架應與人或動物涎腺組織的 ECM 結構相似，并具備其最基本功能。ECM 的不同成分能夠不同程度地影響細胞分化、管腔形成和基底膜上緊密結合結構的形成。如高鈣條件（0.5 mmol/L）有利于腺泡發育和腺泡腔的形成[34]；在不含 ECM 多肽，只含有氨基酸的水凝膠中很難觀察到涎腺細胞的形成，但在涂布了纖維連接蛋白的天然絲綢上黏蛋白分泌細胞的生長壽命達 1 個月以上[35]。目前，ECM 在組織形成和細胞分化過程中的積極作用與組織特異性的關系仍不清楚。有研究利用胚胎干細胞誘導得到胰腺祖細胞系，將不同發育時期的間充質（間葉組織、間質組織）與其共培養，發現器官類型匹配的間充質可使祖細胞擴增、自我更新同時保持不分化狀態，并且能使祖細胞在擴增 100 萬倍以上同時，依然保留其分化能力[36]。還有研究用肝特異性 ECM 結合肝素化透明質酸（hyaluronic acid，HA）水凝膠后促進人肝臟細胞的體外擴增[37]。這些研究結果均提示組織特異性 ECM 在細胞生存微環境方面具備某些特殊屬性。關于組織特異性 ECM 還有另外一個值得探討的問題，即其能否傳遞與發育階段有關的特異性再生信號，有待研究者進一步研究明確。
生物支架包括天然材料和人工合成材料。天然材料包括含膠原蛋白和纖維蛋白等的 ECM、絲綢、殼聚糖、藻酸鹽、HA 等，人工合成材料包括聚乙醇酸、聚乳酸、聚乳酸-羥基乙酸（polylactic-co-glycolic cid，PLGA）共聚物、聚乙二醇等。大量研究表明，不同支架成分和結構對細胞分化和組織特異結構的形成有不同作用。例如，PLGA 納米纖維結合層粘連蛋白 111 后能促進涎腺細胞緊密連接和管腔的形成，但結合殼聚糖時則會拮抗這種作用[38]；人涎腺細胞包埋至包含 PlnDIV 肽的 HA 水凝膠中后能夠組裝成微球體，該微球體包含中間為管腔的大型腺泡樣結構[39]。在涎腺分支和導管結構形成方面，不同生物支架成分及結構的不同作用更加明顯。例如，天然殼聚糖能通過調節基底膜的成分來加強分支[40]，在Ⅰ型膠原蛋白或基質膠上能構建各種分支狀的類器官[41]。但值得注意的是，來源于小鼠肉瘤細胞的基質膠中包含異種成分，可能增加致瘤性等不確定風險，因而利用本體器官特異性或組織特異性 ECM 支架成為一種相對較安全的替代方案。目前，已有學者在全器官脫細胞 SMG 支架上接種大鼠原代 SMG 細胞，掃描電鏡觀察發現脫細胞的 SMG 支架能夠支持 SMG 細胞黏附，形成極化管腔，免疫熒光染色顯示多種分化標記物表達，表明全器官脫細胞化 ECM 可能作為涎腺組織工程化再生的支架材料[42]。生物支架的性質，如機械及化學特性也會影響其作用的發揮。如精細的微觀結構能夠模擬基底膜的物理特性，增加表面接觸，形成極化更好的管腔和分化良好的涎腺上皮細胞[43]；生物可降解性和多孔性、硬度、強度等均可影響支架對細胞黏附、遷移和分化的作用[44]。有研究表明，基底膜 ROCK1/PAR-1b 依賴的調控方式對協調 SMG 發育過程中的組織極化和結構加工有重要意義[45]，但該研究未實現信號通路分子的動態釋放。目前有研究者在仿生聚乙二醇水凝膠上合成了一種可人工控制梯度的特殊蛋白質[46]；新型數字化微流體平臺動態交換流體也可實現信號分子的三維調控[47]。隨著這些技術的發展，生物支架在涎腺組織再生中作用及機制中的研究將進一步深入。
近期，在利用組織工程方法體外構建涎腺類器官修復臨床放療后頜面部腺體功能障礙的研究已取得了一些進展。有學者分離單一 c-Kit+ 人涎腺干細胞并接種于立體基質膠 Matrigel 上，發現這種細胞可體外擴增并分化為含有多種細胞類型的涎腺類器官，進一步體內實驗表明這種涎腺類器官異種移植后可長期存活并保留涎腺特有分泌功能，也能改善受體動物的唾液分泌量，促進受體動物涎腺功能的恢復[48]。這為涎腺干細胞標記、干細胞體外構建涎腺類器官方法及其形態和功能評估的進一步研究奠定了基礎。
