引用本文： 付晶, 張偉, 張愛武, 馬麗娟, 褚文輝, 李春義. 鹿茸軟骨組織脫細胞基質材料的制備及生物相容性研究. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(6): 723-729. doi: 10.7507/1002-1892.201612072 復制
由創傷和各種疾病導致的關節軟骨缺損臨床常見，由于軟骨內無血管，缺乏血液供應，缺損后自身修復能力有限[1-3]。目前，臨床治療關節軟骨損傷方法較多，包括軟骨或骨膜移植、軟骨下骨鉆孔以及關節削磨成形術等，但均不能實現長期的軟骨修復[4]。隨著組織工程技術的發展，脫細胞基質材料，特別是軟骨脫細胞基質材料，成為了修復軟骨組織的一種新材料[5-7]。大量動物實驗及臨床研究發現，應用自體軟骨組織或同種異體、異種脫細胞基質作為支架材料修復軟骨組織缺損的方法僅適合小范圍軟骨缺損修復[8-10]，由于缺乏充足營養供應或血管化不及時，大段軟骨缺損修復效果不理想[11-12]。
鹿茸是一種骨軟骨組織復合物，其軟骨組織中富含血管、多種軟骨/骨生成相關因子[13-15]，可以作為一種良好的軟骨脫細胞基質材料來源。鹿茸尖部至基部分為間充質層、前成軟骨層、過渡區、軟骨層，間充質層是鹿茸能快速生長的關鍵組織[16]。研究發現，鹿茸間充質層細胞可以被多種干細胞標記物標記，且處于快速分裂狀態[17]。因此，本研究以鹿茸軟骨間充質層為研究對象，制備脫細胞基質材料并評價其脫細胞效果；同時將其移植至裸鼠體內，觀察間充質層脫細胞基質組織相容性，并研究鹿茸干細胞即生茸區骨膜（antlerogenic perios-teum，AP）細胞結合脫細胞基質材料在活體內誘導血管生成的情況。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗材料及主要試劑、儀器
3 頭梅花鹿的標準二杠鹿茸，由中國農業科學院特產研究所實驗鹿場提供。48 日齡雄性裸鼠（BALB/c-nu）6 只，平均體質量 35 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。原代 AP 細胞由本實驗室保存。
彈力蛋白酶、抑肽酶、RNA 酶、DNA 酶、PKH26 細胞熒光染色試劑盒（Sigma 公司，美國）；DNA 提取試劑盒（Promega 公司，美國）；Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠免疫熒光染色試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；Stro-1 抗體（Abcam 公司，英國）；DMEM、FBS（GIBCO 公司，澳大利亞）。
Bullet Blender 細胞組織破碎儀（Next Advance 公司，美國）；酶標儀（BioTek 公司，美國）；組織切片機（Leica 公司，德國）；細胞培養箱（SANYO 公司，日本）；熒光顯微鏡（AMG 公司，美國）；倒置顯微鏡（Olympus 公司，日本）。
1.2 間充質層脫細胞基質制備及觀測
1.2.1 間充質層脫細胞基質制備 取鹿茸按照 Li 等[18]方法進行組織分層，獲得鹿茸軟骨間充質層組織，切割成大小為 0.2 mm × 0.2 mm 的組織塊，PBS 沖洗數次去除血液和污漬后，4℃ 冰箱保存備用。參照 Utomo 等 [19]的軟骨脫細胞方法并進行改良，具體步驟：① 將組織塊置于低滲溶液中連續凍融 2 個周期，每個周期 –20℃ 凍 12 h、4℃ 融 12 h，然后置于 45℃ 低滲溶液中孵育 24 h；② 置于去離子劑中振蕩處理 24 h，然后于洗滌液中常溫振蕩清洗 2 次，每次 30 min；③ 45℃，于洗滌劑中振蕩孵育 24 h；④ 37℃，于低濃度彈力蛋白酶溶液中振蕩處理 24 h，然后洗滌液中常溫振蕩清洗 2 次，每次 30 min；⑤ 37℃，于核酸清除液中振蕩孵育 3 h，然后洗滌液中常溫振蕩清洗 2 次，每次 30 min；⑥ 于去污劑中振蕩洗滌 3 h，然后洗滌液中常溫振蕩洗滌 2 次，每次 30 min；⑦ 45℃，于 PBS 中振蕩處理 24 h。脫細胞處理結束后，將標本置于低滲溶液中，4℃ 冰箱保存備用。
1.2.2 脫細胞效果評價 ① 組織學觀察：取脫細胞基質材料置于 4% 多聚甲醛固定，制作石蠟切片，片厚 5 μm，常規行 HE 染色和 DAPI 染色，于光鏡及熒光顯微鏡下分別觀察脫細胞處理后殘留細胞量以及基質內纖維組織狀態。② DNA 含量檢測：稱取 20 mg 脫細胞基質材料，按照 DNA 提取試劑盒說明書步驟進行 DNA 提取，使用酶標儀測定 DNA 濃度。實驗重復 3 次。以上兩檢測指標均取未行脫細胞處理的間充質層組織作為對照。
