引用本文： 陳琪, 馬龍冰, 楊曦, 劉立岷, 宋躍明. 缺氧誘導因子對椎間盤調控作用的研究現狀. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(10): 1295-1300. doi: 10.7507/1002-1892.20160263 復制
隨著中國步入老齡化社會，椎間盤退變性疾病（intervertebral disc degeneration，IVD）成為影響人類健康及降低生活質量的臨床常見病、多發病。據統計，超過80%的成年人一生中出現過因IVD引起的下腰痛[1]，且該病是引起45歲以下成年人喪失勞動能力的主要原因之一，進而導致巨大的經濟損失[2-3]。所以，對IVD的研究具有極大的社會意義。
椎間盤是人體最大的無血管組織，氧、葡萄糖等營養物質主要通過擴散作用經軟骨終板和內層纖維環到達髓核組織。因此，椎間盤組織，尤其是髓核組織是在一個氧濃度低、物質交換條件極差的環境中。其中，缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）是細胞應對缺氧環境的關鍵轉錄因子，其廣泛分布于人體各器官中[4]。在低氧環境中，HIF可通過調節靶基因表達，誘導細胞級聯反應，適應低氧環境[5-6]。因此，在腫瘤、腦缺血、心肌梗死、休克、周圍血管閉塞等缺血缺氧性疾病中，HIF的調節是一潛在治療方案[7]。本文現對HIF調節椎間盤細胞功能作一綜述，為通過靶向調節HIF治療椎間盤退變提供理論依據。
1 HIF的基本情況
1.1 HIF的發現和組成
Semenza等[5]在1992年首先發現并報道了HIF，他們對人肝癌細胞株Hep3B的研究發現，HIF在缺氧狀態下，結合促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）基因 3’端缺氧反應元件（hypoxia response element，HRE），促進EPO基因轉錄和蛋白合成。同時該研究發現，HIF包括HIF-1、HIF-2、HIF-3 3種亞型，屬于bHLH-PAS蛋白家族，每一種亞型均為由α和β亞基構成的異二聚體。目前，對HIF 3種亞型的研究以HIF-1最為深入，尤其是HIF-1α。現已知人HIF-1α定位于常染色體14q21-q24[8]，其在細胞、組織、器官的氧濃度＜6%（＜40 mm Hg） 時呈指數增長[9]，并促進靶基因的轉錄活性，維持組織細胞在低氧環境中的生存和功能。
1.2 HIF的降解通路
Huang等[10]首先在HIF-1α中發現了氧依賴降解結構域（oxygen-dependent degradation domain，ODD）。Epstein等[11]通過對秀麗隱桿線蟲基因研究，發現了由egl-9基因編碼的脯氨酰羥化酶（prolyl hydroxylase，PHD），該基因編碼的PHD可與HIF-1α蛋白中的ODD結合，降解HIF-1α，但當egl-9基因突變后，HIF-1α蛋白將呈持續表達狀態。并且，該研究者在哺乳動物中發現PHD的3個等位基因，由其分別編碼3種PHD（PHD-1～3）。
PHD屬于2-酮戊二酸/鐵依賴性雙加氧酶超家族，其需要氧和鐵作為反應底物。在正常氧濃度下，PHD激活，將HIF-α ODD區域402和564位脯氨酸殘基（Pro-402、Pro-564）羥化，羥化的脯氨酸殘基被VHL腫瘤抑制蛋白的β區識別，繼而通過泛素-蛋白酶體途徑降解，其半衰期＜5 min[12]。當缺氧時，PHD活性受到抑制，HIF-α降解受阻，其與HIF-β結合形成HIF異二聚體，促進下游靶基因的活性。其中，Fe2+和2-酮戊二酸是PHD激活的關鍵因子，而氧則是其限速因子[13-14]。
除了上述ODD區域脯氨酸羥化降解途徑外，HIF-α還受天門冬氨酸羥化調節其轉錄活性功能。α亞基中存在反式轉錄激活域（trans-activation domains，TAD），包括N-TAD和C-TAD。其中，N-TAD因與ODD部分重疊而主要通過脯氨酸羥化途徑降解；而C-TAD與ODD有一定距離，但其同樣受氧依賴性羥化反應調節。正常氧濃度時，天門冬氨酸羥化酶激活，該酶又被稱為HIF抑制因子（factor inhibiting HIF，FIH-1）。C-TAD上的天門冬氨酸（HIF-1α：Asn-803；HIF-2α：Asn-851）被FIH-1羥化，使其無法結合共激活因子p300/CBP，致使HIF的功能受到抑制，無法對靶基因進行誘導。而缺氧時，FIH-1功能受抑制，HIF-α可與HIF-β、p300/CBP結合，對靶基因進行調控[15]。
