引用本文： 呂翠, 劉倩, 曾現偉. IL-10 基因修飾的 BMSCs 對大鼠腦缺血再灌注損傷炎性因子及神經細胞凋亡的影響. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(2): 240-245. doi: 10.7507/1002-1892.201605095 復制
據報道，腦卒中已升為中國國民第 1 位死因，并且發病年齡呈年輕化趨勢，嚴重威脅國民生命健康和生活質量[1]。其中 80% 腦卒中為缺血性，快速再灌注是缺血性腦卒中重要治療策略，但溶栓治療后出現的缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）會進一步加重原組織損傷，炎癥損傷和凋亡基因激活是導致 IRI 的主要因素[2-3]。研究表明通過抑制炎性反應、小膠質細胞活性，降低梗死病灶周圍炎性介質濃度水平，可以縮小腦梗死體積，顯著改善神經功能[4-5]。
我們前期研究將攜帶 IL-10 基因的腺病毒載體（recombinant adenovirus IL-10，Ad IL-10）轉染至 BMSCs（AdIL-10-BMSCs），并將其移植至大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）缺血 2 h 大鼠模型，結果顯示 AdIL-10-BMSCs 對大鼠大腦 IRI 有保護作用[6]。本實驗旨在進一步觀察移植 AdIL-10-BMSCs 后，大鼠大腦缺血性病灶及周圍組織內小膠質細胞、TNF-α、IL-1β表達變化，以及神經細胞凋亡情況，探討 AdIL-10-BMSCs 對缺血性腦卒中的保護機制。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
清潔級成年 SD 雄性大鼠 45 只，體質量 250～300 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。AdIL-10 由上海吉凱基因技術有限公司提供。BrdU（Sigma 公司，美國）；小鼠抗大鼠 OX42 單克隆抗體（Abcam 公司，英國）；TNF-α ELISA 試劑盒、IL-1β ELISA 試劑盒（R&D 公司，美國）；一步法 TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒、DAPI 染色液、FITC 標記的山羊抗小鼠 IgG（江蘇碧云天生物科技有限公司）；小鼠抗 BrdU 單克隆抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司）。
MCO-5AC 型 CO2 培養箱、酶標儀（SANYO 公司，日本）；倒置相差顯微鏡（Olympus 公司，日本）；熒光顯微鏡、CM1900 冰凍切片機、RM2015 石蠟切片機（Leica 公司，德國）。
1.2 AdIL-10-BMSCs 制備
取 5 只大鼠骨髓采用貼壁培養法分離培養 BMSCs[7]，取第 3 代細胞行免疫組織化學染色鑒定，顯示細胞 CD44 陽性、CD34 陰性，提示培養細胞為 BMSCs。取第 3 代 BMSCs，參照本課題組方法[6] 將 AdIL-10 基因轉染至細胞，制備 AdIL-10-BMSCs。均于移植前 24 h 制備，備用。
1.3 實驗分組及方法
取 40 只大鼠制備 MCAO 模型，10% 水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，選擇右側大腦中動脈，通過頸外動脈將線栓插入頸內動脈至大腦中動脈，栓子從頸內動脈和頸外動脈分叉處進入 1.8～1.9 cm。栓塞 2 h 后拔出栓子，制備 MACO 缺血 2 h 模型。然后，將大鼠模型隨機分為 A、B、C、D 4 組，每組 10 只。模型制備后 3 h 于各組大鼠尾靜脈注射對應試劑或細胞，A 組注射 1 mL 含 10%FBS 的 L-DMEM 培養液；B 組注射 61.78 ng IL-10（采用 ELISA 法測得 1 mL AdIL-10-BMSCs 中的 IL-10 表達量）；C 組注射 1 mL BMSCs 懸液，細胞濃度為 2×106 個/mL；D 組：注射 1 mL AdIL-10-BMSCs 懸液，細胞濃度 2×106 個/mL。C、D 組細胞移植前 72 h 采用 10 μg/mL BrdU 孵育標記。7 d 后大鼠經頸總動脈灌注處死，取腦組織進行以下觀測。
