引用本文： 黃信隆, 張威, 苗藝繽, 夏華寬, 王超, 王友文. D980-nm 半導體激光對大鼠皮膚溶脂嫩膚作用機制初步研究. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(2): 235-239. doi: 10.7507/1002-1892.201610012 復制
臨床應用顯示，激光在脂肪溶脂、改善瘢痕和治療光老化方面有一定效果[1-4]。D980-nm 半導體激光溶脂嫩膚技術因具有療效確切、副作用小等明顯優勢，成為目前激光溶脂嫩膚治療的重要方法之一。但目前對于該種激光嫩膚作用機制的研究甚少，關于其組織效應和細胞效應等方面的研究分析國內外鮮有報道。膠原纖維是組成皮膚真皮的主要結構，是評價嫩膚效果的重要指標[5]。真皮厚度改變和膠原蛋白再生密切相關，也是評價嫩膚效果的重要指標[6-8]。膠原蛋白由成纖維細胞合成分泌，后者是皮膚真皮網織層中最主要細胞，并對組織缺損修復有重要功能[9]。TGF-β1 和 bFGF 是促使成纖維細胞增殖分裂的重要細胞因子[10]。本研究采用 D980-nm 半導體激光對 SD 大鼠皮膚進行不同頻次治療后，比較分析大鼠皮膚組織結構、真皮厚度、成纖維細胞數量、TGF-β1 和 bFGF 細胞因子等方面的變化情況，初步探討 D980-nm 半導體激光溶脂嫩膚的作用機制。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
12～14 月齡清潔級雄性 SD 大鼠 18 只，體質量 400～450 g，由佳木斯大學動物實驗中心提供，室內溫度 20～25 ℃ 正常分籠飼養。一抗兔抗人 TGF-β1 多克隆抗體（1∶100）、bFGF 多克隆抗體（1∶100）、SABC 檢測試劑盒、DAB 顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。D980-nm 半導體激光治療儀（CERAMOPTECGMBH 公司，德國）；光學顯微鏡（Leica 公司，德國）。
1.2 實驗分組及方法
將 18 只 SD 大鼠隨機分為 3 組（n=6）；以大鼠脊柱為界分為左右兩個對稱區域，脊柱左側皮膚作為激光照射實驗側（分別為 A、B、C 組），脊柱右側皮膚作為自身正常對照側（分別為 A1、B1、C1 組）。各組大鼠腹腔注射 10% 水合氯醛溶液（300 mg/kg）麻醉后，脊柱左、右側對應區域常規脫毛，每側暴露面積為 4 cm × 4 cm，聚維酮碘消毒，碳素墨水標記實驗區域邊緣。標記區域皮下充分浸潤麻醉，麻醉液為含 2% 利多卡因注射液 50 mL、腎上腺素注射液 1 mg、5% 碳酸氫鈉注射液 10 mL 的 0.9% 氯化鈉注射液 1 000 mL。調節 D980-nm 半導體激光治療儀設定為脈沖模式，能量密度 20 J/cm2，功率 8 W，脈沖寬度 20 ms，脈沖頻率 40 Hz，皮下照射實驗側皮膚，每次照射光斑部分重疊約 20%，A、B、C 組分別照射 1、2、3 次作為 1 個療程，每次間隔 5 min；每個療程間隔 1 周，共 4 個療程。第 4 個療程結束后 1 周取材行以下觀測。A1、B1、C1 組不作激光處理，作為自身對照。