1.3 HIF的生理功能
絕大多數哺乳動物的胚胎在發育時氧濃度維持在1%～5%的低氧狀態，而氧作為胚胎多系統發育的成形素，具有重要作用。在這種低氧環境中，氧發揮作用依賴于HIF的功能[16]。例如HIF-1α和HIF-2α對胚胎循環系統的發育成熟具有不可替代的作用，缺乏該蛋白將導致胚胎死亡[17-18]。除了對胚胎循環系統發育影響外，在特定細胞中敲除HIF-1α的研究發現，其對成軟骨作用、成骨作用、脂肪形成、B淋巴細胞發育、T淋巴細胞分化、造血系統形成、免疫系統形成等方面均有重要作用[19-25]。然后，胚胎組織缺氧導致的HIF過度表達同樣會影響胎盤血流紊亂，進而胚胎發育異常而出現先天性發育畸形[26]。所以，胚胎發育過程中，HIF的穩定表達能調節各器官系統的發育，HIF缺失和過度表達均會引起不同程度損害。
另一方面，HIF-1α和HIF-2α對細胞耐受缺氧也具有重要作用，當HIF-1α等位基因中的1條突變后，細胞對于慢性缺氧的生理耐受性明顯缺乏，表現在無法代償性合成紅細胞、肺動脈高壓、右心室高壓、肺臟血管重構和電生理反應減弱等[27-28]。例如，將缺乏HIF-1α等位基因的鼠頸動脈體進行體外研究，發現其喪失對缺氧的神經生理反應，繼而發現部分缺失HIF-1α等位基因的鼠在急性缺氧環境中的反應是正常的，但對于慢性缺氧環境的適應性是明顯減弱[29]。
體內部分組織器官雖然其血供良好，但組織細胞生存環境仍處于低氧狀態，如軟骨等，HIF介導的通路在這些組織細胞的生長及分化中同樣具有調節作用。例如，對部分敲除HIF-1α基因鼠研究發現，其骨骺發育異常導致骨骼系統畸形，甚至影響氣管軟骨發育[19]；在胎盤形成階段，缺氧主導胎盤滋養層細胞增殖，避免分化成具有侵襲性的表型[30]；由HIF-1調控的靶基因產物TGF-β3的表達減少，而TGF-β3的表達與皮膚傷口愈合后瘢痕吸收有關[31]。
綜上，HIF在組織器官內的作用主要還是以維持細胞在缺氧狀態下的生存、增殖、分化、適應生存環境為主。
2 HIF在椎間盤中的作用
2.1 HIF調節椎間盤退變的理論基礎
目前已知椎間盤是人體中最大的無血管組織，其中的髓核組織距離最近的血管4～8 mm[32]，其能量供應和物質交換主要通過軟骨終板和內層纖維環的擴散作用到達髓核組織。所以，髓核組織的物質交換能力有限，而氧濃度也明顯低于周圍組織。當椎間盤退變發生時，軟骨終板鈣化、纖維環增厚等將導致髓核組織物質交換能力和氧濃度進一步惡化。
細胞對于缺氧環境的反應有一系列較為嚴格的病理生理機制，這種機制從低等級的蠕蟲、蒼蠅到高等級的哺乳動物都是相對保守的，而其中HIF對細胞缺氧狀態的調節有著關鍵作用[33]。Loinard等[34]采用結扎鼠下肢股動脈建立下肢缺血模型，通過提高HIF-1α蛋白表達，結果發現14 d后下肢側枝循環建立，足的血供明顯增加。在對冠心病患者的研究中發現，HIF-1α與側枝旁路形成有關，且其表達有助于形成穩定性心絞痛，避免心肌梗死[35-36]。因此，HIF在一系列缺血、缺氧性疾病，如心肌梗死、周圍血管閉塞、傷口愈合、糖尿病血管并發癥、創傷性休克、腫瘤等方面，發揮著重要作用，其可誘導新生血管生長、穩定能量供應、增加組織細胞對缺血缺氧的耐受性[37-38]。
椎間盤髓核細胞同樣處于物質交換能力差、氧濃度低的環境中，相關研究已證實HIF存在于髓核組織內，并對髓核細胞適應這種環境有調節作用。Merceron等[39]研究HIF-1α對老鼠胚胎發育的影響，不但證明了椎間盤內存在HIF-1α表達，更證明了其對胚胎椎間盤發育，尤其是髓核組織形成的重要作用；Agrawal等[40]培養人和老鼠髓核細胞驗證了HIF-1α的表達；同樣，Ha等[41]也證實了在人髓核細胞內存在HIF。繼而HIF對椎間盤的調控機制得到了深入研究。現已發現，HIF-1α通路的激活對髓核細胞的存活、生長、代謝調節和基質合成均發揮一定作用[40, 42]。
2.2 HIF在椎間盤內分布情況