1.4 觀測指標
1.4.1 一般情況 觀察實驗期間各組動物存活情況。
1.4.2 BrdU 免疫熒光染色觀察 各組取 4 只大鼠腦組織置于 4% 多聚甲醛固定 24 h，放入腦模中，于視交叉處行冠狀切片，片厚 2 mm。取前囟（2 片）及小腦（4 片）組織常規石蠟包埋，連續冠狀切片，片厚 7 μm，制備石蠟切片。取 C、D 組部分切片常規脫蠟至水，0.04% 胃蛋白酶室溫下修復 6 min，正常羊血清封閉，滴加小鼠抗 BrdU 單克隆抗體（1∶300），4℃ 過夜，滴加 FITC 標記的羊抗小鼠 IgG，防淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光細胞。
1.4.3 免疫組織化學染色觀察 各組取 3 只大鼠腦組織按照順序置于 4% 多聚甲醛固定 4 h，20% 蔗糖溶液 4 h，30% 蔗糖溶液中直至組織標本沉底； 0.01mol/L PBS 緩沖液沖洗后，將腦組織放入腦模中，同 1.4.2 方法切片。取前囟（2 片）及小腦（4 片）組織置于冰凍切片機，行冠狀連續冰凍切片，片厚 20 μm。枸櫞酸鹽緩沖液微波抗原修復，3%H2O2 溶液消除內源性過氧化物酶活性，正常羊血清封閉，滴加小鼠抗大鼠 OX42 單克隆抗體（1∶500），4℃ 過夜，滴加生物素化山羊抗小鼠二抗工作液，滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液，DAB 避光顯色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。鏡下觀察 OX42 陽性細胞呈棕褐色，胞體大，突起短而粗，呈典型的“阿米巴樣”。高倍鏡下（×400），各組取 5 張切片，每張切片取 5 個視野，計數 OX42 陽性細胞。
1.4.4 ELISA 檢測 TNF-α及 IL-1β含量 各組取 3 只大鼠腦組織加入 5 倍體積的 RIPA 裂解液，制備腦組織勻漿。勻漿液以離心半徑 13.5 cm、2 500 r/min 離心 20 min。取上清液，采用 BCA 法參照試劑盒說明書測量 TNF-α、IL-1β含量。結果以每克蛋白所含細胞因子皮克數來表示，即 pg/g（pro）。
1.4.5 TUNEL 法檢測梗死灶及其周圍半暗帶神經細胞凋亡 取 1.4.2 制備的各組石蠟切片，常規脫蠟至水，滴加蛋白酶 K 溶液，37℃ 孵育 20 min。加 50 μL TUNEL 檢測液，37℃ 避光孵育 60 min，DAPI 復染。用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。取相同冠狀位皮層切片，各組取 5 張切片，高倍鏡下（×400），梗死灶周圍隨機選取 5 個非連續視野計數凋亡細胞（呈綠色熒光）。
1.5 統計學方法
采用 SPSS16.0 統計軟件進行分析；數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
麻醉后約 2 h 大鼠均完全清醒，出現神經功能缺損癥狀，實驗期間各組大鼠均無死亡。
2.2 BrdU 免疫熒光染色觀察
鏡下觀察示，C、D 組腦組織中均見呈綠色熒光的 BrdU 陽性細胞，主要分布于梗死灶周圍的紋狀體、大腦皮質、皮質下等部位。見圖 1。
圖1
D 組 BrdU 免疫熒光染色觀察（×400）
Figure1.
Immunofluorescence staining of Brdu in group D (×400)
2.3 免疫組織化學染色觀察
鏡下觀察，各組均可見 OX42 陽性細胞（圖 2）。A、B、C、D 組 OX42 陽性細胞數分別為（45.16±4.47）、（35.08±3.84）、（36.25±4.15）、（25.21 ±5.34）個/HP。其中，B、C、D 組 OX42 陽性細胞數明顯少于 A 組，D 組少于 B、C 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05），B、C 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
圖2
OX42 免疫組織化學染色觀察（×400） a. A 組； b. B 組； c. C 組； d. D 組
Figure2.