實驗側照射操作步驟：在實驗區域左下角作一直徑為 1 mm 的圓形切口，將激光治療儀光纖探頭套入金屬導管內，再將金屬導管穿過切口進入實驗區域皮下脂肪組織（借助超聲引導光纖探頭鎖定目標實驗位置，根據 HeNe 紅色光確定光纖尖端所在層次）。明確位置準確后發射激光，緩慢均勻移動金屬導管，以 1 cm/s 速度作回退式扇形照射，作用于皮膚真皮層和皮下脂肪層。照射期間用手持式紅外測溫槍監測大鼠皮膚體表溫度，體溫要求低于 42℃。照射后大鼠背部皮膚均勻涂抹冷凝膠。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況 觀察實驗期間大鼠存活情況、背部皮膚變化等。
1.3.2 組織學觀察 第 4 個療程結束后 1 周，引頸處死全部大鼠，同上法背部脫毛后，用組織剪剪下標記區域的皮膚組織塊，大小為 1.0 cm × 1.0 cm × 0.5 cm，置于 10% 中性甲醛固定 48 h 后，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片，片厚 5 μm。取部分組織切片常規行 HE 染色。① 光鏡下觀察皮膚組織結構變化，以及脂肪組織內脂肪細胞、膠原纖維、血管變化等。② 于 100 倍鏡下，每組取 6 張切片，每張切片隨機取 5 個視野測量真皮厚度。具體方法：用目鏡測微尺測量表皮和真皮連接處至皮下組織的格數，每格 50 μm，按以下公式計算真皮厚度：真皮厚度 = 格數 × 50 μm/10。③ 于 400 倍鏡下，每組取 6 張切片，每張切片隨機取 5 個視野計數成纖維細胞，取均值。
1.3.3 免疫組織化學染色觀察 TGF-β1 及 bFGF 表達 取其余切片，采用 SABC 法按照免疫組織化學染色試劑盒說明書進行染色觀察，以真皮成纖維細胞或巨噬細胞的細胞質、細胞膜中呈黃色或黃褐色著色作為陽性表達。于 400 倍鏡下，每組隨機選擇 6 張切片，每張切片隨機取 5 個視野計數陽性細胞，取均值。
1.4 統計學方法
采用 SPSS21.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 Scheffe 檢驗；實驗組與自身對照組間比較采用配對t 檢驗；檢驗水準α = 0.05。
2 結果
2.1 一般情況
大鼠均存活至實驗完成。A、B、C 組照射后皮膚表皮無水皰、瘢痕和紫癜等發生；B、C 組中各 1 只大鼠皮膚在第 3 個療程結束后第 2 天出現少量紅斑，之后逐漸吸收淡化，1 周后皮膚恢復正常；其余大鼠無明顯變化。
2.2 組織學觀察
2.2.1 鏡下觀察 A1、B1、C1 組鏡下觀察均一致，皮膚表皮及真皮層較薄，在真皮及皮下組織層中，脂肪細胞較多，膠原纖維較少，分散排列于真皮層中，且纖維之間空隙較大。A 組：與 A1 組比較，脂肪細胞減少，成纖維細胞增多，膠原纖維束增多，纖維束空隙縮小，但排列雜亂；B 組：與 B1 組比較，表皮、真皮均增加，脂肪細胞減少，真皮層血管壁增厚，膠原纖維束增多、增粗，部分纖維束呈平行排列，成纖維細胞增多；C 組：與 C1 組比較，表皮、真皮明顯增厚，脂肪細胞少，真皮層血管增多，且血管壁增厚，膠原纖維束明顯增多，纖維束粗大且排列致密、整齊有序，成纖維細胞明顯增多。見圖 1。
圖1
各組組織學觀察 (HE×100) a. A 組； b.B 組； c. C 組； d. C1 組
Figure1.
