引用本文： 王琳, 周立冬, 吳美, 劉理金, 向勇平, 劉謀元, 劉愛兵. 硫酸軟骨素促進成肌細胞增殖作用的研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(10): 1290-1294. doi: 10.7507/1002-1892.20160262 復制
成肌細胞是肌肉組織的前體細胞，來源于衛星細胞，只能單向發展為肌肉[1]，具有自我更新和促進肌纖維再生的能力，在彼此天然融合和核傳遞時產生收縮蛋白，成功應用于細胞治療和基因組治療[2-3]。人成肌細胞移植治療技術是通過注射所培養的一定數量成肌細胞，使正常人類基因組傳遞至患者有缺陷基因組的細胞內，從而修補患者細胞遺傳缺陷的臨床技術[4]，目前已成功用于肌萎縮、心臟病、2型糖尿病、實體癌的治療[5-8]。成肌細胞是已分化的最原始的肌性細胞，在體外傳代培養過程中，融合形成肌管后再形成肌節，肌細胞分化將不可逆性退出細胞周期[9-11]。
硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）是一類廣泛存在于人與動物結締（軟骨）組織中的糖胺聚糖[12]，具有多種重要生物活性。首先，CS具有抗氧化活性，能夠清除超氧陰離子自由基、羥自由基、二苯基苦基苯肼自由基；其次，其更多的生理活性也已被證實，如抑制神經細胞生長、調節免疫、促骨組織生成、促進3T3-L1細胞增殖并抑制其成脂的作用[13]；再者，CS除了構成細胞外基質具有支持細胞的作用外，臨床上常將其應用于軟骨損傷、神經性頭痛、神經痛、關節痛、老年退行性關節炎、風濕性關節炎等疾病的輔助治療，在防治冠心病、動脈粥樣硬化、抗炎、抗腫瘤等領域亦有一定改善作用[14-16]。
臨床報道證明成肌細胞治療療效取決于注射細胞的數量，當成肌細胞數＞1×108個時治療效果明顯[17-20]。因此，大量擴增成肌細胞數量和抑制成肌細胞分化，是其應用于臨床急需解決的問題。相關研究表明[13]，CS可能有促進成肌細胞增殖、抑制其分化的作用。本研究通過在成肌細胞培養基中添加CS，觀察其對成肌細胞增殖以及肌管形成的影響。
1 材料與方法
1.1 主要試劑、儀器
DMEM/F12 1∶1培養基（HyClone公司，美國）；UltraCULTURETM培養基（Lonza公司，瑞士）；CS（Sigma公司，美國 ）；HE染色試劑盒（Thermo公司，美國）；MTT 試劑盒（Sigma公司，美國）；肌間線蛋白（Desmin）單克隆抗體、DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；FBS（HyClone公司，美國）。CO2培養箱（Thermo公司，美國）；倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）；酶標儀（Beckman公司，美國）；細胞計數儀（Mllipore公司，德國）。
1.2 人成肌細胞的分離、培養、鑒定
采集成年志愿者股直肌手術后2 h內的肌肉組織2 g，放入平皿中剪碎為1 mm3的小塊，用含1%雙抗的PBS溶液沖洗3次；轉移至50 mL離心管，加入2 mg/mLⅡ型膠原酶15 mL，用吸管吹打混勻，放入37℃水浴鍋2 h；再加入0.25%胰蛋白酶5 mL，用吸管吹打混勻，放入37℃水浴鍋30 min。消化完后用200目不銹鋼篩過濾，濾液以半徑12 cm、2 000 r/ min離心5 min；棄上清，PBS清洗沉淀3次，同上法離心5 min。加入4 mL含1 mg/L IGF-1、10 mg/L bFGF、20%FBS的DMEM/F12 1∶1培養液，接種至T25培養瓶，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養，分別于2、8、12、24、48、72 h時將細胞懸液依次更換至新的培養瓶；最后一次更換培養瓶后，將細胞繼續培養3 d，使其充分貼壁；然后更換新鮮培養液，長滿90%時可消化傳代；用0.25%胰蛋白酶1.5 mL消化4 min后，加入含10%FBS的培養液2.5 mL終止消化；收集細胞，PBS溶液洗除殘余胰蛋白酶，以1∶2比例傳代，凍存。選擇第5代成肌細胞復蘇備用，按本實驗室既往實驗方法[1]鑒定為成肌細胞。
