引用本文： 張迪, 譚秋雯, 湯沈力, 羅靜聰, 張憶, 呂青. 一種優化的豬骨骼肌來源無細胞基質支架材料制備方法及鑒定. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(10): 1282-1289. doi: 10.7507/1002-1892.20160261 復制
乳腺癌位居我國女性惡性腫瘤的首位，成為危害女性身心健康的主要疾病[1-2]。外科手術是治療乳腺癌的主要手段之一，但會導致乳腺軟組織缺失，嚴重影響患者生存質量，因此軟組織修復重建成為研究熱點[3]。目前軟組織修復方法主要包括自體組織移植與異體材料填充，但分別存在供區有限、供區功能影響、創傷大等不足[4]，以及異物反應、包膜攣縮、填充物破裂等不良反應[5]。采用組織工程方法制備異源性細胞外基質（extracellular matrix，ECM）支架材料誘導實現組織原位再生，為軟組織修復提供了新思路。豬骨骼肌由多層膜性結構包裹而成，血管網絡豐富，含有多種生物活性成分，且與人同源性高。本課題組前期初步探索了豬骨骼肌脫細胞方法，并對制備的豬骨骼肌脫細胞ECM支架材料力學特性進行了初步研究[6-7]，但其脫細胞處理過程耗時費力，且脫細胞效果受操作者人為影響較大。我們在前期研究基礎上進一步探索，提出了一種優化豬骨骼肌脫細胞方法（勻漿-球磨-去垢劑多步驟脫細胞方法）制備豬骨骼肌來源無細胞基質（decellularized porcine muscle tissue，DPMT）。本研究旨在探討該方法的可行性，以期為軟組織修復重建提供理想的組織工程支架材料制備方法。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
2月齡SPF級雄性健康SD大鼠20只，體質量250～300 g，由成都達碩生物科技有限公司提供，四川大學華西醫學實驗動物中心飼養。市售新鮮健康成年家豬腰部骨骼肌組織，均于處死1 h內收集標本。小鼠成纖維細胞系（NIH3T3）和人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）購自ATCC細胞庫（CRL-1658，CRL-1730）。
胰蛋白酶、PicoGreen? dsDNA定量試劑盒（Invitrogen公司，美國）；EDTA（Sanland公司，美國）；Triton X-100、脫氧膽酸鈉、金屬蛋白酶K、碘化丙啶（propidium iodide，PI）、鈣黃綠素（Sigma公司，美國）；BCA法蛋白定量試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公司）；Anti-CD31抗體（Abcam公司，英國）；DAB（北京中杉金橋生物技術有限公司）；DMEM培養基、FBS（GIBCO公司，美國）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；Dojindo公司，日本）。
組織搗碎勻漿機（江蘇金壇恒豐制造有限公司）；低溫球磨儀（Retsch公司，德國）；DW3真空凍干機（Christ公司，德國）；水平離心機（北京醫用離心機廠）；掃描電鏡（Hitachi公司，日本）；熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡（Nikon公司，日本）；熒光酶標儀（Leica公司，德國）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）。
1.2 DPMT制備