1.3 間充質層脫細胞基質與 AP 細胞復合培養觀察
1.3.1 AP 細胞免疫熒光染色觀察 取原代 AP 細胞常規復蘇并傳至第 2 代，按照 1×104 個/孔密度接種于含有多聚賴氨酸爬片的 24 孔板中；常規培養 24 h 后，4% 多聚甲醛固定爬片 15 min，PBS 浸洗玻片 3 次，吸干 PBS，滴加正常山羊血清，室溫封閉 30 min；吸棄封閉液，滴加一抗 Stro-1，濕盒中 4℃ 孵育過夜；同型對照代替一抗 Stro-1 作為陰性對照。TBST 浸洗爬片 3 次，吸干爬片上多余液體后滴加二抗 Alexa Fluor 488，濕盒中 37℃ 孵育 1 h，TBST 浸洗 3 次；吸干液體后滴加 20 μL 羅丹明染液，濕盒中室溫下染色 20 min，TBST 浸洗 3 次；滴加 DAPI 避光孵育 5 min，TBST 浸洗 3 次；吸干液體后封片，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光標記的 Stro-1 蛋白在 AP 細胞膜表面表達情況。
1.3.2 PKH26 標記 AP 細胞 取原代 AP 細胞常規復蘇并傳至第 2 代，消化后 1 mL DMEM 培養基（含 10% FBS 及青、鏈霉素各 100 U/mL）重懸，計數細胞為 5×106 個。按 PKH26 細胞熒光染色試劑盒操作說明書進行操作，將 1 μL 染料與 0.5 mL 稀釋液 C 混合均勻后，加至細胞懸液中混合，于 37℃ 細胞培養箱中孵育 3 min，然后加入同體積 FBS 中和反應。細胞混合液以 1 000×g、離心 5 min 后，去除上清，加入 1 mL DMEM 培養基重懸后進行常規 AP 細胞培養，培養 2 d 后熒光顯微鏡下觀察 PKH26 標記結果。以等量 PBS 代替細胞混合液作為陰性對照，其余操作相同。
1.3.3 復合培養觀察 待 1.3.2 中 PKH26 標記的 AP 細胞長滿后進行消化處理，計數細胞為 2×107 個，以 2 mL DMEM 培養基重懸；取 20 mg 間充質層脫細胞基質加至重懸液中，室溫下孵育 5 min，將基質連同細胞懸浮液一同轉移至 6 孔培養板，再加入 1 mL DMEM 培養基，于 37℃、5%CO 2 細胞培養箱內進行常規培養，作為實驗組。每隔 2 d 換液 1 次。對照組為 1.3.2 中等量 PBS 代替細胞混合液，其余操作相同；即不接種 PKH26 標記的 AP 細胞、只進行脫細胞基質空培養。培養 7 d 后，取兩組樣本同 1.2.2 方法制備石蠟切片，常規 HE 染色，光鏡下觀察。另外，熒光顯微鏡下觀察 PKH26 標記的 AP 細胞在材料表面分布情況。
1.4 動物體內實驗
取 6 只裸鼠，腹腔注射 0.1 mL 10% 水合氯醛麻醉后，腹股溝處消毒。取 1.3.3 中培養 7 d 的實驗組及對照組樣本，分別移植至每只裸鼠左、右側腹股溝，每側 20 mg。見圖 1。移植后 7、21 d，分別取 3 只裸鼠同上法麻醉后，按照原切口入路取出移植物。取部分樣本制備冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察 PKH26 標記的 AP 細胞在體內增殖及遷移情況；部分樣本制備石蠟切片，常規 HE 染色后光鏡下觀察。
圖1
間充質層脫細胞基質植入裸鼠操作步驟 a. 間充質層脫細胞基質；b. 移植部位；c. 于無菌操作臺中將間充質層脫細胞基質植入裸鼠腹股溝部
Figure1.
The process of transplantation of M layer acelluar matrix into nude mice a. M layer acellular matrix for transplantation; b. Location of transplantation; c. Transplantation of M layer acellular matrix into nude mice by sterile operation
1.5 統計學方法
采用 SPSS 20.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 脫細胞處理效果評價
2.1.1 組織學觀察 HE 染色顯示，脫細胞處理前，間充質層組織細胞排列緊密，大部分細胞胞核細長，排列方向與生長軸垂直，少數與生長軸平行，存在血管前體結構。脫細胞處理后，細胞完全從間充質層組織中脫去，留下空隙均勻的基質材料。DAPI 染色顯示，脫細胞處理前，間充質層組織內細胞核明顯；脫細胞處理后，間充質層組織內無細胞核。見圖 2。
圖2
脫細胞前后間充質層組織學觀察 從左至右分別為脫細胞處理前及處理后 a. HE 染色（×10）；b. DAPI 染色（熒光顯微鏡×20）
Figure2.