1.3 實驗分組及觀測指標
1.3.1 實驗分組
取第5代成肌細胞制成濃度為1×108 個/L的細胞懸液，依據在成肌細胞培養基中添加不同濃度CS，將實驗分為A組（0 μg/mL）、B組（50 μg/mL）、C組（100 μg/mL）和D組（200 μg/mL）。
1.3.2 形態學觀察
取成肌細胞以1×108個/L濃度接種于6孔板，每組3孔，每孔2 mL，按分組干預后于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養，倒置顯微鏡觀察干預后4、5、8 d各組成肌細胞增殖和分化情 況。
1.3.3 細胞增殖情況檢測
取成肌細胞以1×108 個 / L濃度接種于12孔板，每組3孔，每孔1.5 mL，按分組干預后于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養。按參考文獻[1]方法，在培養6 d時細胞增殖進入穩定期，加入MTT溶液160 μL避光孵育，4 h后終止培養，去除上清，每孔滴加1.6 mL DMSO，振蕩混勻10 min，使結晶充分溶解，使用酶標儀測定490 nm波長處活細胞吸光度（A） 值。實驗重復3次，取均值。
1.3.4 HE染色及肌管形成檢測
取成肌細胞以1×108個/L濃度接種于12孔板，每組3孔，每孔1.5 mL，按分組干預后于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養。培養8 d棄上清，常規HE染色后倒置顯微鏡下觀察；于20倍鏡下計數10個視野所形成的肌管數。實驗重復3次，取均值。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 形態學觀察
倒置顯微鏡觀察示，細胞貼壁后呈單核梭形，細胞核呈卵圓形，細胞質致密；貼壁90%時整體肌母細胞呈漩渦狀走行，長梭狀生長。4 d，A、B、C、D組細胞分別貼壁約50%、60%、70%、80%（圖 1 a～d）；5 d，A、B、C、D組細胞分別貼壁約60%、70%、80%、90%（圖 1 e～h）。繼續培養成肌細胞細胞核出現融合現象，形成多核肌管，呈長條狀，體積是單個成肌細胞的2～5倍，肌管內細胞核數在2個以上，肌管之間相互連接形成網狀。8 d，A組細胞多數已融合形成肌管，B、C組細胞有部分未融合，D組細胞融合形成肌管數最少（圖 1 i～l）。
圖1
CS干預各時間點各組細胞形態學觀察（倒置顯微鏡×10） ? A組4 d ? B組4 d ? C組4 d ? D組4 d ? A組5 d ? B組5 d ? C組5 d ? D組5 d ? A組8 d ? B組8 d ? C組8 d ? D組8 d ? ?2.2 細胞增殖情況檢測
MTT檢測示，A、B、C、D組A值分別為0.045 2± 0.004 4、0.540 4±0.096 7、0.660 9±0.143 4、1.069 0± 0.039 0，A組顯著小于B、C、D組，B、C組小于D組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；B、C組間差異無統計學意義（P＞0.05）。
2.3 HE染色及肌管形成檢測
HE染色示，A組細胞大多數已融合形成肌管；B、C組有少數細胞未融合形成肌管；D組細胞融合形成肌管數相對最少，未融合細胞數稍多。見圖 2。A、B、C、D組肌管形成數分別為（222.01±30.02）、（193.13±42.46）、（170.26±11.96）、（136.88±16.78），各組間比較差異無統計學意義（F=1.658，P=0.252）。