① 漂洗：取新鮮豬腰部骨骼肌，去離子水反復漂洗，剔除附著的肌腱及表面筋膜組織；② 勻漿：將骨骼肌切成大小約2 cm×1 cm ×1 cm的組織塊，再次浸泡漂洗數次，去除肌肉間血液，加入等體積PBS，置于組織搗碎勻漿機中，以12 000 r/min勻漿處理4 min；③ 胰蛋白酶消化：向混合液中加入3倍體積胰蛋白酶消化液（0.1% 胰蛋白酶+0.05%EDTA），置于37℃恒溫搖床中消化2 h；④ 離心漂洗：將混合液以離心半徑17.4 cm、3 500 r/min 離心5 min，棄上層溶液，加入大量PBS反復漂洗；⑤ 低溫球磨：將漂洗后的組織碎片置于液氮中快速冷凍5 min后，以25 Hz球磨打粉5 min；⑥ 去垢劑脫細胞：將粉狀材料置于10倍體積去垢劑混合溶液（1% Triton X-100+0.2%脫氧膽酸鈉），室溫下震蕩4 h，同上法離心5 min，棄上清后大量PBS漂洗；⑦ 脫脂：將材料置于10倍體積甲醇、乙醇混合有機溶液，甲醇∶乙醇（V/V）=1∶1，室溫下震蕩脫脂2 h，同上法離心5 min，棄上清液，大量PBS漂洗至無氣味；⑧ 低溫凍干：將粉狀材料放入不同模具中，凍干制成不同形狀DPMT。
1.3 觀測指標
1.3.1 組織學及掃描電鏡觀察
取DPMT與新鮮豬骨骼肌分別置于4%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，常規5 μm連續切片，行HE染色、DAPI染色；DPMT切片同時行天狼猩紅染色。DPMT與新鮮豬骨骼肌組織塊冰凍切片后行油紅O染色。將DPMT使用真空凍干機凍干，使用手術刀切取平整觀察切面，掃描電鏡觀察。
1.3.2 DPMT成分定量檢測
將新鮮豬骨骼肌和DPMT凍干后，液氮快速冷凍5 min，以25 Hz球磨5 min；各取一定體積粉狀材料，參照PicoGreen? dsDNA定量試劑盒說明書測定DNA含量。另取新鮮豬骨骼肌和DPMT，參照BCA法蛋白定量試劑盒說明書檢測材料中總蛋白質含量。
1.3.3 DPMT體外細胞相容性評價
① 脂肪來源干細胞（adipose derived stem cells，ADSCs）分離培養：取于四川大學華西醫院接受乳腺癌手術患者自愿捐贈的正常脂肪組織，參照本課題組前期實驗方法分離培養ADSCs并鑒定[7]。選擇第3代ADSCs進行后續實驗。
② DPMT體外細胞毒性評級：參照《中華人民共和國國家標準：醫療器械生物學評價GB/T 16886》規定[8]，制備DPMT浸提液。將DPMT材料修剪成長1 cm、寬1 cm、厚0.1～0.2 cm大小膜片狀，環氧乙烷消毒，添加一定體積含5%FBS的DMEM培養基浸泡材料，37℃孵箱內孵育24 h，制備濃度梯度為25%、50%、75%、100%的浸提液，4℃冰箱保存。
將ADSCs、NIH3T3和HUVECs以4×103個/孔接種于96孔細胞培養板，根據不同細胞種類選擇相應完全培養基，另每孔分別加入100 μL不同濃度梯度DPMT浸提液（濃度梯度設置為0、25%、50%、75%、100%），每2天換液1次。于培養后第1、3、5天采用CCK-8試劑盒檢測吸光度（A）值，定義0濃度組為陰性對照組，其余濃度組為實驗組，計算其相對增殖率（relative growth rate，RGR），RGR=實驗組A值/陰性對照組A值；按照以下標準對材料毒性進行分級：0級，RGR≥100%；1級，80%≤RGR＜100%；2級，50%≤RGR＜80%；3級，30%≤RGR＜50%；4級，RGR＜30%。其中0～1級為材料無細胞毒性；2級為輕度細胞毒性，需結合細胞形態綜合評價；3～4級為中度細胞毒性；5級為明顯細胞毒性。
③ 活死細胞染色：將DPMT冰凍切片制成大小為1.00 cm×1.00 cm×0.01 cm的薄膜，凍干后環氧乙烷消毒。將消毒后的DPMT置于6孔細胞培養板（1片/孔），每孔加入無血清DMEM培養基500 μL浸泡過夜，吸棄培養基；在DPMT表面添加濃度為1×107 個 / mL的HUVECs細胞懸液，每孔5 μL；置于37℃、5%CO2細胞培養箱中孵育30 min；同上法再次接種細胞，兩次共接種HUVECs 1×105個。每孔添加含5%FBS的DMEM培養基5 μL，于37℃、5%CO2細胞培養箱中孵育30 min；同上法重復添加培養基2 次，待HUVECs于DPMT表面貼壁生長后，每孔加入500 μL含5%FBS的DMEM培養基，于37℃、5%CO2細胞培養箱中孵育；每2天換液1次，于培養后3 d行熒光活死細胞染色（鈣黃綠素/PI法），激光共聚焦顯微鏡下觀察。
