引用本文： 聶開瑜, 胡鵬, 王達利, 魏在榮, 曾學琴, 孫廣峰. 雷帕霉素及去鐵敏對缺血缺氧創面愈合的影響. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(6): 718-722. doi: 10.7507/1002-1892.201608081 復制
體表缺血缺氧創面形成機制復雜，至今尚未明確。該類型創面愈合困難，研究發現與其局部持續缺血缺氧密切相關[1-4]。缺氧誘導因子 1（hypoxia inducible factor 1，HIF-1）是參與缺氧應答反應的關鍵性轉錄因子，其下游靶基因涉及血管生成、細胞能量代謝、離子代謝、細胞凋亡和增殖、細胞遷移等多個方面[1-2]，已成為缺血缺氧創面愈合研究的新熱點。研究表明，HIF-1α 表達不足導致的血管生成減少是創面延遲愈合的重要原因之一[5-13]，但缺血缺氧創面中 HIF 表達減少的機制仍未明確。腫瘤和缺血再灌注損傷的相關研究發現，雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是 HIF-1 的上游調節蛋白，可調節 HIF-1 的表達[14-16]；慢性創面發生過程中是否也存在與腫瘤及缺血再灌注損傷類似的由 mTOR 及 HIF-1 參與調解的機制，尚未明確。去鐵敏是一種高選擇性鐵離子螯合劑，在氧分壓正常時可明顯促進 HIF-1α 表達，動物實驗證實通過創面局部或全身使用去鐵敏可以明顯促進創面愈合[6-8]。本研究旨在觀察雷帕霉素及去鐵敏對缺血缺氧創面愈合的影響，探討其作用機制，以期為探索缺血缺氧創面形成機制提供實驗依據。
1 材料及方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF 級雄性成年 SD 大鼠 40 只，體質量（300±20）g，由第三軍醫大學大坪醫院醫學實驗動物中心提供。雷帕霉素、去鐵敏（Sigma 公司，美國）；β-actin、mTOR、HIF-1α 以及 VEGF 引物由上海英駿生物有限公司設計合成；兔抗大鼠 mTOR 抗體、HIF-1α 抗體、VEGF 抗體（Abcam 公司，英國）。
TU1810 紫外分光光度計（Beckman 公司，美國）；icycler 熒光定量 PCR 儀、全自動凝膠圖像分析儀（Bio-Rad 公司，美國）；高速低溫離心機（Eppendorf 公司，德國）；Perimed 經皮氧分壓激光多普勒系統（Perimed 公司，瑞典）。
1.2 大鼠缺血缺氧創面模型制備
參照 Chen 等[17]報道的大鼠缺血缺氧創面模型制備方法并進行改良，并經預實驗驗證。40 只 SD 大鼠術前禁食 12 h；腹腔注射 10% 水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后，俯臥位固定，背部剃毛、消毒。于肩胛與髂棘之間切取面積為 11 cm×3 cm 的矩形雙蒂皮瓣（包含皮膚、皮下肉膜層和淺筋膜層），掀起皮瓣，切斷淺筋膜層與深筋膜之間所有穿支，皮瓣血供僅來自于兩端蒂部雙側旋髂深動脈、雙側胸背動脈及其發出的頂支形成的真皮下血管網，使雙側蒂部至皮瓣中間的血供逐漸減少，再分別于皮瓣中央等邊距及間距，制作 3 個面積為 1 cm×1 cm 全層皮瓣缺損創面；雙蒂皮瓣邊緣等間距 4-0 絲線間斷縫合固定 6 針。術后大鼠分籠飼養，以免撕咬影響皮瓣成活及創面愈合，給予適量青霉素預防感染。
模型制備后即刻以及 1、2、3 d 使用 Perimed 經皮氧分壓激光多普勒系統 407 微型激光血流探頭檢測創面邊緣血流信號強度。結果顯示，與兩側創面相比，中間創面呈缺血缺氧狀態，提示成功制備缺血缺氧創面模型。見圖 1。
圖1
大鼠缺血缺氧創面模型制備
a. 術前皮瓣及創面設計；b. 術中皮瓣切取及創面制備；c、d. 模型制備后即刻探測創面邊緣血流信號強度
Figure1. Preparation of rat model of ischemia-hypoxia wounda. Preoperative flap and wound design; b. Intraoperative flap incision and wound preparation; c, d. The blood flow signal intensity at immediate after the model was prepared
1.3 實驗分組及方法
大鼠缺血缺氧創面模型制備后將其隨機分為4組，每組 10 只；分別為空白對照組（A 組）、去鐵敏干預組（B 組）、雷帕霉素干預組（C 組）、去鐵敏+雷帕霉素共同干預組（D 組）。模型制備后 3、6、9 d，A、B、C、D 組分別腹腔注射等體積生理鹽水、去鐵敏（10 mg/kg）、雷帕霉素（3 mg/kg）、去鐵敏（10 mg/kg）+雷帕霉素（3 mg/kg）[6-8, 18-19]。