完整的椎間盤結構包括外層的纖維環組織、中間的髓核組織及上下軟骨終板組織。因毛細血管散在分布于纖維環、上下軟骨終板外圍，氧濃度從外到內呈逐漸下降趨勢，即存在氧濃度梯度[43]；而缺氧可誘導HIF表達。所以，研究者們設想在椎間盤組織內，HIF的表達是否存在梯度變化？Risbud等[44]對人、鼠、羊髓核細胞進行培養，發現均可表達HIF-1α，且表達量顯著高于纖維環細胞、軟骨細胞和成骨細胞。Richardson等[45]將人正常和退變椎間盤研究發現，HIF-1α只表達于髓核細胞。Rajpurohit等[43]通過培養鼠髓核細胞、纖維環細胞和軟骨細胞，發現髓核細胞內HIF-1α表達高于纖維環細胞和軟骨細胞。因此，椎間盤組織中不但存在HIF的表達，而且表達程度也同樣存在梯度變化，即髓核組織中HIF的表達最高。
髓核組織是椎間盤主要結構和行使功能的部位，髓核組織的完整性維系著椎間盤結構和功能的完整。HIF在髓核組織中的相對高表達，也反映著其對髓核組織調控的相對重要作用。
2.3 HIF調節髓核組織的發育和分化
Merceron等[39]通過鼠雜交獲得脊索細胞中缺失HIF-1α基因型的鼠胚胎，對其研究發現，缺失HIF-1α基因鼠在胚胎期，髓核細胞呈無特征性的空泡結構，髓核組織小于對照組；出生時，髓核細胞因糖代謝異常大量死亡；出生1個月后，髓核細胞被不來源于脊索組織的纖維軟骨組織替代，這種變化為椎間盤退變的常見現象；出生2個月后，椎間隙高度降低，髓核組織體積進一步變小；出生4個月后，脊柱節段活動度下降40%，椎間盤吸收和傳導負荷的功能明顯下降。但各時間段纖維環和軟骨終板均未見明顯異常。作者認為這是因HIF-1α的缺失，導致叉頭框A2基因活性下降、甚至抑制，引起細胞缺氧；另外，HIF-1α的缺失將導致髓核細胞無氧糖酵解過程受抑制，導致三磷酸腺苷（adenosine-triphosphate，ATP）供應不足。由此使髓核細胞發育、分化受影響，最終導致髓核細胞死亡。
因此，HIF-1α對髓核組織發育過程中的調控，如細胞分化及生存起中軸作用，HIF-1α缺失首先影響髓核細胞形態，然后導致死亡，最終引起髓核組織的消失。
2.4 HIF調節髓核細胞的生存
髓核組織內營養物質的吸收和代謝廢物的排出主要通過細胞外基質形成的滲透壓和流體靜水壓維持，細胞外基質的合成、分解受髓核細胞數量、功能的調控，因此，髓核細胞是維持髓核組織內環境穩定，繼而影響椎間盤功能的關鍵因子[46]。雖然髓核細胞生存在低氧環境中，但目前研究發現髓核細胞在低氧濃度環境中仍能保持細胞活性和功能[47-48]。所以，髓核細胞應該存在一些適應低氧環境的機制以維持其存活。
Fas和FasL系統是常見的介導細胞凋亡的通路，而在人突出椎間盤髓核細胞中發現了Fas和FasL的共表達[49]。Zeng等[50]在小鼠髓核細胞中發現，HIF-1α通過與半乳糖凝集素-3（galectin-3，gal-3）基因HRE結合，促進gal-3表達，而gal-3屬于β半乳糖苷結合動物凝集素家族，其可抑制Fas/FasL介導的髓核細胞凋亡和促進黏附。另外，髓核細胞表達的FasL可與入侵髓核組織的活化T細胞表面的Fas結合，促使T細胞凋亡，并抑制過多的病理性新生血管侵入，維持髓核組織處于免疫豁免狀態，保持細胞存活能力[51]。
此外，HIF-1α和HIF-2α調節p300結合蛋白cited2的表達，cited2蛋白含量的變化影響VEGF的表達，繼而通過VEGF/VEGFR級聯反應抑制髓核細胞凋亡[42, 46]。Risbud等[52-53]研究表明，HIF-1α表達可調節Akt及細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）的含量，而Akt和ERK能夠抑制半胱天冬酶及一氧化氮合成酶活性，進而抑制細胞凋亡的發生。因此，由HIF-1α和HIF-2α介導的級聯反應，在髓核細胞應對惡劣生存環境下維持生存發揮著必要的調節作用。
除了細胞凋亡外，細胞在缺氧、營養缺乏、感染等因素作用下，將會誘發自噬，以適應環境、促進細胞更新和生存[54-56]。而由HIF-1α調控的缺氧誘導機制是自噬的其中一條通路。HIF-1α通過上調靶基因B細胞淋巴瘤/白血病-2蛋白/腺病毒E1B 19kDa結合蛋白3[B cell lymphoma/lewkmia-2 （BCL2）/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3，BNIP3]、類BNIP3（BNIP3-like，BNIP3L）表達，抑制BCL2和芐氯素1蛋白相互反應，以增加自噬關鍵蛋白芐氯素1的表達，促進自噬。這一機制目前在對膠質母細胞瘤細胞、肺癌細胞、軟骨細胞等的研究中發現[57-59]。但是，HIF是否調控髓核細胞自噬，目前仍存在爭議。Choi等[60]最近研究發現，髓核細胞調節自噬是通過缺氧誘導、非HIF-1α依賴的非經典自噬途徑。但Wang等[61]認為，HIF通路是維持髓核細胞在缺氧環境中生存的機制之一。其他相關研究目前仍欠缺，故HIF調節髓核細胞自噬，以達到細胞自我保護和生存的機制需進一步研究。