Immunohistochemical staining of OX42 (×400) a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.4 ELISA 檢測 TNF-α及 IL-1β含量
A、B、C、D 組 TNF-α含量分別為（1.27±0.21）×103、（1.02±0.09）×103、（1.05±0.11）×103、（0.82±0.04）×103pg/g（pro），IL-1β含量分別為（1.26±0.15）×103、（0.95±0.08）×103、（0.99±0.07）×103、（0.61±0.03）×103pg/g（pro）。D 組大鼠腦組織中 TNF-α、IL-1β含量較其余 3 組明顯降低，B、C 組低于與 A 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；B、C 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
2.5 TUNEL 法檢測缺血病灶及其周圍半暗帶神經細胞凋亡
鏡下觀察，各組梗死灶位于大鼠腦額葉、顳葉、頂葉皮質和紋狀體，凋亡細胞（TUNEL 陽性細胞）主要見于梗死灶周圍的紋狀體及額頂皮質下腦 組織（即缺血半暗帶）。見圖 3、4。
圖3
各組 TUNEL 染色觀察（×400） a. A 組； b. B 組； c. C 組； d. D 組
Figure3.
TUNEL staining in each group (×400) a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
圖4
各組TUNEL染色DAPI復染后觀察（×400） a. A 組； b. B 組； c. C 組； d. D 組
Figure4.
TUNEL staining observation after being counterstained with DAPI in each group (×400) a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
A、B、C、D 組 TUNEL 陽性細胞數分別為（51.26±5.17）、（37.12±4.35）、（38.65±4.42）、（29.67±3.98）個/HP，D 組與 A、B、C 組，B、C 組與 A 組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；B、C 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
3 討論
目前干細胞治療腦卒中已進入臨床試驗階段，主要有 3 條移植路線：腦實質內、血管和腦池內移植。腦實質內和腦池內移植操作復雜，而且可能發生嚴重并發癥，如顱內壓增高、癲癇發作、慢性硬膜下血腫等[8]，臨床試驗應用逐漸減少。靜脈移植操作簡便，對患者腦組織無二次損傷。急性腦梗死后血腦屏障完整性破壞，通透性增加并至少持續 2 周[9]，因此 BMSCs 能通過血腦屏障進入腦實質。研究表明經靜脈移植后，隨著血液循環約 75% BMSCs 聚集在缺血病灶中心，約 18.5% BMSCs 聚集在缺血半暗帶內[10]。這種移植入體內的 BMSCs 向損傷及炎癥區域遷移、聚集的能力，即為 BMSCs 的歸巢特性。因此本實驗采用 BrdU 對細胞進行標記后經尾靜脈移植，移植后發現梗死區周邊有 BrdU 陽性細胞，表明移植細胞遷移至損傷區域。
IRI 是一復雜的病理生理過程，主要包括自由基損傷、能量代謝障礙、興奮性氨基酸毒性、細胞內 Ca2+ 超載、炎性損傷和凋亡基因激活等[11-12]。腦缺血后的炎性反應包括小膠質細胞活化、中性粒細胞和單核巨噬細胞浸潤以及大量細胞毒性物質（如活性氧、蛋白酶、細胞因子、黏附分子、趨化因子等）的釋放[13-14]。這些炎性反應能改變腦微環境，引起腦微血管病變和腦血管痙攣、血腦屏障通透性增加，導致腦水腫，進一步加重腦損傷[15]。因此減輕炎性損傷成為治療急性腦梗死的主要途徑之一。
小膠質細胞是腦組織內重要的免疫效應細胞，屬于單核-吞噬細胞系統，常處于靜止狀態，呈“分枝狀”。小膠質細胞易被大腦任何類型的損傷或疾病活化，活化后的細胞體積變大，胞體呈圓形，細胞突起減少，呈“阿米巴狀”。缺血缺氧是誘發小膠質細胞活化和增殖的重要因素之一[16-17]。研究表明在缺血性腦卒中急性期，小膠質細胞分泌各種炎性介質，造成神經細胞損傷，在后期可促進神經再生[18]。因此腦缺血再灌注早期，抑制小膠質細胞活性，可減少腦梗死體積，對腦組織起保護作用[19]。