Histological observation of skin tissue in each group (HE×100) a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group C1
2.2.2 真皮厚度比較 A、B、C 組真皮厚度分別為（817.42±23.09）、（856.51±27.34）、（878.94±25.39）μm，與對應 A1、B1、C1 組（778.94±13.56）、（781.75±14.81）、（775.70±13.20）μm 相比，均明顯增加，差異有統計學意義（t=9.097，P=0.000；t=12.602，P=0.000；t=22.247，P=0.000）。隨激光治療頻次的增加，A、B、C 組真皮厚度逐漸增加，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.2.3 成纖維細胞計數比較 A、B、C 組成纖維細胞計數分別為（117.17±11.42）、（144.96±17.05）、（164.08±9.86）個，與對應 A1、B1、C1 組（98.71±12.45）、（103.84±13.78）、（102.04±11.25）個相比，均明顯增多，差異均有統計學意義（t=5.724，P=0.000；t=12.286，P=0.000；t=21.097，P=0.000）。隨激光治療頻次增加，A、B、C 組成纖維細胞計數逐漸增多，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.3 免疫組織化學染色觀察
2.3.1 鏡下觀察 A1、B1、C1 組鏡下觀察均一致，皮膚中 TGF-β1、bFGF 幾乎不表達；A、B、C 組皮膚真皮層中陽性表達明顯，主要表達于成纖維細胞或巨噬細胞的細胞質、細胞膜中，皮膚附件毛囊、分泌腺上皮細胞中可見少許陽性細胞，且陽性表達區成纖維細胞明顯增多。隨激光治療頻次增加，A、B、C 組 TGF-β1、bFGF 陽性細胞逐漸增加。見圖 2、3。
圖2
各組 TGF-β1 免疫組織化學染色觀察 (SABC × 400) a. A 組； b.B 組； c. C 組； d. C1 組
Figure2.
Expression of TGF-β1 in skin tissue (SABC × 400) a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group C1
圖3
各組 bFGF 免疫組織化學染色觀察 (SABC × 400） a. A 組； b.B 組； c. C 組； d. C1 組
Figure3.
Expression of bFGF in skin tissue (SABC × 400) a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group C1
2.3.2 TGF-β1、bFGF 表達比較 A、B、C 組 TGF-β1 陽性細胞數分別為（5.42±1.07）、（15.59±2.54）、（18.73±1.67）個，與對應 A1、B1、C1 組（3.77±1.01）、（4.37±1.34）、（4.02±1.02）個相比，均明顯增加，比較差異均有統計學意義（t=6.936，P=0.000；t=20.661，P=0.000；t=37.282，P=0.000）。隨激光治療頻次增加，A、B、C 組 TGF-β1 陽性細胞數逐漸增加，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
A、B、C 組 bFGF 陽性細胞數分別為（7.71±1.56）、（19.12±3.38）、（25.80±1.44）個，與對應 A1、B1、C1 組（4.93±1.37）、（5.16±1.63）、（5.25±1.27）個相比，均明顯增加，差異均有統計學意義（t=6.300，P=0.000；t=18.687，P=0.000；t=55.874，P=0.000）。隨激光治療頻次增加，A、B、C 組 bFGF 陽性細胞數逐漸增加，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
3 討論