2.5 HIF調節髓核細胞的能量代謝
研究發現，若抑制髓核細胞內無氧糖酵解過程，ATP在30 min內將下降約80%，并且在6 h后仍保持極低含量；但若抑制線粒體功能，在30 min和6 h后，對ATP含量無明顯影響[40]。說明髓核細胞在低氧濃度環境中，其能量代謝主要通過無氧糖酵解產 生。
在此過程中，HIF-1是多數糖酵解相關基因的關鍵轉錄誘導因子[62]。例如，葡萄糖轉運蛋白（glucose transporter，GLUT）是能量代謝中葡萄糖底物梯度轉運的主要跨膜蛋白，在人髓核細胞中，HIF-1α和GLUT-1、GLUT-3、GLUT-9共表達，并且HIF-1α的升高伴隨著后三者的升高，而這種表達變化一致現象不存在于纖維環細胞中[45]。另有研究指出，除了GLUT-1、GLUT-3是HIF-1α的靶基因外，GAPDH和6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-二磷酸酶（6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2，6-biphosphatase，PFKFB）同樣受HIF-1α調控，而GAPDH和PFKFB是糖酵解過程的關鍵酶[40]。
除了促進無氧糖酵解過程，HIF同時可抑制髓核細胞內線粒體氧化磷酸化過程。Papandreou等[62]發現HIF-1α能夠轉錄激活丙酮酸脫氫酶激酶-1，進而抑制丙酮酸脫氫酶，導致丙酮酸無法轉化為乙酰輔酶A，從而阻斷細胞中的三羧酸循環代謝。在缺氧狀態下這種能量代謝的轉變，主要是避免在缺氧狀態下，因線粒體氧化磷酸化過程中電子轉移能力下降，而產生氧自由基等損害細胞DNA的物質，即避免活性氧簇產生[63]。但髓核細胞內的線粒體功能并非完全被抑制，當葡萄糖轉運過度時，線粒體可通過脂肪酸代謝將過多的葡萄糖降解[40]。
2.6 HIF調節髓核組織內環境穩定
髓核組織維持功能依靠髓核細胞數量、功能和細胞外基質的穩定，其中，細胞外基質合成代謝和分解代謝平衡是細胞外基質含量保持恒定的先決條件。髓核組織細胞外基質主要由蛋白多糖和Ⅱ型膠原構成。Agrawal等[40]研究表明，當抑制HIF-1α后，聚集蛋白聚糖（Aggrecan）mRNA表達明顯下降，并且在蛋白水平也可見Aggrecan的下降，而HIF-1α表達能直接誘導Aggrecan mRNA表達和蛋白合成，或者通過硫酸鹽反應間接刺激Aggrecan的合成。Robins等[64]發現，HIF-1α調控Sox9基因表達，Sox9基因對Aggrecan和Ⅱ型膠原合成有重要作用。Tran等[65]近年研究發現，髓核組織中HIF-1α調控結締組織生長因子2（connective tissue growth factor 2，CCN2），進而促進Aggrecan的表達，而CCN2對HIF-1α具有負反饋調節作用，避免Aggrecan的過度表達，維持細胞外基質的穩定。
除了Aggrecan，蛋白多糖另一個主要成分糖胺多糖的合成也受HIF的調節。糖胺多糖是維持髓核組織處于凝膠狀態的大分子物質。葡萄糖是合成糖胺多糖的主要原料，GLUT通過將葡萄糖跨膜轉入髓核細胞促進糖胺多糖的合成。部分GLUT又是HIF-1的靶基因，所以，HIF-1通過GLUT促進糖胺多糖的合成[66]。
Fujita等[67]對引起椎間盤退變的多配體蛋白聚糖4（Syndecan 4，SDC4）的研究發現，HIF-1α可抑制SDC4 mRNA和蛋白的表達，進而上調整合素、血小板樣金屬蛋白酶5和Sox9，促進Aggrecan合成。另外，對維持髓核組織靜水壓起重要作用的水通道蛋白（aquaporin，AQP）的研究同樣證實，HIF-1α直接調控AQP1和AQP5，維持髓核組織靜水壓。而當椎間盤退變時，伴隨著HIF-1α的減少，AQP1和AQP5同樣減少，導致椎間盤靜水壓下降[68]。
3 展望
目前研究已發現HIF在椎間盤中可通過誘導下游靶基因轉錄，維持細胞生存和功能發揮、調節細胞能量代謝、維持組織內環境穩定，以應對椎間盤中缺血缺氧環境。因此，通過對椎間盤中HIF這一上游基因的研究，可能將進一步揭示椎間盤退變的機制。同時，通過對HIF基因靶點的調控，或許將為椎間盤退變性疾病基因治療和細胞移植治療中細胞移植物的改造提供新的思路和理論依據。