Histological observation of M layer tissue before and after cell extraction From left to right for M layer tissue before and after cell extraction, respectively a. HE staining (×10); b. DAPI staining (Fluorescence microscope×20)
2.1.2 DNA 含量檢測 脫細胞處理前，間充質層組織內 DNA 含量為（3 805.500±519.119）ng/mg，脫細胞處理后為（19.367±5.254）ng/mg，比較差異有統計學意義（t=12.630，P=0.000）。
2.2 AP 細胞染色及標記觀察
2.2.1 免疫熒光染色 熒光顯微鏡下見，部分 AP 細胞呈 Stro-1 標記陽性，Stro-1 蛋白分布于 AP 細胞表面，呈顆粒狀鑲嵌于細胞膜中。見圖 3。
圖3
AP 細胞免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×10） a. 疊加圖；b. Stor-1 細胞膜染色；c. 羅丹明細胞骨架染色；d. DAPI 細胞核染色
Figure3.
Immunofluorescent staining of AP cells (Fluorescence microscope×10) a. Merge; b. Immunofluorescent staining of cell membrane; c. Immunofluorescent staining of cytoskeleton; d. DAPI staining of cell nucleus
2.2.2 PKH26 標記 熒光顯微鏡下觀察，PKH26 染料與 AP 細胞結合良好，其均勻分布于 AP 細胞胞膜上，陽性細胞率達 100%。標記后 AP 細胞形態良好，可用于后續實驗。見圖 4。
圖4
PKH26 標記的 AP 細胞觀察（熒光顯微鏡×20） a. AP 細胞熒光表達情況；b. AP 細胞形態
Figure4.
Observation of AP cells labelled by PKH26 (Fluorescence microscope×20) a. Fluorescent expression of AP cells; b. Morphological observation of AP cells
2.3 間充質層脫細胞基質與 AP 細胞復合培養
復合培養 7 d，與對照組相比，熒光顯微鏡下見實驗組 PKH26 標記的 AP 細胞均勻分布于脫細胞基質材料上；HE 染色示，實驗組 AP 細胞主要分布于脫細胞基質表面，部分 AP 細胞遷徙至脫細胞基質內部。見圖 5。
圖5
間充質層脫細胞基質與 AP 細胞復合培養 7 d 觀察
從左至右分別為對照組、實驗組 a. 熒光顯微鏡觀察（×10）；b. HE 染色觀察（×10）
Figure5. Observation of the acelluar matrix tissue in vitro after co-cultured with AP cells for 7 daysFrom left to right for control group and experimental group, respectively a. Fluorescence microscope (×10); b. HE staining (×10)
2.4 動物體內實驗觀察
移植 7 d 后，熒光顯微鏡下見，實驗組 AP 細胞存活于間充質層脫細胞基質表面，并且有部分細胞向脫細胞基質內部遷徙，在不同組織塊交接處出現大團熒光聚集；對照組為陰性表達。HE 染色觀察，實驗組可見大團細胞聚集，并由聚集處向脫細胞基質內部遷徙；對照組移植脫細胞基質邊緣有少量裸鼠真皮細胞自發遷徙，不同組織塊交接處幾乎無細胞。
移植 21 d 后，熒光顯微鏡下見，實驗組 AP 細胞較 7 d 時進一步增殖并擴散至間充質層脫細胞基質內部；對照組仍為陰性表達。HE 染色觀察，實驗組脫細胞基質內部細胞較 7 d 時進一步增加，且內部出現穿行血管，血管四周由細胞包裹；對照組自體遷徙進入脫細胞基質的細胞進一步增多，部分組織塊趨于融合，且沒有壞死跡象。見圖 6、7。
圖6
體內移植各時間點熒光顯微鏡觀察（×10）
a. 對照組移植 7 d；b. 實驗組移植 7 d；c. 對照組移植 21 d；d. 實驗組移植 21 d