膠原纖維是皮膚真皮的主要結構物質，占皮膚干重的 80%，它確定了皮膚的強度和形態[5]。年輕人群皮膚真皮細胞外基質由完整且排列致密有序的膠原纖維束構成，而光老化和老年人群皮膚真皮細胞外基質由破碎、松散、錯亂的膠原纖維束組成[11]。本研究通過 HE 染色觀察了 D980-nm 半導體激光照射對大鼠皮膚膠原纖維數量、排列和結構改變的影響，發現激光照射后皮膚組織膠原纖維束增多、變粗，排列致密且整齊，與表皮平行分布。提示這種激光治療可以改善大鼠皮膚組織結構形態，尤其是膠原纖維組織結構。
成纖維細胞根據不同功能狀態，可分為成纖維細胞和纖維細胞。成纖維細胞功能活躍，具有分泌和合成膠原蛋白功能，在一定條件下可以與纖維細胞轉變，此外還可以修復組織缺損。本研究中，D980-nm 半導體激光照射后，大鼠實驗側皮膚組織中成纖維細胞數量顯著增多，結合鏡下見膠原纖維束增加，提示激光可能刺激停止的纖維細胞活化為活躍的成纖維細胞，促使大量成纖維細胞增殖，從而合成膠原蛋白，這與 Smithmyer 等[12] 及 Zuo 等[13] 研究結果一致。
真皮組織主要成分為膠原蛋白，真皮厚度變化與膠原蛋白沉積、結構重組等相關，是評價皮膚改善效果的重要指標。Fournier 等[14] 發現 1540-nm 激光嫩膚治療后真皮增厚，提出真皮厚度增加受膠原纖維合成影響的設想。本研究定量分析了不同治療頻次激光照射對大鼠皮膚真皮厚度變化的影響，結果顯示，不同治療頻次激光治療后大鼠皮膚真皮均不同程度增厚，說明 D980-nm 半導體激光對改善皮膚有效，結合組織學染色中觀察到的膠原纖維含量增加，說明激光治療后大鼠皮膚組織中膠原纖維分泌合成增多，使真皮厚度增加。
TGF-β1 可促進成纖維細胞活化增殖，并能刺激成纖維細胞產生膠原等基質，從而導致細胞外基質沉積[10]。TGF-β1 還是Ⅰ型前膠原形成的主要調節因子，它可強烈促進Ⅰ型前膠原蛋白合成，刺激纖維連接素形成，為膠原的蓄積提供網絡[15-16]。bFGF 能夠顯著促進成纖維細胞和血管內皮細胞分裂增殖，且局部創傷時bFGF會增多，誘導炎性細胞、血管內皮細胞、成纖維細胞等向創傷部位移動，促進肉芽組織形成和組織修復[17-18]。研究顯示，bFGF 能促進成纖維細胞轉移和刺激其產生膠原酶，并合成多類基質[19-20]。激光的光熱效應使皮膚瞬間溫度增高，產生熱損傷并發動創傷修復響應，釋放 TGF-β1、bFGF 等細胞因子，促進真皮膠原新生，并刺激成纖維細胞活化增殖合成新膠原。本研究實驗大鼠經 D980-nm 半導體激光皮下照射后，皮膚組織中成纖維細胞增加，TGF-β1 和 bFGF 表達陽性細胞增多，與既往研究[19-22] 結果一致。
綜上述，D980-nm 半導體激光治療對大鼠皮膚有明顯溶脂嫩膚作用，并與激光治療頻次密切相關，且其溶脂嫩膚作用與激光的組織效應和細胞效應相關。下一步我們將對 D980-nm 半導體激光對體外成纖維細胞和 SMAD、ERK 等細胞信號通路的影響進行深入研究，進一步探討 D980-nm 半導體激光溶脂嫩膚技術的作用機制，為臨床皮膚重塑治療提供理論依據。
臨床應用顯示，激光在脂肪溶脂、改善瘢痕和治療光老化方面有一定效果[1-4]。D980-nm 半導體激光溶脂嫩膚技術因具有療效確切、副作用小等明顯優勢，成為目前激光溶脂嫩膚治療的重要方法之一。但目前對于該種激光嫩膚作用機制的研究甚少，關于其組織效應和細胞效應等方面的研究分析國內外鮮有報道。膠原纖維是組成皮膚真皮的主要結構，是評價嫩膚效果的重要指標[5]。真皮厚度改變和膠原蛋白再生密切相關，也是評價嫩膚效果的重要指標[6-8]。膠原蛋白由成纖維細胞合成分泌，后者是皮膚真皮網織層中最主要細胞，并對組織缺損修復有重要功能[9]。TGF-β1 和 bFGF 是促使成纖維細胞增殖分裂的重要細胞因子[10]。本研究采用 D980-nm 半導體激光對 SD 大鼠皮膚進行不同頻次治療后，比較分析大鼠皮膚組織結構、真皮厚度、成纖維細胞數量、TGF-β1 和 bFGF 細胞因子等方面的變化情況，初步探討 D980-nm 半導體激光溶脂嫩膚的作用機制。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
12～14 月齡清潔級雄性 SD 大鼠 18 只，體質量 400～450 g，由佳木斯大學動物實驗中心提供，室內溫度 20～25 ℃ 正常分籠飼養。一抗兔抗人 TGF-β1 多克隆抗體（1∶100）、bFGF 多克隆抗體（1∶100）、SABC 檢測試劑盒、DAB 顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。D980-nm 半導體激光治療儀（CERAMOPTECGMBH 公司，德國）；光學顯微鏡（Leica 公司，德國）。
1.2 實驗分組及方法