隨著中國步入老齡化社會，椎間盤退變性疾病（intervertebral disc degeneration，IVD）成為影響人類健康及降低生活質量的臨床常見病、多發病。據統計，超過80%的成年人一生中出現過因IVD引起的下腰痛[1]，且該病是引起45歲以下成年人喪失勞動能力的主要原因之一，進而導致巨大的經濟損失[2-3]。所以，對IVD的研究具有極大的社會意義。
椎間盤是人體最大的無血管組織，氧、葡萄糖等營養物質主要通過擴散作用經軟骨終板和內層纖維環到達髓核組織。因此，椎間盤組織，尤其是髓核組織是在一個氧濃度低、物質交換條件極差的環境中。其中，缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）是細胞應對缺氧環境的關鍵轉錄因子，其廣泛分布于人體各器官中[4]。在低氧環境中，HIF可通過調節靶基因表達，誘導細胞級聯反應，適應低氧環境[5-6]。因此，在腫瘤、腦缺血、心肌梗死、休克、周圍血管閉塞等缺血缺氧性疾病中，HIF的調節是一潛在治療方案[7]。本文現對HIF調節椎間盤細胞功能作一綜述，為通過靶向調節HIF治療椎間盤退變提供理論依據。
1 HIF的基本情況
1.1 HIF的發現和組成
Semenza等[5]在1992年首先發現并報道了HIF，他們對人肝癌細胞株Hep3B的研究發現，HIF在缺氧狀態下，結合促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）基因 3’端缺氧反應元件（hypoxia response element，HRE），促進EPO基因轉錄和蛋白合成。同時該研究發現，HIF包括HIF-1、HIF-2、HIF-3 3種亞型，屬于bHLH-PAS蛋白家族，每一種亞型均為由α和β亞基構成的異二聚體。目前，對HIF 3種亞型的研究以HIF-1最為深入，尤其是HIF-1α。現已知人HIF-1α定位于常染色體14q21-q24[8]，其在細胞、組織、器官的氧濃度＜6%（＜40 mm Hg） 時呈指數增長[9]，并促進靶基因的轉錄活性，維持組織細胞在低氧環境中的生存和功能。
1.2 HIF的降解通路
Huang等[10]首先在HIF-1α中發現了氧依賴降解結構域（oxygen-dependent degradation domain，ODD）。Epstein等[11]通過對秀麗隱桿線蟲基因研究，發現了由egl-9基因編碼的脯氨酰羥化酶（prolyl hydroxylase，PHD），該基因編碼的PHD可與HIF-1α蛋白中的ODD結合，降解HIF-1α，但當egl-9基因突變后，HIF-1α蛋白將呈持續表達狀態。并且，該研究者在哺乳動物中發現PHD的3個等位基因，由其分別編碼3種PHD（PHD-1～3）。
PHD屬于2-酮戊二酸/鐵依賴性雙加氧酶超家族，其需要氧和鐵作為反應底物。在正常氧濃度下，PHD激活，將HIF-α ODD區域402和564位脯氨酸殘基（Pro-402、Pro-564）羥化，羥化的脯氨酸殘基被VHL腫瘤抑制蛋白的β區識別，繼而通過泛素-蛋白酶體途徑降解，其半衰期＜5 min[12]。當缺氧時，PHD活性受到抑制，HIF-α降解受阻，其與HIF-β結合形成HIF異二聚體，促進下游靶基因的活性。其中，Fe2+和2-酮戊二酸是PHD激活的關鍵因子，而氧則是其限速因子[13-14]。
除了上述ODD區域脯氨酸羥化降解途徑外，HIF-α還受天門冬氨酸羥化調節其轉錄活性功能。α亞基中存在反式轉錄激活域（trans-activation domains，TAD），包括N-TAD和C-TAD。其中，N-TAD因與ODD部分重疊而主要通過脯氨酸羥化途徑降解；而C-TAD與ODD有一定距離，但其同樣受氧依賴性羥化反應調節。正常氧濃度時，天門冬氨酸羥化酶激活，該酶又被稱為HIF抑制因子（factor inhibiting HIF，FIH-1）。C-TAD上的天門冬氨酸（HIF-1α：Asn-803；HIF-2α：Asn-851）被FIH-1羥化，使其無法結合共激活因子p300/CBP，致使HIF的功能受到抑制，無法對靶基因進行誘導。而缺氧時，FIH-1功能受抑制，HIF-α可與HIF-β、p300/CBP結合，對靶基因進行調控[15]。