Figure6. Fluorescence microscope observation of the acelluar matrix tissue at different time points after transplantation in vivo (×10)a. Control group at 7 days; b. Experimental group at 7 days; c. Control group at 21 days; d. Experimental group at 21 days
圖7
體內移植各時間點 HE 染色觀察（×10）
a. 對照組移植 7 d；b. 實驗組移植 7 d；c. 對照組移植 21 d；d. 實驗組移植 21 d
Figure7. HE staining of the acellular matrix tissue at different time points after transplantation in vivo (×10)a. Control group at 7 days; b. Experimental group at 7 days; c. Control group at 21 days; d. Experimental group at 21 days
3 討論
軟骨組織工程為解決軟骨類疾病，如關節軟骨磨損提供了新方法，其中軟骨組織脫細胞基質材料由于富含天然生長因子、良好的生物相容性、生物力學特性等成為近年來相關研究熱點之一[20-22]。目前，多種不同來源的軟骨組織已被成功制備為軟骨脫細胞基質材料，包括豬關節軟骨、兔耳軟骨、兔關節軟骨、人自體關節軟骨等，但鹿茸軟骨的脫細胞基質材料相關研究較少。鹿茸是天然的骨軟骨器官，其中的間充質層為鹿茸的生長中心，同時也是 MSCs 所在區域，其為干細胞提供了所需的微環境，即細胞外基質成分。正常軟骨組織的細胞外基質中有機成分主要為膠原蛋白，約占 90%，余下為蛋白酶類以及多種非膠原蛋白，例如骨連接蛋白、纖維連接蛋白、骨鈣素等[23]，而生長因子含量較少或缺失。而鹿茸軟骨脫細胞基質材料在提供傳統軟骨基質組分的同時，還能提供多種生長因子，幫助種子細胞在體內進一步增殖和分化。鹿茸軟骨組織與其他軟骨相比，含有豐富的血管系統，正是豐富的血供保證了鹿茸的快速生長。本課題組系列研究中，經掃描電鏡發現，與普通軟骨組織不同，鹿茸的軟骨基質中含有綜合交錯的網絡結構，既有橫向軟骨陷窩結構又有縱向的血管管腔結構。而良好的孔隙便于軟骨細胞營養物質的供應及代謝廢物排出[24]。因此，鹿茸軟骨這一結構特點具有以下優勢：① 有利于脫細胞處理過程中脫細胞試劑的灌注，如核酸清除劑等；② 有利于脫細胞基質材料的制備；③ 有利于種子細胞的進入及新生血管的侵入，從而保障種子細胞的成活效率。本研究制備了鹿茸軟骨間充質層脫細胞基質，HE染色和 DAPI 染色結果顯示，脫細胞處理后間充質層組織中無細胞核存在，DNA 含量檢測發現，脫細胞處理后基質材料中 DNA 含量低至（19.367±5.254）ng/mg，國際上將每毫克干組織中 DNA 含量<50 ng/mg 定義為脫細胞處理成功[25]，對比脫細胞處理前后DNA含量，說明脫細胞處理成功，僅保留了細胞外基質組分。
軟骨組織工程中制備的脫細胞基質材料必須具有良好的生物組織相容性，適于種子細胞的存活及增殖[26]。本研究中，我們選擇了 AP 細胞與脫細胞基質材料結合后移植入裸鼠體內（實驗組）和脫細胞基質材料單獨移植（對照組）兩種方式。首先，在離體情況下 AP 細胞接種后迅速布滿材料表面，7 d 后有少量細胞遷徙至組織內部。種子細胞結合脫細胞基質材料修復組織缺損的過程中，種子細胞與材料的黏附是基礎，細胞必須與材料發生適當的黏附才能進行遷移、分化和增殖[27]。本實驗中，接種的 AP 細胞在爬布于材料表面的同時，還有少數細胞進一步浸潤遷徙至組織內部，說明制備的脫細胞基質材料在離體情況下適于種子細胞的黏附及進一步增殖。其次，評價生物材料組織相容性的另一標準是體內植入[28]。將復合培養 7 d 的脫細胞基質植入裸鼠體內 21 d 后，HE 檢測發現，種子細胞在組織內部進一步增殖并產生功能，誘導血管新生；而對照組單獨移植鹿茸軟骨脫細胞基質后，移植的基質材料沒有抑制裸鼠真皮細胞增殖，反而有部分細胞遷移至組織內部，說明制備的脫細胞基質材料具有良好的生物相容性。
綜上述，本研究成功建立了鹿茸軟骨間充質層組織的脫細胞方法，間充質層脫細胞基質有利于種子細胞的黏附及增殖，具有良好組織相容性。我們下一步研究將參照 ISO10993-1 生物學評價和試驗標準，對鹿茸間充質層組織脫細胞基質材料的生物相容性進行全面評估，包括體外細胞毒性、全身急性毒性、亞急性毒性、溶血實驗、熱原實驗等，以及該材料的功能性應用研究，如軟骨修復。由于鹿茸具有類似于生長板的多個分層，包括間充質層、前成軟骨層、過渡區、軟骨層，在完成間充質層的脫細胞基質材料制備后，還需要對前成軟骨層等 3 個分層組織進一步進行脫細胞研究，并發掘相關材料的特性進行功能研究。