TNF-α是腦缺血損傷中一種重要的促炎性細胞因子，中樞神經系統血管內皮細胞、星形膠質細胞以及小膠質細胞均可產生[20]。TNF-α可促進白細胞從血管內溢出，誘導腦缺血區神經膠質細胞和內皮細胞黏附分子表達，促使白細胞聚集在損傷組織，通過阻塞微血管、形成自由基、釋放細胞毒素等多種機制，引起血腦屏障通透性增加，最終造成嚴重的腦組織損傷[21]。
正常腦組織內有少量 IL-1β，生理濃度的 IL-1β能保護神經元免遭興奮性氨基酸毒性的損傷。缺血后活化的少突膠質細胞、小膠質細胞、星形細胞及浸潤的巨噬細胞可分泌 IL-1β。持續表達的 IL-1β可以誘導黏附分子表達，促進內皮細胞和白細胞黏附，導致腦血流速度降低[22]。IL-1β還可導致白細胞釋放自由基、基質金屬蛋白酶等因子損害神經元，破壞血腦屏障，加重腦水腫[23]。
本研究結果顯示，移植后 7 d D 組 OX42 陽性細胞數最少，TNF-α、IL-1β含量也明顯降低，與其余 3 組比較差異均有統計學意義（P<0.05）。表明 AdIL-10-BMSCs 能抑制腦缺血再灌注損傷中小膠質細胞活性，進而抑制促炎性因子 TNF-α、IL-1β的表達。另外，凋亡細胞主要見于梗死灶周圍的紋狀體及額頂皮質下腦組織（相當于缺血半暗帶），D 組凋亡細胞數顯著減少，與其余 3 組比較差異均有統計學意義（P<0.05）。表明 AdIL-10-BMSCs 能夠抑制梗死灶周圍腦組織中神經細胞凋亡。
綜上述，AdIL-10-BMSCs 通過抑制小膠質細胞分泌促炎性因子 TNF-α、IL-1β，減少單核細胞及巨噬細胞在缺血病灶周圍聚集，縮小梗死灶面積，另外通過抑制梗死灶周圍腦組織神經細胞凋亡，對大鼠腦 IRI 起保護作用。本實驗為缺血性腦卒中的治療提供了新思路。
據報道，腦卒中已升為中國國民第 1 位死因，并且發病年齡呈年輕化趨勢，嚴重威脅國民生命健康和生活質量[1]。其中 80% 腦卒中為缺血性，快速再灌注是缺血性腦卒中重要治療策略，但溶栓治療后出現的缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）會進一步加重原組織損傷，炎癥損傷和凋亡基因激活是導致 IRI 的主要因素[2-3]。研究表明通過抑制炎性反應、小膠質細胞活性，降低梗死病灶周圍炎性介質濃度水平，可以縮小腦梗死體積，顯著改善神經功能[4-5]。
我們前期研究將攜帶 IL-10 基因的腺病毒載體（recombinant adenovirus IL-10，Ad IL-10）轉染至 BMSCs（AdIL-10-BMSCs），并將其移植至大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）缺血 2 h 大鼠模型，結果顯示 AdIL-10-BMSCs 對大鼠大腦 IRI 有保護作用[6]。本實驗旨在進一步觀察移植 AdIL-10-BMSCs 后，大鼠大腦缺血性病灶及周圍組織內小膠質細胞、TNF-α、IL-1β表達變化，以及神經細胞凋亡情況，探討 AdIL-10-BMSCs 對缺血性腦卒中的保護機制。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
清潔級成年 SD 雄性大鼠 45 只，體質量 250～300 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。AdIL-10 由上海吉凱基因技術有限公司提供。BrdU（Sigma 公司，美國）；小鼠抗大鼠 OX42 單克隆抗體（Abcam 公司，英國）；TNF-α ELISA 試劑盒、IL-1β ELISA 試劑盒（R&D 公司，美國）；一步法 TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒、DAPI 染色液、FITC 標記的山羊抗小鼠 IgG（江蘇碧云天生物科技有限公司）；小鼠抗 BrdU 單克隆抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司）。
MCO-5AC 型 CO2 培養箱、酶標儀（SANYO 公司，日本）；倒置相差顯微鏡（Olympus 公司，日本）；熒光顯微鏡、CM1900 冰凍切片機、RM2015 石蠟切片機（Leica 公司，德國）。
1.2 AdIL-10-BMSCs 制備
取 5 只大鼠骨髓采用貼壁培養法分離培養 BMSCs[7]，取第 3 代細胞行免疫組織化學染色鑒定，顯示細胞 CD44 陽性、CD34 陰性，提示培養細胞為 BMSCs。取第 3 代 BMSCs，參照本課題組方法[6] 將 AdIL-10 基因轉染至細胞，制備 AdIL-10-BMSCs。均于移植前 24 h 制備，備用。