1.3 HIF的生理功能
絕大多數哺乳動物的胚胎在發育時氧濃度維持在1%～5%的低氧狀態，而氧作為胚胎多系統發育的成形素，具有重要作用。在這種低氧環境中，氧發揮作用依賴于HIF的功能[16]。例如HIF-1α和HIF-2α對胚胎循環系統的發育成熟具有不可替代的作用，缺乏該蛋白將導致胚胎死亡[17-18]。除了對胚胎循環系統發育影響外，在特定細胞中敲除HIF-1α的研究發現，其對成軟骨作用、成骨作用、脂肪形成、B淋巴細胞發育、T淋巴細胞分化、造血系統形成、免疫系統形成等方面均有重要作用[19-25]。然后，胚胎組織缺氧導致的HIF過度表達同樣會影響胎盤血流紊亂，進而胚胎發育異常而出現先天性發育畸形[26]。所以，胚胎發育過程中，HIF的穩定表達能調節各器官系統的發育，HIF缺失和過度表達均會引起不同程度損害。
另一方面，HIF-1α和HIF-2α對細胞耐受缺氧也具有重要作用，當HIF-1α等位基因中的1條突變后，細胞對于慢性缺氧的生理耐受性明顯缺乏，表現在無法代償性合成紅細胞、肺動脈高壓、右心室高壓、肺臟血管重構和電生理反應減弱等[27-28]。例如，將缺乏HIF-1α等位基因的鼠頸動脈體進行體外研究，發現其喪失對缺氧的神經生理反應，繼而發現部分缺失HIF-1α等位基因的鼠在急性缺氧環境中的反應是正常的，但對于慢性缺氧環境的適應性是明顯減弱[29]。
體內部分組織器官雖然其血供良好，但組織細胞生存環境仍處于低氧狀態，如軟骨等，HIF介導的通路在這些組織細胞的生長及分化中同樣具有調節作用。例如，對部分敲除HIF-1α基因鼠研究發現，其骨骺發育異常導致骨骼系統畸形，甚至影響氣管軟骨發育[19]；在胎盤形成階段，缺氧主導胎盤滋養層細胞增殖，避免分化成具有侵襲性的表型[30]；由HIF-1調控的靶基因產物TGF-β3的表達減少，而TGF-β3的表達與皮膚傷口愈合后瘢痕吸收有關[31]。
綜上，HIF在組織器官內的作用主要還是以維持細胞在缺氧狀態下的生存、增殖、分化、適應生存環境為主。
2 HIF在椎間盤中的作用
2.1 HIF調節椎間盤退變的理論基礎
目前已知椎間盤是人體中最大的無血管組織，其中的髓核組織距離最近的血管4～8 mm[32]，其能量供應和物質交換主要通過軟骨終板和內層纖維環的擴散作用到達髓核組織。所以，髓核組織的物質交換能力有限，而氧濃度也明顯低于周圍組織。當椎間盤退變發生時，軟骨終板鈣化、纖維環增厚等將導致髓核組織物質交換能力和氧濃度進一步惡化。
細胞對于缺氧環境的反應有一系列較為嚴格的病理生理機制，這種機制從低等級的蠕蟲、蒼蠅到高等級的哺乳動物都是相對保守的，而其中HIF對細胞缺氧狀態的調節有著關鍵作用[33]。Loinard等[34]采用結扎鼠下肢股動脈建立下肢缺血模型，通過提高HIF-1α蛋白表達，結果發現14 d后下肢側枝循環建立，足的血供明顯增加。在對冠心病患者的研究中發現，HIF-1α與側枝旁路形成有關，且其表達有助于形成穩定性心絞痛，避免心肌梗死[35-36]。因此，HIF在一系列缺血、缺氧性疾病，如心肌梗死、周圍血管閉塞、傷口愈合、糖尿病血管并發癥、創傷性休克、腫瘤等方面，發揮著重要作用，其可誘導新生血管生長、穩定能量供應、增加組織細胞對缺血缺氧的耐受性[37-38]。
椎間盤髓核細胞同樣處于物質交換能力差、氧濃度低的環境中，相關研究已證實HIF存在于髓核組織內，并對髓核細胞適應這種環境有調節作用。Merceron等[39]研究HIF-1α對老鼠胚胎發育的影響，不但證明了椎間盤內存在HIF-1α表達，更證明了其對胚胎椎間盤發育，尤其是髓核組織形成的重要作用；Agrawal等[40]培養人和老鼠髓核細胞驗證了HIF-1α的表達；同樣，Ha等[41]也證實了在人髓核細胞內存在HIF。繼而HIF對椎間盤的調控機制得到了深入研究。現已發現，HIF-1α通路的激活對髓核細胞的存活、生長、代謝調節和基質合成均發揮一定作用[40, 42]。
2.2 HIF在椎間盤內分布情況
完整的椎間盤結構包括外層的纖維環組織、中間的髓核組織及上下軟骨終板組織。因毛細血管散在分布于纖維環、上下軟骨終板外圍，氧濃度從外到內呈逐漸下降趨勢，即存在氧濃度梯度[43]；而缺氧可誘導HIF表達。所以，研究者們設想在椎間盤組織內，HIF的表達是否存在梯度變化？Risbud等[44]對人、鼠、羊髓核細胞進行培養，發現均可表達HIF-1α，且表達量顯著高于纖維環細胞、軟骨細胞和成骨細胞。Richardson等[45]將人正常和退變椎間盤研究發現，HIF-1α只表達于髓核細胞。Rajpurohit等[43]通過培養鼠髓核細胞、纖維環細胞和軟骨細胞，發現髓核細胞內HIF-1α表達高于纖維環細胞和軟骨細胞。因此，椎間盤組織中不但存在HIF的表達，而且表達程度也同樣存在梯度變化，即髓核組織中HIF的表達最高。