目前，提高類器官中干細胞的傳代能力并保留涎腺的分泌功能仍是需要解決的問題；如何提高血供供應率、恢復神經支配的調節和利用生物支架增強與宿主的聯系，也有待繼續研究；來源于人正常涎腺組織的類器官中是否存在具有干細胞特性的細胞，何種蛋白標記物能夠理想地標記涎腺干細胞，類器官三維培養技術能否獲得數量足夠且有理想增殖和分化能力的干細胞來構建人工化涎腺等問題，都有待于進一步研究明確。
4 挑戰與前景
近年，治療涎腺功能障礙的方法發展迅速，但每種方法都各有其不足。實現由動物實驗向人體試驗的轉化，并理解動物和人體來源的涎腺干祖細胞對放射線損傷產生不同反應的機制是一項重要挑戰；臨床治療中不同種類的涎腺（腮腺、舌下腺、頜下腺）是否需特殊處理也需要明確。另外，放射線對不同患者造成的損傷與諸多因素有關，如放射劑量、放射部位、放射方案、患者年齡等。因此，如何提高治療精確性和個性化是未來研究重點。
理論上，涎腺組織來源的干/祖細胞和非涎腺組織來源的干/祖細胞可用于重建涎腺組織的功能和修復周圍微環境的各種紊亂，各種干細胞的旁分泌功能在放療后的修復中發揮重要作用，生物活性支架的發展也有助于體外成功構建具有分支結構、能發揮分泌功能的涎腺類器官，這些都將為放療后涎腺功能障礙的恢復提供更多治療方法。
頭頸部惡性腫瘤放射治療會導致涎腺功能障礙，進而引起多種嚴重口腔疾病，如猖獗齒、吞咽困難等，嚴重影響患者生活質量[1]。目前，涎腺功能障礙主要采用涎液替代物或口腔催涎劑等藥物治療，不僅存在療效短、需要多次長期用藥、存在不可忽視的副作用等問題，最重要的是治療效果與放射后剩余的涎腺細胞數量密切相關[2]。而細胞治療面臨涎腺干/祖細胞提取困難、干細胞移植相關風險較大、存在倫理問題等不足。其他治療方法還包括放療前手術移位放射區相關腺體或使用放射保護劑，或采用更先進的適形調強放療法；但前者是一種有創操作，后者雖提高了放射治療精準度，可能恢復部分涎腺功能，但頜面部腺體功能損傷難以避免。鑒于此，尋找一種更可行的治療涎腺功能障礙方法具有重要臨床意義。現對近年國內外有關放射治療后涎腺功能障礙治療方法的研究進展作一綜述，以期為相關研究提供參考。
1 利用來自涎腺的成體干細胞進行細胞治療
有研究發現適形調強放療法治療后部分涎腺受損的功能可出現自發恢復，提示涎腺中可能存在成體干細胞[3]。為此，學者們進行了大量研究。2008 年，Lombaert 等[4] 分離小鼠下頜下腺（subman-dibular glands，SMG）并體外培養涎腺微球體，發現其中含有表達干細胞標記物 Sca-1、c-Kit、Musashi-1 的細胞，而且形態學和功能分析表明這些細胞能分化成涎腺導管細胞和分泌黏蛋白及淀粉酶的腺泡細胞；進一步將少量 c-Kit+ 細胞注射至動物腺體內后發現，涎腺形態和功能得到長期恢復，而且在受體涎腺中能分離出供體來源干細胞，這些干細胞傳至第 2 代時可自發形成三維立體微球體結構，體內移植后能緩解放射損傷。之后，Feng 等[5] 分離人腮腺和 SMG 細胞也獲得同樣結果。Feng 等將不同來源分離獲得的細胞進行體外培養后發現，均含有 c-Kit 標記陽性、可獨立擴增并分化的干細胞群。Gorjup 等[6] 認為在涎腺腺泡和導管之間存在一種可分化為腺泡細胞和導管細胞的成體干細胞。這些研究均表明動物和人涎腺中包含干/祖細胞，將其移植至宿主腺體內可以維持自身多向分化能力，并分化成多種特異性涎腺細胞類型。