將 18 只 SD 大鼠隨機分為 3 組（n=6）；以大鼠脊柱為界分為左右兩個對稱區域，脊柱左側皮膚作為激光照射實驗側（分別為 A、B、C 組），脊柱右側皮膚作為自身正常對照側（分別為 A1、B1、C1 組）。各組大鼠腹腔注射 10% 水合氯醛溶液（300 mg/kg）麻醉后，脊柱左、右側對應區域常規脫毛，每側暴露面積為 4 cm × 4 cm，聚維酮碘消毒，碳素墨水標記實驗區域邊緣。標記區域皮下充分浸潤麻醉，麻醉液為含 2% 利多卡因注射液 50 mL、腎上腺素注射液 1 mg、5% 碳酸氫鈉注射液 10 mL 的 0.9% 氯化鈉注射液 1 000 mL。調節 D980-nm 半導體激光治療儀設定為脈沖模式，能量密度 20 J/cm2，功率 8 W，脈沖寬度 20 ms，脈沖頻率 40 Hz，皮下照射實驗側皮膚，每次照射光斑部分重疊約 20%，A、B、C 組分別照射 1、2、3 次作為 1 個療程，每次間隔 5 min；每個療程間隔 1 周，共 4 個療程。第 4 個療程結束后 1 周取材行以下觀測。A1、B1、C1 組不作激光處理，作為自身對照。
實驗側照射操作步驟：在實驗區域左下角作一直徑為 1 mm 的圓形切口，將激光治療儀光纖探頭套入金屬導管內，再將金屬導管穿過切口進入實驗區域皮下脂肪組織（借助超聲引導光纖探頭鎖定目標實驗位置，根據 HeNe 紅色光確定光纖尖端所在層次）。明確位置準確后發射激光，緩慢均勻移動金屬導管，以 1 cm/s 速度作回退式扇形照射，作用于皮膚真皮層和皮下脂肪層。照射期間用手持式紅外測溫槍監測大鼠皮膚體表溫度，體溫要求低于 42℃。照射后大鼠背部皮膚均勻涂抹冷凝膠。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況 觀察實驗期間大鼠存活情況、背部皮膚變化等。
1.3.2 組織學觀察 第 4 個療程結束后 1 周，引頸處死全部大鼠，同上法背部脫毛后，用組織剪剪下標記區域的皮膚組織塊，大小為 1.0 cm × 1.0 cm × 0.5 cm，置于 10% 中性甲醛固定 48 h 后，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片，片厚 5 μm。取部分組織切片常規行 HE 染色。① 光鏡下觀察皮膚組織結構變化，以及脂肪組織內脂肪細胞、膠原纖維、血管變化等。② 于 100 倍鏡下，每組取 6 張切片，每張切片隨機取 5 個視野測量真皮厚度。具體方法：用目鏡測微尺測量表皮和真皮連接處至皮下組織的格數，每格 50 μm，按以下公式計算真皮厚度：真皮厚度 = 格數 × 50 μm/10。③ 于 400 倍鏡下，每組取 6 張切片，每張切片隨機取 5 個視野計數成纖維細胞，取均值。
1.3.3 免疫組織化學染色觀察 TGF-β1 及 bFGF 表達 取其余切片，采用 SABC 法按照免疫組織化學染色試劑盒說明書進行染色觀察，以真皮成纖維細胞或巨噬細胞的細胞質、細胞膜中呈黃色或黃褐色著色作為陽性表達。于 400 倍鏡下，每組隨機選擇 6 張切片，每張切片隨機取 5 個視野計數陽性細胞，取均值。
1.4 統計學方法
采用 SPSS21.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 Scheffe 檢驗；實驗組與自身對照組間比較采用配對t 檢驗；檢驗水準α = 0.05。
2 結果
2.1 一般情況
大鼠均存活至實驗完成。A、B、C 組照射后皮膚表皮無水皰、瘢痕和紫癜等發生；B、C 組中各 1 只大鼠皮膚在第 3 個療程結束后第 2 天出現少量紅斑，之后逐漸吸收淡化，1 周后皮膚恢復正常；其余大鼠無明顯變化。
2.2 組織學觀察
2.2.1 鏡下觀察 A1、B1、C1 組鏡下觀察均一致，皮膚表皮及真皮層較薄，在真皮及皮下組織層中，脂肪細胞較多，膠原纖維較少，分散排列于真皮層中，且纖維之間空隙較大。A 組：與 A1 組比較，脂肪細胞減少，成纖維細胞增多，膠原纖維束增多，纖維束空隙縮小，但排列雜亂；B 組：與 B1 組比較，表皮、真皮均增加，脂肪細胞減少，真皮層血管壁增厚，膠原纖維束增多、增粗，部分纖維束呈平行排列，成纖維細胞增多；C 組：與 C1 組比較，表皮、真皮明顯增厚，脂肪細胞少，真皮層血管增多，且血管壁增厚，膠原纖維束明顯增多，纖維束粗大且排列致密、整齊有序，成纖維細胞明顯增多。見圖 1。
圖1
各組組織學觀察 (HE×100) a. A 組； b.B 組； c. C 組； d. C1 組
Figure1.