3 討論
成肌細胞是已分化的最原始的肌性細胞，是肌肉組織的前體細胞，雖然目前已成功應用于臨床，但成肌細胞治療療效取決于注射細胞的數量，促進成肌細胞增殖、抑制其融合形成肌管是成肌細胞培養的重要研究部分。CS具有多種生物學活性，研究報道[13]CS具有促進3T3-L1細胞增殖并抑制其成脂的作用。本實驗將不同濃度CS添加至成肌細胞培養基中，探討其對成肌細胞的增殖作用和對其融合形成肌管的抑制作用。
本研究中形態學觀察結果顯示，成肌細胞培養4 d時，0、50、100、200 μg/mL CS干預組分別貼壁約50%、60%、70%、80%，5 d時各干預組細胞約同比增長10%，且200 μg/mL CS干預組在第5天貼壁90%時無明顯細胞融合現象，是消化傳代的最優狀態，所以200 μg/mL是成肌細胞培養基添加CS的最適劑量。MTT法檢測各組細胞A值以分析細胞活性，結果顯示50 μg/mL和100 μg/mL CS干預組間比較差異無統計學意義，其余各組兩兩比較均存在顯著差異，200 μg/mL CS干預組在促進成肌細胞增殖上顯著優于其他各組。
肌管形成是成肌細胞發展為肌纖維的標志性形態，在成肌細胞培養中抑制肌管形成可增加成肌細胞的增殖活性，成肌細胞的大量擴增需要抑制肌管形成。前期研究[1]顯示成肌細胞在第6天時增殖達到平臺期，隨后肌管形成逐天增多，8 d時肌管形態最為明顯。本實驗在CS干預8 d時可見部分成肌細胞融合形成肌管，倒置顯微鏡可見各干預組肌管形成數差異不顯著。進一步行HE染色并計數10個視野所形成的肌管數，結果顯示隨CS濃度的增加，細胞形成肌管數呈下降趨勢。HE染色示，0 μg/mL CS干預組細胞大多數已融合形成肌管；50、100 μg/mL CS干預組有少部分細胞未融合形成肌管；200 μg/ mL CS干預組細胞融合形成肌管數相對最少，未融合細胞數稍多。但各干預組對肌管形成的影響差異無統計學意義，說明不同濃度CS干預成肌細胞生長均未能抑制其融合形成肌管。
綜上述，CS可促進成肌細胞增殖且最佳濃度為200 μg/mL。本研究為成肌細胞高劑量臨床應用提供了研究基礎，但成肌細胞的大規模擴增還有待進一步研究。
成肌細胞是肌肉組織的前體細胞，來源于衛星細胞，只能單向發展為肌肉[1]，具有自我更新和促進肌纖維再生的能力，在彼此天然融合和核傳遞時產生收縮蛋白，成功應用于細胞治療和基因組治療[2-3]。人成肌細胞移植治療技術是通過注射所培養的一定數量成肌細胞，使正常人類基因組傳遞至患者有缺陷基因組的細胞內，從而修補患者細胞遺傳缺陷的臨床技術[4]，目前已成功用于肌萎縮、心臟病、2型糖尿病、實體癌的治療[5-8]。成肌細胞是已分化的最原始的肌性細胞，在體外傳代培養過程中，融合形成肌管后再形成肌節，肌細胞分化將不可逆性退出細胞周期[9-11]。
硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）是一類廣泛存在于人與動物結締（軟骨）組織中的糖胺聚糖[12]，具有多種重要生物活性。首先，CS具有抗氧化活性，能夠清除超氧陰離子自由基、羥自由基、二苯基苦基苯肼自由基；其次，其更多的生理活性也已被證實，如抑制神經細胞生長、調節免疫、促骨組織生成、促進3T3-L1細胞增殖并抑制其成脂的作用[13]；再者，CS除了構成細胞外基質具有支持細胞的作用外，臨床上常將其應用于軟骨損傷、神經性頭痛、神經痛、關節痛、老年退行性關節炎、風濕性關節炎等疾病的輔助治療，在防治冠心病、動脈粥樣硬化、抗炎、抗腫瘤等領域亦有一定改善作用[14-16]。
臨床報道證明成肌細胞治療療效取決于注射細胞的數量，當成肌細胞數＞1×108個時治療效果明顯[17-20]。因此，大量擴增成肌細胞數量和抑制成肌細胞分化，是其應用于臨床急需解決的問題。相關研究表明[13]，CS可能有促進成肌細胞增殖、抑制其分化的作用。本研究通過在成肌細胞培養基中添加CS，觀察其對成肌細胞增殖以及肌管形成的影響。
1 材料與方法