于創面完全愈合后第 2 天，同上法麻醉大鼠后，于背部切取包含中央創面、直徑約 1.5 cm 的圓形全層皮膚組織，縱行兩等份，分別進行實時熒光定量 PCR 檢測創面組織中 mTOR、HIF-1α、VEGF mRNA 的表達，以及 Western blot 檢測 mTOR、HIF-1α、VEGF 蛋白表達。
1.4 觀測指標
1.4.1 大體觀察 建模后觀察各組大鼠存活情況，觀察皮瓣成活以及創面愈合情況，以肉眼觀察創面完全上皮化所需時間記為創面愈合時間[20]。
1.4.2 實時熒光定量 PCR 檢測 取創面組織樣品冰上勻漿，每 0.1 克組織加 1 mL Trizol。用 Trizol 裂解法提取組織總 RNA，紫外分光光度法檢測總 RNA 含量和純度。在 10 μL 反應體系中用 Prime-Script RT 試劑盒逆轉錄成 cDNA，用 SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒在 50 μL 反應體系中擴增。用 ABI Prism 7300 System 檢測實時熒光定量 PCR 反應，反應條件：95℃ 預變性 10 s，95℃ 變性 5 s，60℃ 退火延伸 31 s，共 40 個循環。梯度稀釋 cDNA 產生的標準曲線計算 PCR 反應效率，用溶解曲線和凝膠電泳檢測各引物特異性。引物序列見表 1。
表1
實時熒光定量 PCR 檢測引物序列
Table1.
Primer sequences for real-time fluorescence PCR
1.4.3 Western blot 檢測 取創面組織樣品冰上勻漿，加入 Tris-HCl 組織裂解液（50 mmol/L）4℃ 裂解 30 min，置入 4℃ 恒溫離心機，以離心半徑 10 cm、12 000 r/min 離心 15 min。收集上清液，BCA 試劑盒檢測蛋白濃度。將樣品蛋白 8 μg 在 5%～17% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉聚偏氟乙烯膜，PBS 液加 0.05% Tween-20（PBS-T）洗滌，2% 脫脂奶粉室溫封閉 2 h；再用 PBS-T 洗膜，加一抗（mTOR、HIF-1α、VEGF）4℃ 孵育過夜，PBS-T 洗滌，二抗（羊抗兔/鼠 IgG）室溫孵育 2 h，PBS-T 洗膜，ECL 法影，X 線片曝光。采用 Image Pro Plus 圖像分析軟件測定 mTOR、HIF-1α、VEGF 蛋白表達水平。
1.5 統計學方法
采用 SPSS13.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
各組大鼠均存活至實驗完成；皮瓣均成活，創面均愈合（圖 2）。A、B、C、D 組創面愈合時間分別為（14.00±1.25）、（12.00±1.00）、（18.00±2.00）、（13.00±1.25）d，其中 A、B、D 組創面愈合時間均較 C 組明顯縮短，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A、B、D 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
圖2
A 組大鼠創面愈合后大體觀察
黑色圓圈處為切取的全層皮膚組織標本
Figure2. General observation of rats in group A after wound healingBlack circle for full thickness skin specimens
2.2 實時熒光定量 PCR 檢測
C、D 組 mTOR mRNA 表達較 A、B 組明顯下調，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A、B 組間比較差異有統計學意義（P<0.05）；C、D 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。B、D 組 HIF-1α、VEGF mRNA 表達較 A、C 組明顯上調，C 組較 A 組表達下調，比較差異有統計學意義（P<0.05）；而 B、D 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表 2。
表2
各組 mTOR、HIF-1α、VEGF mRNA 表達比較（n=10，
）
Table2.