由創傷和各種疾病導致的關節軟骨缺損臨床常見，由于軟骨內無血管，缺乏血液供應，缺損后自身修復能力有限[1-3]。目前，臨床治療關節軟骨損傷方法較多，包括軟骨或骨膜移植、軟骨下骨鉆孔以及關節削磨成形術等，但均不能實現長期的軟骨修復[4]。隨著組織工程技術的發展，脫細胞基質材料，特別是軟骨脫細胞基質材料，成為了修復軟骨組織的一種新材料[5-7]。大量動物實驗及臨床研究發現，應用自體軟骨組織或同種異體、異種脫細胞基質作為支架材料修復軟骨組織缺損的方法僅適合小范圍軟骨缺損修復[8-10]，由于缺乏充足營養供應或血管化不及時，大段軟骨缺損修復效果不理想[11-12]。
鹿茸是一種骨軟骨組織復合物，其軟骨組織中富含血管、多種軟骨/骨生成相關因子[13-15]，可以作為一種良好的軟骨脫細胞基質材料來源。鹿茸尖部至基部分為間充質層、前成軟骨層、過渡區、軟骨層，間充質層是鹿茸能快速生長的關鍵組織[16]。研究發現，鹿茸間充質層細胞可以被多種干細胞標記物標記，且處于快速分裂狀態[17]。因此，本研究以鹿茸軟骨間充質層為研究對象，制備脫細胞基質材料并評價其脫細胞效果；同時將其移植至裸鼠體內，觀察間充質層脫細胞基質組織相容性，并研究鹿茸干細胞即生茸區骨膜（antlerogenic perios-teum，AP）細胞結合脫細胞基質材料在活體內誘導血管生成的情況。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗材料及主要試劑、儀器
3 頭梅花鹿的標準二杠鹿茸，由中國農業科學院特產研究所實驗鹿場提供。48 日齡雄性裸鼠（BALB/c-nu）6 只，平均體質量 35 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。原代 AP 細胞由本實驗室保存。
彈力蛋白酶、抑肽酶、RNA 酶、DNA 酶、PKH26 細胞熒光染色試劑盒（Sigma 公司，美國）；DNA 提取試劑盒（Promega 公司，美國）；Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠免疫熒光染色試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；Stro-1 抗體（Abcam 公司，英國）；DMEM、FBS（GIBCO 公司，澳大利亞）。
Bullet Blender 細胞組織破碎儀（Next Advance 公司，美國）；酶標儀（BioTek 公司，美國）；組織切片機（Leica 公司，德國）；細胞培養箱（SANYO 公司，日本）；熒光顯微鏡（AMG 公司，美國）；倒置顯微鏡（Olympus 公司，日本）。
1.2 間充質層脫細胞基質制備及觀測
1.2.1 間充質層脫細胞基質制備 取鹿茸按照 Li 等[18]方法進行組織分層，獲得鹿茸軟骨間充質層組織，切割成大小為 0.2 mm × 0.2 mm 的組織塊，PBS 沖洗數次去除血液和污漬后，4℃ 冰箱保存備用。參照 Utomo 等 [19]的軟骨脫細胞方法并進行改良，具體步驟：① 將組織塊置于低滲溶液中連續凍融 2 個周期，每個周期 –20℃ 凍 12 h、4℃ 融 12 h，然后置于 45℃ 低滲溶液中孵育 24 h；② 置于去離子劑中振蕩處理 24 h，然后于洗滌液中常溫振蕩清洗 2 次，每次 30 min；③ 45℃，于洗滌劑中振蕩孵育 24 h；④ 37℃，于低濃度彈力蛋白酶溶液中振蕩處理 24 h，然后洗滌液中常溫振蕩清洗 2 次，每次 30 min；⑤ 37℃，于核酸清除液中振蕩孵育 3 h，然后洗滌液中常溫振蕩清洗 2 次，每次 30 min；⑥ 于去污劑中振蕩洗滌 3 h，然后洗滌液中常溫振蕩洗滌 2 次，每次 30 min；⑦ 45℃，于 PBS 中振蕩處理 24 h。脫細胞處理結束后，將標本置于低滲溶液中，4℃ 冰箱保存備用。
1.2.2 脫細胞效果評價 ① 組織學觀察：取脫細胞基質材料置于 4% 多聚甲醛固定，制作石蠟切片，片厚 5 μm，常規行 HE 染色和 DAPI 染色，于光鏡及熒光顯微鏡下分別觀察脫細胞處理后殘留細胞量以及基質內纖維組織狀態。② DNA 含量檢測：稱取 20 mg 脫細胞基質材料，按照 DNA 提取試劑盒說明書步驟進行 DNA 提取，使用酶標儀測定 DNA 濃度。實驗重復 3 次。以上兩檢測指標均取未行脫細胞處理的間充質層組織作為對照。
1.3 間充質層脫細胞基質與 AP 細胞復合培養觀察