1.1 主要試劑、儀器
DMEM/F12 1∶1培養基（HyClone公司，美國）；UltraCULTURETM培養基（Lonza公司，瑞士）；CS（Sigma公司，美國 ）；HE染色試劑盒（Thermo公司，美國）；MTT 試劑盒（Sigma公司，美國）；肌間線蛋白（Desmin）單克隆抗體、DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；FBS（HyClone公司，美國）。CO2培養箱（Thermo公司，美國）；倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）；酶標儀（Beckman公司，美國）；細胞計數儀（Mllipore公司，德國）。
1.2 人成肌細胞的分離、培養、鑒定
采集成年志愿者股直肌手術后2 h內的肌肉組織2 g，放入平皿中剪碎為1 mm3的小塊，用含1%雙抗的PBS溶液沖洗3次；轉移至50 mL離心管，加入2 mg/mLⅡ型膠原酶15 mL，用吸管吹打混勻，放入37℃水浴鍋2 h；再加入0.25%胰蛋白酶5 mL，用吸管吹打混勻，放入37℃水浴鍋30 min。消化完后用200目不銹鋼篩過濾，濾液以半徑12 cm、2 000 r/ min離心5 min；棄上清，PBS清洗沉淀3次，同上法離心5 min。加入4 mL含1 mg/L IGF-1、10 mg/L bFGF、20%FBS的DMEM/F12 1∶1培養液，接種至T25培養瓶，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養，分別于2、8、12、24、48、72 h時將細胞懸液依次更換至新的培養瓶；最后一次更換培養瓶后，將細胞繼續培養3 d，使其充分貼壁；然后更換新鮮培養液，長滿90%時可消化傳代；用0.25%胰蛋白酶1.5 mL消化4 min后，加入含10%FBS的培養液2.5 mL終止消化；收集細胞，PBS溶液洗除殘余胰蛋白酶，以1∶2比例傳代，凍存。選擇第5代成肌細胞復蘇備用，按本實驗室既往實驗方法[1]鑒定為成肌細胞。
1.3 實驗分組及觀測指標
1.3.1 實驗分組
取第5代成肌細胞制成濃度為1×108 個/L的細胞懸液，依據在成肌細胞培養基中添加不同濃度CS，將實驗分為A組（0 μg/mL）、B組（50 μg/mL）、C組（100 μg/mL）和D組（200 μg/mL）。
1.3.2 形態學觀察
取成肌細胞以1×108個/L濃度接種于6孔板，每組3孔，每孔2 mL，按分組干預后于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養，倒置顯微鏡觀察干預后4、5、8 d各組成肌細胞增殖和分化情 況。
1.3.3 細胞增殖情況檢測
取成肌細胞以1×108 個 / L濃度接種于12孔板，每組3孔，每孔1.5 mL，按分組干預后于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養。按參考文獻[1]方法，在培養6 d時細胞增殖進入穩定期，加入MTT溶液160 μL避光孵育，4 h后終止培養，去除上清，每孔滴加1.6 mL DMSO，振蕩混勻10 min，使結晶充分溶解，使用酶標儀測定490 nm波長處活細胞吸光度（A） 值。實驗重復3次，取均值。
1.3.4 HE染色及肌管形成檢測
取成肌細胞以1×108個/L濃度接種于12孔板，每組3孔，每孔1.5 mL，按分組干預后于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養。培養8 d棄上清，常規HE染色后倒置顯微鏡下觀察；于20倍鏡下計數10個視野所形成的肌管數。實驗重復3次，取均值。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 形態學觀察