Comparison of the mTOR, HIF-1α, and VEGF mRNA expre-ssions between groups (n=10,
)
2.3 Western blot 檢測
mTOR 蛋白：與 A 組相比，B 組蛋白相對表達量上調，C、D 組明顯下調，比較差異有統計學意義（P<0.05）。B 組蛋白相對表達量明顯高于 C、D 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）。C、D 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表 3 及圖 3。
圖3
Western blot 檢測各組 mTOR、HIF-1α 及 VEGF 蛋白表達
1：A 組；2：B 組；3：C 組；4：D 組
Figure3. Expressions of mTOR, HIF-1α, and VEGF protein in each group by Western blot1: Group A; 2: Group B; 3: Group C; 4: Group D
HIF-1α 蛋白：A、B、C 組蛋白相對表達量明顯高于 D 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）。A、B、C 組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表 3 及圖 3。
VEGF 蛋白：與 A 組相比，B、C、D 組蛋白相對表達量明顯下調，比較差異有統計學意義（P<0.05）；D 組蛋白相對表達量顯著低于 B、C 組，C 組低于 B 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 3 及圖 3。
表3
各組 mTOR、HIF-1α、VEGF 蛋白表達的比較（n=10，
）
Table3.
Comparison of the mTOR, HIF-1α, and VEGF protein expressions between groups (n=10,
)
3 討論
以缺血缺氧創面為代表的慢性創面具有病程長、對外觀影響大、并發癥多等特點，已成為影響患者生活質量的重要并發癥[1, 21]。雷帕霉素是常用的免疫抑制劑，可以直接抑制 mTOR[14]。它對非免疫細胞的作用日益受到重視。既往研究證實雷帕霉素可以延遲多種創面的愈合[18-19]。本研究中 C 組創面愈合時間較 A 組延長，也進一步證實了雷帕霉素會明顯延遲缺血缺氧創面的愈合。
在正常創面愈合中，暫時缺氧能導致 HIF-1α 表達升高，促進其下游基因 VEGF 的表達，從而促進血管生成和創面愈合。去鐵敏在氧分壓正常時即可明顯促進 HIF-1α 表達。在糖尿病和老年動物的缺血缺氧創面模型中均發現，通過創面局部或全身使用去鐵敏可以明顯促進創面愈合[6-8]。本研究中 B 組 HIF-1α 表達明顯上調，且創面愈合時間縮短，也初步證明去鐵敏促進創面愈合的機制可能與調節HIF活性有密切關系。
在腫瘤和缺血再灌注損傷的研究中發現：mTOR 是 HIF-1 的上游調節蛋白，可調節 HIF-1 的表達；多種生長因子能激活 PI3K/Akt/mTOR 信號途徑，在常氧下增強 HIF-1α 的轉錄活性；細胞缺血缺氧時 ATP 減少、AMP 增加，可激活 5′-AMP 激活性蛋白激酶，進而抑制 mTOR 的表達，而抑制 mTOR 表達又會減少 HIF-1α 的表達[14-15]。目前，有關 mTOR 對慢性缺血缺氧創面中 HIF-1 表達的影響鮮見報道。本研究發現在缺血缺氧創面中 mTOR mRNA 表達下調，對應 HIF-1α mRNA 表達也下調，這與在缺血再灌注損傷中的研究發現一致。但 Western blot 檢測顯示，mTOR 及對應 HIF-1α 蛋白表達變化與 mRNA 表達不一致，其具體調節機制是否與缺血再灌注損傷中調節機制存在差異，或者存在其他調節機制參與，有待后期進一步研究。