涎腺干細胞移植修復受損涎腺功能不僅與移植的干/祖細胞有關，還與涎腺中存留的自體干/祖細胞有關。放射線會導致體內的干/祖細胞休眠，但這些細胞能被局部活化因素所激活[7-8]，如各種生物因子和信號通路蛋白等。因此，若給予合適的刺激并且移植區域又存在休眠的干/祖細胞，細胞治療則能獲得較好的局部治療效果。另外，有研究表明涎腺干細胞在涎腺中的分布具有區域特異性，在放射區域中排除含有干/祖細胞的特定區域（如副腮腺靠近主導管和排泄管區域），將大大提高涎腺的再生能力，降低放療后口干癥的風險[9]，有望成為防治口干癥的有效方法。
在有關 c-Kit 標記陽性的細胞群體是否具有與體內相同增殖分化能力的研究中，各種 Kit+ 細胞，如 Kit+CD24+、Kit+CD49f+、Kit+CD24+Sca1+，被逐漸發現具有干/祖細胞潛能，其中 Kit+CD24+（CD49f+/Sca1+）的潛能最大[10-11]。但是涎腺干/祖細胞是否具有其他蛋白標記物，需要進一步研究[10-13]。有研究分離了人小涎腺組織中上皮干/祖細胞和 MSCs，并成功混合培養成生物工程化涎腺，體內移植后觀察到導管分支樣結構的形成，這為涎腺組織特異性干細胞恢復涎腺功能障礙的研究開辟了新思路[14]。該研究中涎腺上皮干細胞高表達 CD29 和 CD49f，涎腺 MSCs 高表達 CD29、CD73、CD90、CD44、CD105 和 CD166。
但涎腺 MSCs 恢復涎腺功能的研究仍存在諸多難題，如頭頸部惡性腫瘤患者涎腺 MSCs 較少，提示利用此類患者活檢標本構建疾病模型或培養放射治療后用于再生治療的涎腺干/祖細胞時，患者年齡是必要考慮因素[5]。臨床上可能需要更多的干/祖細胞來恢復涎腺功能，目前研究表明[15] 使用生長因子或乙醛脫氫酶 3 來增加體外 c-Kit+ 細胞數量可行，但面臨兩大難題：一是人涎腺再生和功能重建所需細胞數量不確定，二是活檢來源細胞體外培養壽命有限。冷藏涎腺 MSCs 以保持其基因穩定性和分泌功能，從而提高體外培養壽命的方法，可能用于基于成體干細胞移植的涎腺再生療法[16]。
2 其他組織來源的干細胞在細胞治療中的應用
目前，已有大量利用骨髓基質干細胞、骨髓間充質干細胞、人脂肪來源 MSCs、羊膜細胞、胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）、誘導型多潛能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）等干細胞進行細胞治療并恢復放射性涎腺損傷的研究。有研究在體外觀察到骨髓間充質干細胞向涎腺腺泡細胞轉化[17]；雙室共培養人羊膜上皮細胞與腺泡細胞可得到高表達淀粉酶的腺泡樣細胞，并能改善輻射損傷小鼠唾液腺組織的功能[18]。但以上研究所采用的干細胞在體內的具體作用機制尚不清楚，可能是通過旁分泌的促增殖和促分化作用，促進剩余涎腺中功能細胞的恢復或干/祖細胞的激活[19]，目前已明確了若干可能相關的信號通路。研究表明，角質細胞生長因子或 FGF-7 能夠增加放射模型體內涎腺干/祖細胞數量[20]，Wnt/β-catenin[21]、Notch 信號通路[22] 和 SHH[23] 信號分子也被發現具有相似功能，EGF、IGF-1、FGF-2[24]、IL-6[25]、EDA/EDAR 活化因子[26] 都能減少細胞凋亡，促進細胞增殖。