髓核組織是椎間盤主要結構和行使功能的部位，髓核組織的完整性維系著椎間盤結構和功能的完整。HIF在髓核組織中的相對高表達，也反映著其對髓核組織調控的相對重要作用。
2.3 HIF調節髓核組織的發育和分化
Merceron等[39]通過鼠雜交獲得脊索細胞中缺失HIF-1α基因型的鼠胚胎，對其研究發現，缺失HIF-1α基因鼠在胚胎期，髓核細胞呈無特征性的空泡結構，髓核組織小于對照組；出生時，髓核細胞因糖代謝異常大量死亡；出生1個月后，髓核細胞被不來源于脊索組織的纖維軟骨組織替代，這種變化為椎間盤退變的常見現象；出生2個月后，椎間隙高度降低，髓核組織體積進一步變小；出生4個月后，脊柱節段活動度下降40%，椎間盤吸收和傳導負荷的功能明顯下降。但各時間段纖維環和軟骨終板均未見明顯異常。作者認為這是因HIF-1α的缺失，導致叉頭框A2基因活性下降、甚至抑制，引起細胞缺氧；另外，HIF-1α的缺失將導致髓核細胞無氧糖酵解過程受抑制，導致三磷酸腺苷（adenosine-triphosphate，ATP）供應不足。由此使髓核細胞發育、分化受影響，最終導致髓核細胞死亡。
因此，HIF-1α對髓核組織發育過程中的調控，如細胞分化及生存起中軸作用，HIF-1α缺失首先影響髓核細胞形態，然后導致死亡，最終引起髓核組織的消失。
2.4 HIF調節髓核細胞的生存
髓核組織內營養物質的吸收和代謝廢物的排出主要通過細胞外基質形成的滲透壓和流體靜水壓維持，細胞外基質的合成、分解受髓核細胞數量、功能的調控，因此，髓核細胞是維持髓核組織內環境穩定，繼而影響椎間盤功能的關鍵因子[46]。雖然髓核細胞生存在低氧環境中，但目前研究發現髓核細胞在低氧濃度環境中仍能保持細胞活性和功能[47-48]。所以，髓核細胞應該存在一些適應低氧環境的機制以維持其存活。
Fas和FasL系統是常見的介導細胞凋亡的通路，而在人突出椎間盤髓核細胞中發現了Fas和FasL的共表達[49]。Zeng等[50]在小鼠髓核細胞中發現，HIF-1α通過與半乳糖凝集素-3（galectin-3，gal-3）基因HRE結合，促進gal-3表達，而gal-3屬于β半乳糖苷結合動物凝集素家族，其可抑制Fas/FasL介導的髓核細胞凋亡和促進黏附。另外，髓核細胞表達的FasL可與入侵髓核組織的活化T細胞表面的Fas結合，促使T細胞凋亡，并抑制過多的病理性新生血管侵入，維持髓核組織處于免疫豁免狀態，保持細胞存活能力[51]。
此外，HIF-1α和HIF-2α調節p300結合蛋白cited2的表達，cited2蛋白含量的變化影響VEGF的表達，繼而通過VEGF/VEGFR級聯反應抑制髓核細胞凋亡[42, 46]。Risbud等[52-53]研究表明，HIF-1α表達可調節Akt及細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）的含量，而Akt和ERK能夠抑制半胱天冬酶及一氧化氮合成酶活性，進而抑制細胞凋亡的發生。因此，由HIF-1α和HIF-2α介導的級聯反應，在髓核細胞應對惡劣生存環境下維持生存發揮著必要的調節作用。
除了細胞凋亡外，細胞在缺氧、營養缺乏、感染等因素作用下，將會誘發自噬，以適應環境、促進細胞更新和生存[54-56]。而由HIF-1α調控的缺氧誘導機制是自噬的其中一條通路。HIF-1α通過上調靶基因B細胞淋巴瘤/白血病-2蛋白/腺病毒E1B 19kDa結合蛋白3[B cell lymphoma/lewkmia-2 （BCL2）/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3，BNIP3]、類BNIP3（BNIP3-like，BNIP3L）表達，抑制BCL2和芐氯素1蛋白相互反應，以增加自噬關鍵蛋白芐氯素1的表達，促進自噬。這一機制目前在對膠質母細胞瘤細胞、肺癌細胞、軟骨細胞等的研究中發現[57-59]。但是，HIF是否調控髓核細胞自噬，目前仍存在爭議。Choi等[60]最近研究發現，髓核細胞調節自噬是通過缺氧誘導、非HIF-1α依賴的非經典自噬途徑。但Wang等[61]認為，HIF通路是維持髓核細胞在缺氧環境中生存的機制之一。其他相關研究目前仍欠缺，故HIF調節髓核細胞自噬，以達到細胞自我保護和生存的機制需進一步研究。