體表缺血缺氧創面形成機制復雜，至今尚未明確。該類型創面愈合困難，研究發現與其局部持續缺血缺氧密切相關[1-4]。缺氧誘導因子 1（hypoxia inducible factor 1，HIF-1）是參與缺氧應答反應的關鍵性轉錄因子，其下游靶基因涉及血管生成、細胞能量代謝、離子代謝、細胞凋亡和增殖、細胞遷移等多個方面[1-2]，已成為缺血缺氧創面愈合研究的新熱點。研究表明，HIF-1α 表達不足導致的血管生成減少是創面延遲愈合的重要原因之一[5-13]，但缺血缺氧創面中 HIF 表達減少的機制仍未明確。腫瘤和缺血再灌注損傷的相關研究發現，雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是 HIF-1 的上游調節蛋白，可調節 HIF-1 的表達[14-16]；慢性創面發生過程中是否也存在與腫瘤及缺血再灌注損傷類似的由 mTOR 及 HIF-1 參與調解的機制，尚未明確。去鐵敏是一種高選擇性鐵離子螯合劑，在氧分壓正常時可明顯促進 HIF-1α 表達，動物實驗證實通過創面局部或全身使用去鐵敏可以明顯促進創面愈合[6-8]。本研究旨在觀察雷帕霉素及去鐵敏對缺血缺氧創面愈合的影響，探討其作用機制，以期為探索缺血缺氧創面形成機制提供實驗依據。
1 材料及方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF 級雄性成年 SD 大鼠 40 只，體質量（300±20）g，由第三軍醫大學大坪醫院醫學實驗動物中心提供。雷帕霉素、去鐵敏（Sigma 公司，美國）；β-actin、mTOR、HIF-1α 以及 VEGF 引物由上海英駿生物有限公司設計合成；兔抗大鼠 mTOR 抗體、HIF-1α 抗體、VEGF 抗體（Abcam 公司，英國）。
TU1810 紫外分光光度計（Beckman 公司，美國）；icycler 熒光定量 PCR 儀、全自動凝膠圖像分析儀（Bio-Rad 公司，美國）；高速低溫離心機（Eppendorf 公司，德國）；Perimed 經皮氧分壓激光多普勒系統（Perimed 公司，瑞典）。
1.2 大鼠缺血缺氧創面模型制備
參照 Chen 等[17]報道的大鼠缺血缺氧創面模型制備方法并進行改良，并經預實驗驗證。40 只 SD 大鼠術前禁食 12 h；腹腔注射 10% 水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后，俯臥位固定，背部剃毛、消毒。于肩胛與髂棘之間切取面積為 11 cm×3 cm 的矩形雙蒂皮瓣（包含皮膚、皮下肉膜層和淺筋膜層），掀起皮瓣，切斷淺筋膜層與深筋膜之間所有穿支，皮瓣血供僅來自于兩端蒂部雙側旋髂深動脈、雙側胸背動脈及其發出的頂支形成的真皮下血管網，使雙側蒂部至皮瓣中間的血供逐漸減少，再分別于皮瓣中央等邊距及間距，制作 3 個面積為 1 cm×1 cm 全層皮瓣缺損創面；雙蒂皮瓣邊緣等間距 4-0 絲線間斷縫合固定 6 針。術后大鼠分籠飼養，以免撕咬影響皮瓣成活及創面愈合，給予適量青霉素預防感染。
模型制備后即刻以及 1、2、3 d 使用 Perimed 經皮氧分壓激光多普勒系統 407 微型激光血流探頭檢測創面邊緣血流信號強度。結果顯示，與兩側創面相比，中間創面呈缺血缺氧狀態，提示成功制備缺血缺氧創面模型。見圖 1。
圖1
大鼠缺血缺氧創面模型制備
a. 術前皮瓣及創面設計；b. 術中皮瓣切取及創面制備；c、d. 模型制備后即刻探測創面邊緣血流信號強度
Figure1. Preparation of rat model of ischemia-hypoxia wounda. Preoperative flap and wound design; b. Intraoperative flap incision and wound preparation; c, d. The blood flow signal intensity at immediate after the model was prepared
1.3 實驗分組及方法
大鼠缺血缺氧創面模型制備后將其隨機分為4組，每組 10 只；分別為空白對照組（A 組）、去鐵敏干預組（B 組）、雷帕霉素干預組（C 組）、去鐵敏+雷帕霉素共同干預組（D 組）。模型制備后 3、6、9 d，A、B、C、D 組分別腹腔注射等體積生理鹽水、去鐵敏（10 mg/kg）、雷帕霉素（3 mg/kg）、去鐵敏（10 mg/kg）+雷帕霉素（3 mg/kg）[6-8, 18-19]。