1.3 實驗分組及方法
取 40 只大鼠制備 MCAO 模型，10% 水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，選擇右側大腦中動脈，通過頸外動脈將線栓插入頸內動脈至大腦中動脈，栓子從頸內動脈和頸外動脈分叉處進入 1.8～1.9 cm。栓塞 2 h 后拔出栓子，制備 MACO 缺血 2 h 模型。然后，將大鼠模型隨機分為 A、B、C、D 4 組，每組 10 只。模型制備后 3 h 于各組大鼠尾靜脈注射對應試劑或細胞，A 組注射 1 mL 含 10%FBS 的 L-DMEM 培養液；B 組注射 61.78 ng IL-10（采用 ELISA 法測得 1 mL AdIL-10-BMSCs 中的 IL-10 表達量）；C 組注射 1 mL BMSCs 懸液，細胞濃度為 2×106 個/mL；D 組：注射 1 mL AdIL-10-BMSCs 懸液，細胞濃度 2×106 個/mL。C、D 組細胞移植前 72 h 采用 10 μg/mL BrdU 孵育標記。7 d 后大鼠經頸總動脈灌注處死，取腦組織進行以下觀測。
1.4 觀測指標
1.4.1 一般情況 觀察實驗期間各組動物存活情況。
1.4.2 BrdU 免疫熒光染色觀察 各組取 4 只大鼠腦組織置于 4% 多聚甲醛固定 24 h，放入腦模中，于視交叉處行冠狀切片，片厚 2 mm。取前囟（2 片）及小腦（4 片）組織常規石蠟包埋，連續冠狀切片，片厚 7 μm，制備石蠟切片。取 C、D 組部分切片常規脫蠟至水，0.04% 胃蛋白酶室溫下修復 6 min，正常羊血清封閉，滴加小鼠抗 BrdU 單克隆抗體（1∶300），4℃ 過夜，滴加 FITC 標記的羊抗小鼠 IgG，防淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光細胞。
1.4.3 免疫組織化學染色觀察 各組取 3 只大鼠腦組織按照順序置于 4% 多聚甲醛固定 4 h，20% 蔗糖溶液 4 h，30% 蔗糖溶液中直至組織標本沉底； 0.01mol/L PBS 緩沖液沖洗后，將腦組織放入腦模中，同 1.4.2 方法切片。取前囟（2 片）及小腦（4 片）組織置于冰凍切片機，行冠狀連續冰凍切片，片厚 20 μm。枸櫞酸鹽緩沖液微波抗原修復，3%H2O2 溶液消除內源性過氧化物酶活性，正常羊血清封閉，滴加小鼠抗大鼠 OX42 單克隆抗體（1∶500），4℃ 過夜，滴加生物素化山羊抗小鼠二抗工作液，滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液，DAB 避光顯色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。鏡下觀察 OX42 陽性細胞呈棕褐色，胞體大，突起短而粗，呈典型的“阿米巴樣”。高倍鏡下（×400），各組取 5 張切片，每張切片取 5 個視野，計數 OX42 陽性細胞。
1.4.4 ELISA 檢測 TNF-α及 IL-1β含量 各組取 3 只大鼠腦組織加入 5 倍體積的 RIPA 裂解液，制備腦組織勻漿。勻漿液以離心半徑 13.5 cm、2 500 r/min 離心 20 min。取上清液，采用 BCA 法參照試劑盒說明書測量 TNF-α、IL-1β含量。結果以每克蛋白所含細胞因子皮克數來表示，即 pg/g（pro）。
1.4.5 TUNEL 法檢測梗死灶及其周圍半暗帶神經細胞凋亡 取 1.4.2 制備的各組石蠟切片，常規脫蠟至水，滴加蛋白酶 K 溶液，37℃ 孵育 20 min。加 50 μL TUNEL 檢測液，37℃ 避光孵育 60 min，DAPI 復染。用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。取相同冠狀位皮層切片，各組取 5 張切片，高倍鏡下（×400），梗死灶周圍隨機選取 5 個非連續視野計數凋亡細胞（呈綠色熒光）。
1.5 統計學方法
采用 SPSS16.0 統計軟件進行分析；數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
麻醉后約 2 h 大鼠均完全清醒，出現神經功能缺損癥狀，實驗期間各組大鼠均無死亡。
2.2 BrdU 免疫熒光染色觀察
鏡下觀察示，C、D 組腦組織中均見呈綠色熒光的 BrdU 陽性細胞，主要分布于梗死灶周圍的紋狀體、大腦皮質、皮質下等部位。見圖 1。
圖1
D 組 BrdU 免疫熒光染色觀察（×400）
Figure1.