Histological observation of skin tissue in each group (HE×100) a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group C1
2.2.2 真皮厚度比較 A、B、C 組真皮厚度分別為（817.42±23.09）、（856.51±27.34）、（878.94±25.39）μm，與對應 A1、B1、C1 組（778.94±13.56）、（781.75±14.81）、（775.70±13.20）μm 相比，均明顯增加，差異有統計學意義（t=9.097，P=0.000；t=12.602，P=0.000；t=22.247，P=0.000）。隨激光治療頻次的增加，A、B、C 組真皮厚度逐漸增加，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.2.3 成纖維細胞計數比較 A、B、C 組成纖維細胞計數分別為（117.17±11.42）、（144.96±17.05）、（164.08±9.86）個，與對應 A1、B1、C1 組（98.71±12.45）、（103.84±13.78）、（102.04±11.25）個相比，均明顯增多，差異均有統計學意義（t=5.724，P=0.000；t=12.286，P=0.000；t=21.097，P=0.000）。隨激光治療頻次增加，A、B、C 組成纖維細胞計數逐漸增多，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.3 免疫組織化學染色觀察
2.3.1 鏡下觀察 A1、B1、C1 組鏡下觀察均一致，皮膚中 TGF-β1、bFGF 幾乎不表達；A、B、C 組皮膚真皮層中陽性表達明顯，主要表達于成纖維細胞或巨噬細胞的細胞質、細胞膜中，皮膚附件毛囊、分泌腺上皮細胞中可見少許陽性細胞，且陽性表達區成纖維細胞明顯增多。隨激光治療頻次增加，A、B、C 組 TGF-β1、bFGF 陽性細胞逐漸增加。見圖 2、3。
圖2
各組 TGF-β1 免疫組織化學染色觀察 (SABC × 400) a. A 組； b.B 組； c. C 組； d. C1 組
Figure2.
Expression of TGF-β1 in skin tissue (SABC × 400) a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group C1
圖3
各組 bFGF 免疫組織化學染色觀察 (SABC × 400） a. A 組； b.B 組； c. C 組； d. C1 組
Figure3.