1.3.1 AP 細胞免疫熒光染色觀察 取原代 AP 細胞常規復蘇并傳至第 2 代，按照 1×104 個/孔密度接種于含有多聚賴氨酸爬片的 24 孔板中；常規培養 24 h 后，4% 多聚甲醛固定爬片 15 min，PBS 浸洗玻片 3 次，吸干 PBS，滴加正常山羊血清，室溫封閉 30 min；吸棄封閉液，滴加一抗 Stro-1，濕盒中 4℃ 孵育過夜；同型對照代替一抗 Stro-1 作為陰性對照。TBST 浸洗爬片 3 次，吸干爬片上多余液體后滴加二抗 Alexa Fluor 488，濕盒中 37℃ 孵育 1 h，TBST 浸洗 3 次；吸干液體后滴加 20 μL 羅丹明染液，濕盒中室溫下染色 20 min，TBST 浸洗 3 次；滴加 DAPI 避光孵育 5 min，TBST 浸洗 3 次；吸干液體后封片，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光標記的 Stro-1 蛋白在 AP 細胞膜表面表達情況。
1.3.2 PKH26 標記 AP 細胞 取原代 AP 細胞常規復蘇并傳至第 2 代，消化后 1 mL DMEM 培養基（含 10% FBS 及青、鏈霉素各 100 U/mL）重懸，計數細胞為 5×106 個。按 PKH26 細胞熒光染色試劑盒操作說明書進行操作，將 1 μL 染料與 0.5 mL 稀釋液 C 混合均勻后，加至細胞懸液中混合，于 37℃ 細胞培養箱中孵育 3 min，然后加入同體積 FBS 中和反應。細胞混合液以 1 000×g、離心 5 min 后，去除上清，加入 1 mL DMEM 培養基重懸后進行常規 AP 細胞培養，培養 2 d 后熒光顯微鏡下觀察 PKH26 標記結果。以等量 PBS 代替細胞混合液作為陰性對照，其余操作相同。
1.3.3 復合培養觀察 待 1.3.2 中 PKH26 標記的 AP 細胞長滿后進行消化處理，計數細胞為 2×107 個，以 2 mL DMEM 培養基重懸；取 20 mg 間充質層脫細胞基質加至重懸液中，室溫下孵育 5 min，將基質連同細胞懸浮液一同轉移至 6 孔培養板，再加入 1 mL DMEM 培養基，于 37℃、5%CO 2 細胞培養箱內進行常規培養，作為實驗組。每隔 2 d 換液 1 次。對照組為 1.3.2 中等量 PBS 代替細胞混合液，其余操作相同；即不接種 PKH26 標記的 AP 細胞、只進行脫細胞基質空培養。培養 7 d 后，取兩組樣本同 1.2.2 方法制備石蠟切片，常規 HE 染色，光鏡下觀察。另外，熒光顯微鏡下觀察 PKH26 標記的 AP 細胞在材料表面分布情況。
1.4 動物體內實驗
取 6 只裸鼠，腹腔注射 0.1 mL 10% 水合氯醛麻醉后，腹股溝處消毒。取 1.3.3 中培養 7 d 的實驗組及對照組樣本，分別移植至每只裸鼠左、右側腹股溝，每側 20 mg。見圖 1。移植后 7、21 d，分別取 3 只裸鼠同上法麻醉后，按照原切口入路取出移植物。取部分樣本制備冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察 PKH26 標記的 AP 細胞在體內增殖及遷移情況；部分樣本制備石蠟切片，常規 HE 染色后光鏡下觀察。
圖1
間充質層脫細胞基質植入裸鼠操作步驟 a. 間充質層脫細胞基質；b. 移植部位；c. 于無菌操作臺中將間充質層脫細胞基質植入裸鼠腹股溝部
Figure1.
The process of transplantation of M layer acelluar matrix into nude mice a. M layer acellular matrix for transplantation; b. Location of transplantation; c. Transplantation of M layer acellular matrix into nude mice by sterile operation
1.5 統計學方法
采用 SPSS 20.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 脫細胞處理效果評價
2.1.1 組織學觀察 HE 染色顯示，脫細胞處理前，間充質層組織細胞排列緊密，大部分細胞胞核細長，排列方向與生長軸垂直，少數與生長軸平行，存在血管前體結構。脫細胞處理后，細胞完全從間充質層組織中脫去，留下空隙均勻的基質材料。DAPI 染色顯示，脫細胞處理前，間充質層組織內細胞核明顯；脫細胞處理后，間充質層組織內無細胞核。見圖 2。
圖2
脫細胞前后間充質層組織學觀察 從左至右分別為脫細胞處理前及處理后 a. HE 染色（×10）；b. DAPI 染色（熒光顯微鏡×20）
Figure2.