于創面完全愈合后第 2 天，同上法麻醉大鼠后，于背部切取包含中央創面、直徑約 1.5 cm 的圓形全層皮膚組織，縱行兩等份，分別進行實時熒光定量 PCR 檢測創面組織中 mTOR、HIF-1α、VEGF mRNA 的表達，以及 Western blot 檢測 mTOR、HIF-1α、VEGF 蛋白表達。
1.4 觀測指標
1.4.1 大體觀察 建模后觀察各組大鼠存活情況，觀察皮瓣成活以及創面愈合情況，以肉眼觀察創面完全上皮化所需時間記為創面愈合時間[20]。
1.4.2 實時熒光定量 PCR 檢測 取創面組織樣品冰上勻漿，每 0.1 克組織加 1 mL Trizol。用 Trizol 裂解法提取組織總 RNA，紫外分光光度法檢測總 RNA 含量和純度。在 10 μL 反應體系中用 Prime-Script RT 試劑盒逆轉錄成 cDNA，用 SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒在 50 μL 反應體系中擴增。用 ABI Prism 7300 System 檢測實時熒光定量 PCR 反應，反應條件：95℃ 預變性 10 s，95℃ 變性 5 s，60℃ 退火延伸 31 s，共 40 個循環。梯度稀釋 cDNA 產生的標準曲線計算 PCR 反應效率，用溶解曲線和凝膠電泳檢測各引物特異性。引物序列見表 1。
表1
實時熒光定量 PCR 檢測引物序列
Table1.
Primer sequences for real-time fluorescence PCR
1.4.3 Western blot 檢測 取創面組織樣品冰上勻漿，加入 Tris-HCl 組織裂解液（50 mmol/L）4℃ 裂解 30 min，置入 4℃ 恒溫離心機，以離心半徑 10 cm、12 000 r/min 離心 15 min。收集上清液，BCA 試劑盒檢測蛋白濃度。將樣品蛋白 8 μg 在 5%～17% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉聚偏氟乙烯膜，PBS 液加 0.05% Tween-20（PBS-T）洗滌，2% 脫脂奶粉室溫封閉 2 h；再用 PBS-T 洗膜，加一抗（mTOR、HIF-1α、VEGF）4℃ 孵育過夜，PBS-T 洗滌，二抗（羊抗兔/鼠 IgG）室溫孵育 2 h，PBS-T 洗膜，ECL 法影，X 線片曝光。采用 Image Pro Plus 圖像分析軟件測定 mTOR、HIF-1α、VEGF 蛋白表達水平。
1.5 統計學方法
采用 SPSS13.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
各組大鼠均存活至實驗完成；皮瓣均成活，創面均愈合（圖 2）。A、B、C、D 組創面愈合時間分別為（14.00±1.25）、（12.00±1.00）、（18.00±2.00）、（13.00±1.25）d，其中 A、B、D 組創面愈合時間均較 C 組明顯縮短，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A、B、D 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
圖2
A 組大鼠創面愈合后大體觀察
黑色圓圈處為切取的全層皮膚組織標本
Figure2. General observation of rats in group A after wound healingBlack circle for full thickness skin specimens
2.2 實時熒光定量 PCR 檢測
C、D 組 mTOR mRNA 表達較 A、B 組明顯下調，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A、B 組間比較差異有統計學意義（P<0.05）；C、D 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。B、D 組 HIF-1α、VEGF mRNA 表達較 A、C 組明顯上調，C 組較 A 組表達下調，比較差異有統計學意義（P<0.05）；而 B、D 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表 2。
表2
各組 mTOR、HIF-1α、VEGF mRNA 表達比較（n=10，
）
Table2.