倒置顯微鏡觀察示，細胞貼壁后呈單核梭形，細胞核呈卵圓形，細胞質致密；貼壁90%時整體肌母細胞呈漩渦狀走行，長梭狀生長。4 d，A、B、C、D組細胞分別貼壁約50%、60%、70%、80%（圖 1 a～d）；5 d，A、B、C、D組細胞分別貼壁約60%、70%、80%、90%（圖 1 e～h）。繼續培養成肌細胞細胞核出現融合現象，形成多核肌管，呈長條狀，體積是單個成肌細胞的2～5倍，肌管內細胞核數在2個以上，肌管之間相互連接形成網狀。8 d，A組細胞多數已融合形成肌管，B、C組細胞有部分未融合，D組細胞融合形成肌管數最少（圖 1 i～l）。
圖1
CS干預各時間點各組細胞形態學觀察（倒置顯微鏡×10） ? A組4 d ? B組4 d ? C組4 d ? D組4 d ? A組5 d ? B組5 d ? C組5 d ? D組5 d ? A組8 d ? B組8 d ? C組8 d ? D組8 d ? ?2.2 細胞增殖情況檢測
MTT檢測示，A、B、C、D組A值分別為0.045 2± 0.004 4、0.540 4±0.096 7、0.660 9±0.143 4、1.069 0± 0.039 0，A組顯著小于B、C、D組，B、C組小于D組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；B、C組間差異無統計學意義（P＞0.05）。
2.3 HE染色及肌管形成檢測
HE染色示，A組細胞大多數已融合形成肌管；B、C組有少數細胞未融合形成肌管；D組細胞融合形成肌管數相對最少，未融合細胞數稍多。見圖 2。A、B、C、D組肌管形成數分別為（222.01±30.02）、（193.13±42.46）、（170.26±11.96）、（136.88±16.78），各組間比較差異無統計學意義（F=1.658，P=0.252）。
3 討論
成肌細胞是已分化的最原始的肌性細胞，是肌肉組織的前體細胞，雖然目前已成功應用于臨床，但成肌細胞治療療效取決于注射細胞的數量，促進成肌細胞增殖、抑制其融合形成肌管是成肌細胞培養的重要研究部分。CS具有多種生物學活性，研究報道[13]CS具有促進3T3-L1細胞增殖并抑制其成脂的作用。本實驗將不同濃度CS添加至成肌細胞培養基中，探討其對成肌細胞的增殖作用和對其融合形成肌管的抑制作用。
本研究中形態學觀察結果顯示，成肌細胞培養4 d時，0、50、100、200 μg/mL CS干預組分別貼壁約50%、60%、70%、80%，5 d時各干預組細胞約同比增長10%，且200 μg/mL CS干預組在第5天貼壁90%時無明顯細胞融合現象，是消化傳代的最優狀態，所以200 μg/mL是成肌細胞培養基添加CS的最適劑量。MTT法檢測各組細胞A值以分析細胞活性，結果顯示50 μg/mL和100 μg/mL CS干預組間比較差異無統計學意義，其余各組兩兩比較均存在顯著差異，200 μg/mL CS干預組在促進成肌細胞增殖上顯著優于其他各組。
肌管形成是成肌細胞發展為肌纖維的標志性形態，在成肌細胞培養中抑制肌管形成可增加成肌細胞的增殖活性，成肌細胞的大量擴增需要抑制肌管形成。前期研究[1]顯示成肌細胞在第6天時增殖達到平臺期，隨后肌管形成逐天增多，8 d時肌管形態最為明顯。本實驗在CS干預8 d時可見部分成肌細胞融合形成肌管，倒置顯微鏡可見各干預組肌管形成數差異不顯著。進一步行HE染色并計數10個視野所形成的肌管數，結果顯示隨CS濃度的增加，細胞形成肌管數呈下降趨勢。HE染色示，0 μg/mL CS干預組細胞大多數已融合形成肌管；50、100 μg/mL CS干預組有少部分細胞未融合形成肌管；200 μg/ mL CS干預組細胞融合形成肌管數相對最少，未融合細胞數稍多。但各干預組對肌管形成的影響差異無統計學意義，說明不同濃度CS干預成肌細胞生長均未能抑制其融合形成肌管。
綜上述，CS可促進成肌細胞增殖且最佳濃度為200 μg/mL。本研究為成肌細胞高劑量臨床應用提供了研究基礎，但成肌細胞的大規模擴增還有待進一步研究。