1.3.4 DPMT體內生物相容性評價
采用SD大鼠背部皮下植入模型評價DPMT的生物相容性。取20只SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛（1 mL/300 g）麻醉后，取俯臥位，于背部近后肢處作2～3 cm切口，分離皮下筋膜腔，將大小為1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm的DPMT浸泡于無菌PBS中水化后，植入皮下筋膜腔內，縫合筋膜及皮膚。術后觀察大鼠成活情況以及材料植入部位有無感染等發生；于3、7、14、28 d各取5只大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉后斷頸處死，將移植物及周圍皮膚一并切取，直尺測量剩余材料橫徑。然后行組織切片，HE染色及CD31免疫組織化學染色，觀察DPMT中炎性細胞浸潤及血管環結構新生情況。400倍鏡下每張切片取6個視野，于HE染色切片上人工計數炎性細胞（包括中性粒細胞及淋巴細胞）和成纖維細胞；于CD31染色切片上人工計數血管環結構。
1.4 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 DPMT制備觀察
勻漿-球磨-去垢劑多步驟脫細胞方法操作簡便，制備DPMT僅需1 d時間。混合等體積PBS勻漿處理后，肌肉組織碎片處于液相均質懸濁狀態，靜置無分層現象；經胰蛋白酶-EDTA震蕩消化處理后，肌纖維及肌筋膜混合片段呈淡黃色絮狀；低溫球磨后，組織呈粉末狀；在脫細胞、脫脂過程中，肌肉組織自發相互纏繞成為細絮狀，最終形成呈乳白色半透明狀態的DPMT；凍干處理后，DPMT呈乳白色膜片狀整體結構，可根據需求修剪成為不同形狀，再次充分水化后DPMT仍能保持結構完整性。見圖 1。
圖1
DPMT制備過程大體觀察 ? 將新鮮豬骨骼肌組織切成大小為2 cm×1 cm×1 cm的組織塊 ? 組織勻漿后 ? 經胰蛋白酶-EDTA振蕩消化后的組織碎片 ? 低溫球磨后組織呈粉末狀 ? 脫細胞、脫脂處理后獲得DPMT ? 低溫凍干后的DPMT ? 修剪成1 cm×1 cm大小的DPMT ? DPMT水化后能保持結構完整性 ? ?2.2 組織學及掃描電鏡觀察
HE染色示，新鮮豬骨骼肌中肌纖維呈束狀規則排列，細胞核位于肌纖維邊緣；DPMT呈松散均質狀，其內未見藍染細胞核。DAPI染色示，新鮮豬骨骼肌見藍色熒光的細胞核呈條束狀排列；DPMT中未見藍色熒光的細胞核或雙鏈DNA片段結構。油紅O染色示，新鮮豬骨骼肌組織中可見脂滴成分，DPMT中無脂滴殘留。天狼猩紅染色示，DPMT主要成分為Ⅰ型膠原，其間散在分布Ⅳ型膠原。見圖 2。掃描電鏡觀察示DPMT呈均質疏松網狀，纖維結構間未見細胞殘留（圖 3）。
2.3 DPMT成分定量檢測
新鮮豬骨骼肌組織中DNA含量為（140.724±10.422） ng/mg干重，DPMT中為（15.902±1.392） ng/ mg干重，組間比較差異有統計學意義（t=18.374，P=0.003）。
新鮮豬骨骼肌總蛋白質含量為（0.465 7± 0.005 4）mg/mL，DPMT為（0.3447±0.0041） mg/ mL，組間比較差異有統計學意義（t= -44.070，P=0.000）。樣本制備時設置各材料初始濃度為0.5 mg/mL，故新鮮豬骨骼肌中總蛋白質含量占其干重的93.14%，DPMT中總蛋白質含量占其干重的68.94%。
2.4 DPMT體外細胞相容性評價
2.4.1 DPMT細胞毒性評級
DPMT各濃度浸提液培養ADSCs、NIH3T3和HUVECs后，根據細胞毒性評級標準各時間點均為0～1級，提示DPMT無細胞毒性。各時間點隨DPMT浸提液濃度增加，HUVECs細胞生長數量呈上升趨勢，提示DPMT浸提液對于HUVECs體外增殖具有促進作用。見圖 4。
圖4
CCK-8法測定各時間點不同濃度DPMT浸提液中HUVECs A值
Figure4.