鑒于上述干細胞可能不會有效分化為涎腺細胞，其他干/祖細胞類型如 ESCs 和 iPSCs 可能作為一種新的細胞來源，已有研究將小鼠 ESCs 和人涎腺來源成纖維細胞三維共培養，結果發現 ESCs 向涎腺細胞轉化且涎腺相關標記物表達增多，體內移植后發現新生涎腺組織[27]。但這種重建組織功能的機制尚未明確。iPSCs 和 EPCs 類似，具有多向分化潛能，但是 iPSCs 的優勢更突出，它們可以利用成人的細胞培養獲得，避免用人類胚胎存在的倫理問題；另外，iPSCs 可從罹患疾病的患者提取組織或細胞進行培養獲得，可根據患者基因，利用其病變組織發育成特定細胞系，設計“個性化”治療方案[28]，最大程度減輕免疫排斥反應。因此，在進一步評估 ESCs 和 iPSCs 形成涎腺細胞的基因組穩定性和致瘤性等問題后，其有望成為細胞療法治療涎腺放射性功能損傷的細胞來源[29]。
值得注意的是，組織和器官不是從單一一種干細胞發育而來，因此利用這種干細胞分化方法可能與體內器官發生、發育過程背道而馳。如 ESCs 形成的極化大腦皮質樣組織具有和真實大腦相同的分層結構和胚層特異性神經元的分化，但其體外胚層形成的過程卻與體內觀察完全相反[30]。因此，如何運用各種組織來源的干/祖細胞需要進一步研究。
3 利用組織工程技術構建涎腺類器官
類器官是指在結構和功能上類似于來源器官或組織的微小器官。Lancaster 等[31] 認為類器官是源于多能干細胞或器官祖細胞，包含目標器官中至少一種細胞類型，能夠自組裝為器官樣結構，具有其生理結構和功能特征，并且具有胚層特異性的擬器官體。在類器官形成過程中，自組裝是關鍵。自組裝是指在無外力干預條件下，干細胞或多細胞依靠各組分間的相互作用自我分化為多種結構的過程，這一過程依賴生理性的內源機制自發產生。比如在胚胎鼠唾液腺上皮細胞的三維培養中可見自發形成的分支樣或芽狀結構[32]，這依賴于細胞與基質間以及細胞與細胞間包括多種細胞因子及信號通路的共同參與。而且這一內源機制并非固定不變，時間、空間的變化都增加了其復雜性和多樣性。類器官培養是一種三維培養，現在已構建成功的三維類器官培養實例很多，如結腸、前列腺、肝臟、心臟、胰腺、視網膜、乳腺、腦垂體、腦、肺等。部分已應用于臨床細胞治療或損傷修復等，以及用于藥物篩選、組織再生和疾病建模等方面研究[33]。
利用組織工程技術構建涎腺類器官需要 3 個重要組成成分：細胞與細胞間的接觸、細胞與細胞外基質（extracellular matrix，ECM）成分的接觸，以及能使上述兩種物質更好發揮作用的活性三維支架。理想情況下，組織工程支架應與人或動物涎腺組織的 ECM 結構相似，并具備其最基本功能。ECM 的不同成分能夠不同程度地影響細胞分化、管腔形成和基底膜上緊密結合結構的形成。如高鈣條件（0.5 mmol/L）有利于腺泡發育和腺泡腔的形成[34]；在不含 ECM 多肽，只含有氨基酸的水凝膠中很難觀察到涎腺細胞的形成，但在涂布了纖維連接蛋白的天然絲綢上黏蛋白分泌細胞的生長壽命達 1 個月以上[35]。目前，ECM 在組織形成和細胞分化過程中的積極作用與組織特異性的關系仍不清楚。有研究利用胚胎干細胞誘導得到胰腺祖細胞系，將不同發育時期的間充質（間葉組織、間質組織）與其共培養，發現器官類型匹配的間充質可使祖細胞擴增、自我更新同時保持不分化狀態，并且能使祖細胞在擴增 100 萬倍以上同時，依然保留其分化能力[36]。還有研究用肝特異性 ECM 結合肝素化透明質酸（hyaluronic acid，HA）水凝膠后促進人肝臟細胞的體外擴增[37]。這些研究結果均提示組織特異性 ECM 在細胞生存微環境方面具備某些特殊屬性。關于組織特異性 ECM 還有另外一個值得探討的問題，即其能否傳遞與發育階段有關的特異性再生信號，有待研究者進一步研究明確。