Histological observation of M layer tissue before and after cell extraction From left to right for M layer tissue before and after cell extraction, respectively a. HE staining (×10); b. DAPI staining (Fluorescence microscope×20)
2.1.2 DNA 含量檢測 脫細胞處理前，間充質層組織內 DNA 含量為（3 805.500±519.119）ng/mg，脫細胞處理后為（19.367±5.254）ng/mg，比較差異有統計學意義（t=12.630，P=0.000）。
2.2 AP 細胞染色及標記觀察
2.2.1 免疫熒光染色 熒光顯微鏡下見，部分 AP 細胞呈 Stro-1 標記陽性，Stro-1 蛋白分布于 AP 細胞表面，呈顆粒狀鑲嵌于細胞膜中。見圖 3。
圖3
AP 細胞免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×10） a. 疊加圖；b. Stor-1 細胞膜染色；c. 羅丹明細胞骨架染色；d. DAPI 細胞核染色
Figure3.
Immunofluorescent staining of AP cells (Fluorescence microscope×10) a. Merge; b. Immunofluorescent staining of cell membrane; c. Immunofluorescent staining of cytoskeleton; d. DAPI staining of cell nucleus
2.2.2 PKH26 標記 熒光顯微鏡下觀察，PKH26 染料與 AP 細胞結合良好，其均勻分布于 AP 細胞胞膜上，陽性細胞率達 100%。標記后 AP 細胞形態良好，可用于后續實驗。見圖 4。
圖4
PKH26 標記的 AP 細胞觀察（熒光顯微鏡×20） a. AP 細胞熒光表達情況；b. AP 細胞形態
Figure4.
Observation of AP cells labelled by PKH26 (Fluorescence microscope×20) a. Fluorescent expression of AP cells; b. Morphological observation of AP cells
2.3 間充質層脫細胞基質與 AP 細胞復合培養
復合培養 7 d，與對照組相比，熒光顯微鏡下見實驗組 PKH26 標記的 AP 細胞均勻分布于脫細胞基質材料上；HE 染色示，實驗組 AP 細胞主要分布于脫細胞基質表面，部分 AP 細胞遷徙至脫細胞基質內部。見圖 5。
圖5
間充質層脫細胞基質與 AP 細胞復合培養 7 d 觀察
從左至右分別為對照組、實驗組 a. 熒光顯微鏡觀察（×10）；b. HE 染色觀察（×10）
Figure5. Observation of the acelluar matrix tissue in vitro after co-cultured with AP cells for 7 daysFrom left to right for control group and experimental group, respectively a. Fluorescence microscope (×10); b. HE staining (×10)
2.4 動物體內實驗觀察
移植 7 d 后，熒光顯微鏡下見，實驗組 AP 細胞存活于間充質層脫細胞基質表面，并且有部分細胞向脫細胞基質內部遷徙，在不同組織塊交接處出現大團熒光聚集；對照組為陰性表達。HE 染色觀察，實驗組可見大團細胞聚集，并由聚集處向脫細胞基質內部遷徙；對照組移植脫細胞基質邊緣有少量裸鼠真皮細胞自發遷徙，不同組織塊交接處幾乎無細胞。
移植 21 d 后，熒光顯微鏡下見，實驗組 AP 細胞較 7 d 時進一步增殖并擴散至間充質層脫細胞基質內部；對照組仍為陰性表達。HE 染色觀察，實驗組脫細胞基質內部細胞較 7 d 時進一步增加，且內部出現穿行血管，血管四周由細胞包裹；對照組自體遷徙進入脫細胞基質的細胞進一步增多，部分組織塊趨于融合，且沒有壞死跡象。見圖 6、7。
圖6
體內移植各時間點熒光顯微鏡觀察（×10）
a. 對照組移植 7 d；b. 實驗組移植 7 d；c. 對照組移植 21 d；d. 實驗組移植 21 d