Immunofluorescence staining of Brdu in group D (×400)
2.3 免疫組織化學染色觀察
鏡下觀察，各組均可見 OX42 陽性細胞（圖 2）。A、B、C、D 組 OX42 陽性細胞數分別為（45.16±4.47）、（35.08±3.84）、（36.25±4.15）、（25.21 ±5.34）個/HP。其中，B、C、D 組 OX42 陽性細胞數明顯少于 A 組，D 組少于 B、C 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05），B、C 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
圖2
OX42 免疫組織化學染色觀察（×400） a. A 組； b. B 組； c. C 組； d. D 組
Figure2.
Immunohistochemical staining of OX42 (×400) a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.4 ELISA 檢測 TNF-α及 IL-1β含量
A、B、C、D 組 TNF-α含量分別為（1.27±0.21）×103、（1.02±0.09）×103、（1.05±0.11）×103、（0.82±0.04）×103pg/g（pro），IL-1β含量分別為（1.26±0.15）×103、（0.95±0.08）×103、（0.99±0.07）×103、（0.61±0.03）×103pg/g（pro）。D 組大鼠腦組織中 TNF-α、IL-1β含量較其余 3 組明顯降低，B、C 組低于與 A 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；B、C 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
2.5 TUNEL 法檢測缺血病灶及其周圍半暗帶神經細胞凋亡
鏡下觀察，各組梗死灶位于大鼠腦額葉、顳葉、頂葉皮質和紋狀體，凋亡細胞（TUNEL 陽性細胞）主要見于梗死灶周圍的紋狀體及額頂皮質下腦 組織（即缺血半暗帶）。見圖 3、4。
圖3
各組 TUNEL 染色觀察（×400） a. A 組； b. B 組； c. C 組； d. D 組
Figure3.
TUNEL staining in each group (×400) a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
圖4
各組TUNEL染色DAPI復染后觀察（×400） a. A 組； b. B 組； c. C 組； d. D 組
Figure4.