Comparison of the mTOR, HIF-1α, and VEGF mRNA expre-ssions between groups (n=10,
)
2.3 Western blot 檢測
mTOR 蛋白：與 A 組相比，B 組蛋白相對表達量上調，C、D 組明顯下調，比較差異有統計學意義（P<0.05）。B 組蛋白相對表達量明顯高于 C、D 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）。C、D 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表 3 及圖 3。
圖3
Western blot 檢測各組 mTOR、HIF-1α 及 VEGF 蛋白表達
1：A 組；2：B 組；3：C 組；4：D 組
Figure3. Expressions of mTOR, HIF-1α, and VEGF protein in each group by Western blot1: Group A; 2: Group B; 3: Group C; 4: Group D
HIF-1α 蛋白：A、B、C 組蛋白相對表達量明顯高于 D 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）。A、B、C 組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表 3 及圖 3。
VEGF 蛋白：與 A 組相比，B、C、D 組蛋白相對表達量明顯下調，比較差異有統計學意義（P<0.05）；D 組蛋白相對表達量顯著低于 B、C 組，C 組低于 B 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 3 及圖 3。
表3
各組 mTOR、HIF-1α、VEGF 蛋白表達的比較（n=10，
）
Table3.
Comparison of the mTOR, HIF-1α, and VEGF protein expressions between groups (n=10,
)
3 討論
以缺血缺氧創面為代表的慢性創面具有病程長、對外觀影響大、并發癥多等特點，已成為影響患者生活質量的重要并發癥[1, 21]。雷帕霉素是常用的免疫抑制劑，可以直接抑制 mTOR[14]。它對非免疫細胞的作用日益受到重視。既往研究證實雷帕霉素可以延遲多種創面的愈合[18-19]。本研究中 C 組創面愈合時間較 A 組延長，也進一步證實了雷帕霉素會明顯延遲缺血缺氧創面的愈合。
在正常創面愈合中，暫時缺氧能導致 HIF-1α 表達升高，促進其下游基因 VEGF 的表達，從而促進血管生成和創面愈合。去鐵敏在氧分壓正常時即可明顯促進 HIF-1α 表達。在糖尿病和老年動物的缺血缺氧創面模型中均發現，通過創面局部或全身使用去鐵敏可以明顯促進創面愈合[6-8]。本研究中 B 組 HIF-1α 表達明顯上調，且創面愈合時間縮短，也初步證明去鐵敏促進創面愈合的機制可能與調節HIF活性有密切關系。
在腫瘤和缺血再灌注損傷的研究中發現：mTOR 是 HIF-1 的上游調節蛋白，可調節 HIF-1 的表達；多種生長因子能激活 PI3K/Akt/mTOR 信號途徑，在常氧下增強 HIF-1α 的轉錄活性；細胞缺血缺氧時 ATP 減少、AMP 增加，可激活 5′-AMP 激活性蛋白激酶，進而抑制 mTOR 的表達，而抑制 mTOR 表達又會減少 HIF-1α 的表達[14-15]。目前，有關 mTOR 對慢性缺血缺氧創面中 HIF-1 表達的影響鮮見報道。本研究發現在缺血缺氧創面中 mTOR mRNA 表達下調，對應 HIF-1α mRNA 表達也下調，這與在缺血再灌注損傷中的研究發現一致。但 Western blot 檢測顯示，mTOR 及對應 HIF-1α 蛋白表達變化與 mRNA 表達不一致，其具體調節機制是否與缺血再灌注損傷中調節機制存在差異，或者存在其他調節機制參與，有待后期進一步研究。