Figure6. Fluorescence microscope observation of the acelluar matrix tissue at different time points after transplantation in vivo (×10)a. Control group at 7 days; b. Experimental group at 7 days; c. Control group at 21 days; d. Experimental group at 21 days
圖7
體內移植各時間點 HE 染色觀察（×10）
a. 對照組移植 7 d；b. 實驗組移植 7 d；c. 對照組移植 21 d；d. 實驗組移植 21 d
Figure7. HE staining of the acellular matrix tissue at different time points after transplantation in vivo (×10)a. Control group at 7 days; b. Experimental group at 7 days; c. Control group at 21 days; d. Experimental group at 21 days
3 討論
軟骨組織工程為解決軟骨類疾病，如關節軟骨磨損提供了新方法，其中軟骨組織脫細胞基質材料由于富含天然生長因子、良好的生物相容性、生物力學特性等成為近年來相關研究熱點之一[20-22]。目前，多種不同來源的軟骨組織已被成功制備為軟骨脫細胞基質材料，包括豬關節軟骨、兔耳軟骨、兔關節軟骨、人自體關節軟骨等，但鹿茸軟骨的脫細胞基質材料相關研究較少。鹿茸是天然的骨軟骨器官，其中的間充質層為鹿茸的生長中心，同時也是 MSCs 所在區域，其為干細胞提供了所需的微環境，即細胞外基質成分。正常軟骨組織的細胞外基質中有機成分主要為膠原蛋白，約占 90%，余下為蛋白酶類以及多種非膠原蛋白，例如骨連接蛋白、纖維連接蛋白、骨鈣素等[23]，而生長因子含量較少或缺失。而鹿茸軟骨脫細胞基質材料在提供傳統軟骨基質組分的同時，還能提供多種生長因子，幫助種子細胞在體內進一步增殖和分化。鹿茸軟骨組織與其他軟骨相比，含有豐富的血管系統，正是豐富的血供保證了鹿茸的快速生長。本課題組系列研究中，經掃描電鏡發現，與普通軟骨組織不同，鹿茸的軟骨基質中含有綜合交錯的網絡結構，既有橫向軟骨陷窩結構又有縱向的血管管腔結構。而良好的孔隙便于軟骨細胞營養物質的供應及代謝廢物排出[24]。因此，鹿茸軟骨這一結構特點具有以下優勢：① 有利于脫細胞處理過程中脫細胞試劑的灌注，如核酸清除劑等；② 有利于脫細胞基質材料的制備；③ 有利于種子細胞的進入及新生血管的侵入，從而保障種子細胞的成活效率。本研究制備了鹿茸軟骨間充質層脫細胞基質，HE染色和 DAPI 染色結果顯示，脫細胞處理后間充質層組織中無細胞核存在，DNA 含量檢測發現，脫細胞處理后基質材料中 DNA 含量低至（19.367±5.254）ng/mg，國際上將每毫克干組織中 DNA 含量<50 ng/mg 定義為脫細胞處理成功[25]，對比脫細胞處理前后DNA含量，說明脫細胞處理成功，僅保留了細胞外基質組分。
軟骨組織工程中制備的脫細胞基質材料必須具有良好的生物組織相容性，適于種子細胞的存活及增殖[26]。本研究中，我們選擇了 AP 細胞與脫細胞基質材料結合后移植入裸鼠體內（實驗組）和脫細胞基質材料單獨移植（對照組）兩種方式。首先，在離體情況下 AP 細胞接種后迅速布滿材料表面，7 d 后有少量細胞遷徙至組織內部。種子細胞結合脫細胞基質材料修復組織缺損的過程中，種子細胞與材料的黏附是基礎，細胞必須與材料發生適當的黏附才能進行遷移、分化和增殖[27]。本實驗中，接種的 AP 細胞在爬布于材料表面的同時，還有少數細胞進一步浸潤遷徙至組織內部，說明制備的脫細胞基質材料在離體情況下適于種子細胞的黏附及進一步增殖。其次，評價生物材料組織相容性的另一標準是體內植入[28]。將復合培養 7 d 的脫細胞基質植入裸鼠體內 21 d 后，HE 檢測發現，種子細胞在組織內部進一步增殖并產生功能，誘導血管新生；而對照組單獨移植鹿茸軟骨脫細胞基質后，移植的基質材料沒有抑制裸鼠真皮細胞增殖，反而有部分細胞遷移至組織內部，說明制備的脫細胞基質材料具有良好的生物相容性。
綜上述，本研究成功建立了鹿茸軟骨間充質層組織的脫細胞方法，間充質層脫細胞基質有利于種子細胞的黏附及增殖，具有良好組織相容性。我們下一步研究將參照 ISO10993-1 生物學評價和試驗標準，對鹿茸間充質層組織脫細胞基質材料的生物相容性進行全面評估，包括體外細胞毒性、全身急性毒性、亞急性毒性、溶血實驗、熱原實驗等，以及該材料的功能性應用研究，如軟骨修復。由于鹿茸具有類似于生長板的多個分層，包括間充質層、前成軟骨層、過渡區、軟骨層，在完成間充質層的脫細胞基質材料制備后，還需要對前成軟骨層等 3 個分層組織進一步進行脫細胞研究，并發掘相關材料的特性進行功能研究。