TUNEL staining observation after being counterstained with DAPI in each group (×400) a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
A、B、C、D 組 TUNEL 陽性細胞數分別為（51.26±5.17）、（37.12±4.35）、（38.65±4.42）、（29.67±3.98）個/HP，D 組與 A、B、C 組，B、C 組與 A 組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；B、C 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
3 討論
目前干細胞治療腦卒中已進入臨床試驗階段，主要有 3 條移植路線：腦實質內、血管和腦池內移植。腦實質內和腦池內移植操作復雜，而且可能發生嚴重并發癥，如顱內壓增高、癲癇發作、慢性硬膜下血腫等[8]，臨床試驗應用逐漸減少。靜脈移植操作簡便，對患者腦組織無二次損傷。急性腦梗死后血腦屏障完整性破壞，通透性增加并至少持續 2 周[9]，因此 BMSCs 能通過血腦屏障進入腦實質。研究表明經靜脈移植后，隨著血液循環約 75% BMSCs 聚集在缺血病灶中心，約 18.5% BMSCs 聚集在缺血半暗帶內[10]。這種移植入體內的 BMSCs 向損傷及炎癥區域遷移、聚集的能力，即為 BMSCs 的歸巢特性。因此本實驗采用 BrdU 對細胞進行標記后經尾靜脈移植，移植后發現梗死區周邊有 BrdU 陽性細胞，表明移植細胞遷移至損傷區域。
IRI 是一復雜的病理生理過程，主要包括自由基損傷、能量代謝障礙、興奮性氨基酸毒性、細胞內 Ca2+ 超載、炎性損傷和凋亡基因激活等[11-12]。腦缺血后的炎性反應包括小膠質細胞活化、中性粒細胞和單核巨噬細胞浸潤以及大量細胞毒性物質（如活性氧、蛋白酶、細胞因子、黏附分子、趨化因子等）的釋放[13-14]。這些炎性反應能改變腦微環境，引起腦微血管病變和腦血管痙攣、血腦屏障通透性增加，導致腦水腫，進一步加重腦損傷[15]。因此減輕炎性損傷成為治療急性腦梗死的主要途徑之一。
小膠質細胞是腦組織內重要的免疫效應細胞，屬于單核-吞噬細胞系統，常處于靜止狀態，呈“分枝狀”。小膠質細胞易被大腦任何類型的損傷或疾病活化，活化后的細胞體積變大，胞體呈圓形，細胞突起減少，呈“阿米巴狀”。缺血缺氧是誘發小膠質細胞活化和增殖的重要因素之一[16-17]。研究表明在缺血性腦卒中急性期，小膠質細胞分泌各種炎性介質，造成神經細胞損傷，在后期可促進神經再生[18]。因此腦缺血再灌注早期，抑制小膠質細胞活性，可減少腦梗死體積，對腦組織起保護作用[19]。
TNF-α是腦缺血損傷中一種重要的促炎性細胞因子，中樞神經系統血管內皮細胞、星形膠質細胞以及小膠質細胞均可產生[20]。TNF-α可促進白細胞從血管內溢出，誘導腦缺血區神經膠質細胞和內皮細胞黏附分子表達，促使白細胞聚集在損傷組織，通過阻塞微血管、形成自由基、釋放細胞毒素等多種機制，引起血腦屏障通透性增加，最終造成嚴重的腦組織損傷[21]。
正常腦組織內有少量 IL-1β，生理濃度的 IL-1β能保護神經元免遭興奮性氨基酸毒性的損傷。缺血后活化的少突膠質細胞、小膠質細胞、星形細胞及浸潤的巨噬細胞可分泌 IL-1β。持續表達的 IL-1β可以誘導黏附分子表達，促進內皮細胞和白細胞黏附，導致腦血流速度降低[22]。IL-1β還可導致白細胞釋放自由基、基質金屬蛋白酶等因子損害神經元，破壞血腦屏障，加重腦水腫[23]。
本研究結果顯示，移植后 7 d D 組 OX42 陽性細胞數最少，TNF-α、IL-1β含量也明顯降低，與其余 3 組比較差異均有統計學意義（P<0.05）。表明 AdIL-10-BMSCs 能抑制腦缺血再灌注損傷中小膠質細胞活性，進而抑制促炎性因子 TNF-α、IL-1β的表達。另外，凋亡細胞主要見于梗死灶周圍的紋狀體及額頂皮質下腦組織（相當于缺血半暗帶），D 組凋亡細胞數顯著減少，與其余 3 組比較差異均有統計學意義（P<0.05）。表明 AdIL-10-BMSCs 能夠抑制梗死灶周圍腦組織中神經細胞凋亡。
綜上述，AdIL-10-BMSCs 通過抑制小膠質細胞分泌促炎性因子 TNF-α、IL-1β，減少單核細胞及巨噬細胞在缺血病灶周圍聚集，縮小梗死灶面積，另外通過抑制梗死灶周圍腦組織神經細胞凋亡，對大鼠腦 IRI 起保護作用。本實驗為缺血性腦卒中的治療提供了新思路。