生物支架包括天然材料和人工合成材料。天然材料包括含膠原蛋白和纖維蛋白等的 ECM、絲綢、殼聚糖、藻酸鹽、HA 等，人工合成材料包括聚乙醇酸、聚乳酸、聚乳酸-羥基乙酸（polylactic-co-glycolic cid，PLGA）共聚物、聚乙二醇等。大量研究表明，不同支架成分和結構對細胞分化和組織特異結構的形成有不同作用。例如，PLGA 納米纖維結合層粘連蛋白 111 后能促進涎腺細胞緊密連接和管腔的形成，但結合殼聚糖時則會拮抗這種作用[38]；人涎腺細胞包埋至包含 PlnDIV 肽的 HA 水凝膠中后能夠組裝成微球體，該微球體包含中間為管腔的大型腺泡樣結構[39]。在涎腺分支和導管結構形成方面，不同生物支架成分及結構的不同作用更加明顯。例如，天然殼聚糖能通過調節基底膜的成分來加強分支[40]，在Ⅰ型膠原蛋白或基質膠上能構建各種分支狀的類器官[41]。但值得注意的是，來源于小鼠肉瘤細胞的基質膠中包含異種成分，可能增加致瘤性等不確定風險，因而利用本體器官特異性或組織特異性 ECM 支架成為一種相對較安全的替代方案。目前，已有學者在全器官脫細胞 SMG 支架上接種大鼠原代 SMG 細胞，掃描電鏡觀察發現脫細胞的 SMG 支架能夠支持 SMG 細胞黏附，形成極化管腔，免疫熒光染色顯示多種分化標記物表達，表明全器官脫細胞化 ECM 可能作為涎腺組織工程化再生的支架材料[42]。生物支架的性質，如機械及化學特性也會影響其作用的發揮。如精細的微觀結構能夠模擬基底膜的物理特性，增加表面接觸，形成極化更好的管腔和分化良好的涎腺上皮細胞[43]；生物可降解性和多孔性、硬度、強度等均可影響支架對細胞黏附、遷移和分化的作用[44]。有研究表明，基底膜 ROCK1/PAR-1b 依賴的調控方式對協調 SMG 發育過程中的組織極化和結構加工有重要意義[45]，但該研究未實現信號通路分子的動態釋放。目前有研究者在仿生聚乙二醇水凝膠上合成了一種可人工控制梯度的特殊蛋白質[46]；新型數字化微流體平臺動態交換流體也可實現信號分子的三維調控[47]。隨著這些技術的發展，生物支架在涎腺組織再生中作用及機制中的研究將進一步深入。
近期，在利用組織工程方法體外構建涎腺類器官修復臨床放療后頜面部腺體功能障礙的研究已取得了一些進展。有學者分離單一 c-Kit+ 人涎腺干細胞并接種于立體基質膠 Matrigel 上，發現這種細胞可體外擴增并分化為含有多種細胞類型的涎腺類器官，進一步體內實驗表明這種涎腺類器官異種移植后可長期存活并保留涎腺特有分泌功能，也能改善受體動物的唾液分泌量，促進受體動物涎腺功能的恢復[48]。這為涎腺干細胞標記、干細胞體外構建涎腺類器官方法及其形態和功能評估的進一步研究奠定了基礎。
目前，提高類器官中干細胞的傳代能力并保留涎腺的分泌功能仍是需要解決的問題；如何提高血供供應率、恢復神經支配的調節和利用生物支架增強與宿主的聯系，也有待繼續研究；來源于人正常涎腺組織的類器官中是否存在具有干細胞特性的細胞，何種蛋白標記物能夠理想地標記涎腺干細胞，類器官三維培養技術能否獲得數量足夠且有理想增殖和分化能力的干細胞來構建人工化涎腺等問題，都有待于進一步研究明確。
4 挑戰與前景
近年，治療涎腺功能障礙的方法發展迅速，但每種方法都各有其不足。實現由動物實驗向人體試驗的轉化，并理解動物和人體來源的涎腺干祖細胞對放射線損傷產生不同反應的機制是一項重要挑戰；臨床治療中不同種類的涎腺（腮腺、舌下腺、頜下腺）是否需特殊處理也需要明確。另外，放射線對不同患者造成的損傷與諸多因素有關，如放射劑量、放射部位、放射方案、患者年齡等。因此，如何提高治療精確性和個性化是未來研究重點。
理論上，涎腺組織來源的干/祖細胞和非涎腺組織來源的干/祖細胞可用于重建涎腺組織的功能和修復周圍微環境的各種紊亂，各種干細胞的旁分泌功能在放療后的修復中發揮重要作用，生物活性支架的發展也有助于體外成功構建具有分支結構、能發揮分泌功能的涎腺類器官，這些都將為放療后涎腺功能障礙的恢復提供更多治療方法。