Expression of bFGF in skin tissue (SABC × 400) a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group C1
2.3.2 TGF-β1、bFGF 表達比較 A、B、C 組 TGF-β1 陽性細胞數分別為（5.42±1.07）、（15.59±2.54）、（18.73±1.67）個，與對應 A1、B1、C1 組（3.77±1.01）、（4.37±1.34）、（4.02±1.02）個相比，均明顯增加，比較差異均有統計學意義（t=6.936，P=0.000；t=20.661，P=0.000；t=37.282，P=0.000）。隨激光治療頻次增加，A、B、C 組 TGF-β1 陽性細胞數逐漸增加，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
A、B、C 組 bFGF 陽性細胞數分別為（7.71±1.56）、（19.12±3.38）、（25.80±1.44）個，與對應 A1、B1、C1 組（4.93±1.37）、（5.16±1.63）、（5.25±1.27）個相比，均明顯增加，差異均有統計學意義（t=6.300，P=0.000；t=18.687，P=0.000；t=55.874，P=0.000）。隨激光治療頻次增加，A、B、C 組 bFGF 陽性細胞數逐漸增加，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
3 討論
膠原纖維是皮膚真皮的主要結構物質，占皮膚干重的 80%，它確定了皮膚的強度和形態[5]。年輕人群皮膚真皮細胞外基質由完整且排列致密有序的膠原纖維束構成，而光老化和老年人群皮膚真皮細胞外基質由破碎、松散、錯亂的膠原纖維束組成[11]。本研究通過 HE 染色觀察了 D980-nm 半導體激光照射對大鼠皮膚膠原纖維數量、排列和結構改變的影響，發現激光照射后皮膚組織膠原纖維束增多、變粗，排列致密且整齊，與表皮平行分布。提示這種激光治療可以改善大鼠皮膚組織結構形態，尤其是膠原纖維組織結構。
成纖維細胞根據不同功能狀態，可分為成纖維細胞和纖維細胞。成纖維細胞功能活躍，具有分泌和合成膠原蛋白功能，在一定條件下可以與纖維細胞轉變，此外還可以修復組織缺損。本研究中，D980-nm 半導體激光照射后，大鼠實驗側皮膚組織中成纖維細胞數量顯著增多，結合鏡下見膠原纖維束增加，提示激光可能刺激停止的纖維細胞活化為活躍的成纖維細胞，促使大量成纖維細胞增殖，從而合成膠原蛋白，這與 Smithmyer 等[12] 及 Zuo 等[13] 研究結果一致。
真皮組織主要成分為膠原蛋白，真皮厚度變化與膠原蛋白沉積、結構重組等相關，是評價皮膚改善效果的重要指標。Fournier 等[14] 發現 1540-nm 激光嫩膚治療后真皮增厚，提出真皮厚度增加受膠原纖維合成影響的設想。本研究定量分析了不同治療頻次激光照射對大鼠皮膚真皮厚度變化的影響，結果顯示，不同治療頻次激光治療后大鼠皮膚真皮均不同程度增厚，說明 D980-nm 半導體激光對改善皮膚有效，結合組織學染色中觀察到的膠原纖維含量增加，說明激光治療后大鼠皮膚組織中膠原纖維分泌合成增多，使真皮厚度增加。
TGF-β1 可促進成纖維細胞活化增殖，并能刺激成纖維細胞產生膠原等基質，從而導致細胞外基質沉積[10]。TGF-β1 還是Ⅰ型前膠原形成的主要調節因子，它可強烈促進Ⅰ型前膠原蛋白合成，刺激纖維連接素形成，為膠原的蓄積提供網絡[15-16]。bFGF 能夠顯著促進成纖維細胞和血管內皮細胞分裂增殖，且局部創傷時bFGF會增多，誘導炎性細胞、血管內皮細胞、成纖維細胞等向創傷部位移動，促進肉芽組織形成和組織修復[17-18]。研究顯示，bFGF 能促進成纖維細胞轉移和刺激其產生膠原酶，并合成多類基質[19-20]。激光的光熱效應使皮膚瞬間溫度增高，產生熱損傷并發動創傷修復響應，釋放 TGF-β1、bFGF 等細胞因子，促進真皮膠原新生，并刺激成纖維細胞活化增殖合成新膠原。本研究實驗大鼠經 D980-nm 半導體激光皮下照射后，皮膚組織中成纖維細胞增加，TGF-β1 和 bFGF 表達陽性細胞增多，與既往研究[19-22] 結果一致。
綜上述，D980-nm 半導體激光治療對大鼠皮膚有明顯溶脂嫩膚作用，并與激光治療頻次密切相關，且其溶脂嫩膚作用與激光的組織效應和細胞效應相關。下一步我們將對 D980-nm 半導體激光對體外成纖維細胞和 SMAD、ERK 等細胞信號通路的影響進行深入研究，進一步探討 D980-nm 半導體激光溶脂嫩膚技術的作用機制，為臨床皮膚重塑治療提供理論依據。