2.5 HIF調節髓核細胞的能量代謝
研究發現，若抑制髓核細胞內無氧糖酵解過程，ATP在30 min內將下降約80%，并且在6 h后仍保持極低含量；但若抑制線粒體功能，在30 min和6 h后，對ATP含量無明顯影響[40]。說明髓核細胞在低氧濃度環境中，其能量代謝主要通過無氧糖酵解產 生。
在此過程中，HIF-1是多數糖酵解相關基因的關鍵轉錄誘導因子[62]。例如，葡萄糖轉運蛋白（glucose transporter，GLUT）是能量代謝中葡萄糖底物梯度轉運的主要跨膜蛋白，在人髓核細胞中，HIF-1α和GLUT-1、GLUT-3、GLUT-9共表達，并且HIF-1α的升高伴隨著后三者的升高，而這種表達變化一致現象不存在于纖維環細胞中[45]。另有研究指出，除了GLUT-1、GLUT-3是HIF-1α的靶基因外，GAPDH和6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-二磷酸酶（6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2，6-biphosphatase，PFKFB）同樣受HIF-1α調控，而GAPDH和PFKFB是糖酵解過程的關鍵酶[40]。
除了促進無氧糖酵解過程，HIF同時可抑制髓核細胞內線粒體氧化磷酸化過程。Papandreou等[62]發現HIF-1α能夠轉錄激活丙酮酸脫氫酶激酶-1，進而抑制丙酮酸脫氫酶，導致丙酮酸無法轉化為乙酰輔酶A，從而阻斷細胞中的三羧酸循環代謝。在缺氧狀態下這種能量代謝的轉變，主要是避免在缺氧狀態下，因線粒體氧化磷酸化過程中電子轉移能力下降，而產生氧自由基等損害細胞DNA的物質，即避免活性氧簇產生[63]。但髓核細胞內的線粒體功能并非完全被抑制，當葡萄糖轉運過度時，線粒體可通過脂肪酸代謝將過多的葡萄糖降解[40]。
2.6 HIF調節髓核組織內環境穩定
髓核組織維持功能依靠髓核細胞數量、功能和細胞外基質的穩定，其中，細胞外基質合成代謝和分解代謝平衡是細胞外基質含量保持恒定的先決條件。髓核組織細胞外基質主要由蛋白多糖和Ⅱ型膠原構成。Agrawal等[40]研究表明，當抑制HIF-1α后，聚集蛋白聚糖（Aggrecan）mRNA表達明顯下降，并且在蛋白水平也可見Aggrecan的下降，而HIF-1α表達能直接誘導Aggrecan mRNA表達和蛋白合成，或者通過硫酸鹽反應間接刺激Aggrecan的合成。Robins等[64]發現，HIF-1α調控Sox9基因表達，Sox9基因對Aggrecan和Ⅱ型膠原合成有重要作用。Tran等[65]近年研究發現，髓核組織中HIF-1α調控結締組織生長因子2（connective tissue growth factor 2，CCN2），進而促進Aggrecan的表達，而CCN2對HIF-1α具有負反饋調節作用，避免Aggrecan的過度表達，維持細胞外基質的穩定。
除了Aggrecan，蛋白多糖另一個主要成分糖胺多糖的合成也受HIF的調節。糖胺多糖是維持髓核組織處于凝膠狀態的大分子物質。葡萄糖是合成糖胺多糖的主要原料，GLUT通過將葡萄糖跨膜轉入髓核細胞促進糖胺多糖的合成。部分GLUT又是HIF-1的靶基因，所以，HIF-1通過GLUT促進糖胺多糖的合成[66]。
Fujita等[67]對引起椎間盤退變的多配體蛋白聚糖4（Syndecan 4，SDC4）的研究發現，HIF-1α可抑制SDC4 mRNA和蛋白的表達，進而上調整合素、血小板樣金屬蛋白酶5和Sox9，促進Aggrecan合成。另外，對維持髓核組織靜水壓起重要作用的水通道蛋白（aquaporin，AQP）的研究同樣證實，HIF-1α直接調控AQP1和AQP5，維持髓核組織靜水壓。而當椎間盤退變時，伴隨著HIF-1α的減少，AQP1和AQP5同樣減少，導致椎間盤靜水壓下降[68]。
3 展望
目前研究已發現HIF在椎間盤中可通過誘導下游靶基因轉錄，維持細胞生存和功能發揮、調節細胞能量代謝、維持組織內環境穩定，以應對椎間盤中缺血缺氧環境。因此，通過對椎間盤中HIF這一上游基因的研究，可能將進一步揭示椎間盤退變的機制。同時，通過對HIF基因靶點的調控，或許將為椎間盤退變性疾病基因治療和細胞移植治療中細胞移植物的改造提供新的思路和理論依據。