Absorption values of HUVECs incubated in DPMT extraction liquor in different concentrations at each time point using CCK-8 assay
2.4.2 活死細胞染色
培養3 d后激光共聚焦顯微鏡觀察示，HUVECs于DPMT表面生長良好，由于DPMT內部孔隙存在，細胞于支架材料中分布欠均勻，呈鋪展生長。見圖 5。
圖5
HUVECs接種于DPMT共培養3 d后激光共聚焦顯微鏡下觀察活死細胞染色情況 ? ～ ? 分別為活細胞染色、死細胞染色、重疊圖像（×40） ? ～ ? 分別為活細胞染色、死細胞染色、重疊圖像（×200） ? ?2.5 DPMT體內生物相容性評價
大鼠均成活至實驗完成，大體觀察植入部位皮膚無局部紅腫、粘連、積液、潰瘍或膿腫形成（圖 6）。大體觀察示，DPMT植入后3～14 d其大小無明顯變化，橫徑分別為（10.808±0.521）、（10.746±1.500）、（8.698±2.155）mm，28 d時DPMT已幾乎完全降解。見圖 7。
HE染色及 CD31免疫組織化學染色觀察示，術后3 d DPMT呈粉紅色均質狀，支架材料間隙中可見大量炎性細胞浸潤，以中性粒細胞為主，偶可見少量淋巴細胞和成纖維細胞；未見血管環結構新生。7 d，炎性細胞在DPMT中分布更均勻，但較3 d時顯著減少，仍以中性粒細胞為主，淋巴細胞增加，可見部分成纖維細胞，少量新生血管環結構形成。14 d，DPMT內炎性細胞與7 d時無明顯差異，以淋巴細胞為主，中性粒細胞較少，其間亦可見大量成纖維細胞，新生血管環結構較7 d時顯著增加。見圖 8、9。
細胞及血管環結構計數結果顯示，與術后3 d比較，術后7 d炎性細胞顯著減少，其中以中性粒細胞顯著減少為主，成纖維細胞顯著增加；14 d時炎性細胞亦顯著減少，其中以中性粒細胞顯著減少為主，淋巴細胞、成纖維細胞均顯著增加；比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。與術后7 d比較，術后14 d中性粒細胞顯著減少，淋巴細胞、成纖維細胞及血管環數量均顯著增加；比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。其余各時間點以上指標比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。
表1
術后各時間點HE染色細胞及 CD31染色血管環結構計數觀察（n=6，個/mm2，x±s）
Table1.
Cell count by HE staining and capillary ring structure by CD31 staining after surgery（n=6，/mm2，x±s）
3 討論
ECM是各器官或組織固有細胞的分泌產物[9]，為細胞提供支撐結構的同時也是細胞信號通路中的重要底物分子，在誘導細胞行為和維持細胞表型等方面亦起到至關重要的作用[10-11]，進而起到模板作用，引導具有特定結構和功能的組織再生[12]。因此，以ECM為基礎的天然生物支架材料已廣泛應用于組織工程和再生醫學領域[13-15]。
組織脫細胞是在最大程度保留ECM固有結構和成分的前提下，盡可能完全去除細胞成分，以消除其抗原性[11, 16-17]。不同脫細胞方法制備的ECM支架材料，其內部微結構、物理特性和組成成分存在一定差異，該差異會進一步影響種子細胞的生物學行為[12]。因此，ECM支架材料的制備方法對最終能否實現組織修復重建具有重要作用。目前常用的脫細胞方法包括化學試劑、生物試劑、物理法[18]，但單一方法常無法達到良好脫細胞效果，當前研究以多步驟聯合脫細胞方案為主。
近年來，骨骼肌ECM支架材料已用于下肢[19]、腹壁肌肉缺損修復[20]及脊髓損傷修復[21]研究中。骨骼肌由于肌纖維結構排列緊密，且表面包裹多層基膜結構，難以被化學及生物酶試劑滲透。Lin等[22]通過對比4種不同大鼠骨骼肌脫細胞方法，確定酶-去垢劑混合溶液浸泡法為最優方案，但所需脫細胞處理時間長達16 d，而且在脫細胞期間需不斷換液，試劑成本較大。Zhang等[21]采用了類似方案，僅提高了去垢劑濃度，脫細胞時間縮短至9 d，但每次脫細胞試劑溶液體積需達骨骼肌體積的30倍，試劑耗損較大。通過進一步增加去垢劑濃度后，Mligiliche等[23]將脫細胞所需時間縮短至6 d，但高濃度去垢劑長時間處理會導致支架材料中生物活性因子的損耗，進而影響后續材料與種子細胞的相互作用。卿泉等[24]通過對不同濃度試劑、溫度及時間梯度進行研究后，篩選出最佳大鼠骨骼肌束脫細胞方案，即采用1.0%SDS于4℃條件下震蕩處理72 h，所得材料肌纖維去除完全且ECM保留完好；但該研究中脫細胞效果評價方法較單一，且可重復性欠佳，故該方法有效性仍有待研究明確。需特別注意的是，目前常見的骨骼肌脫細胞方案大多針對大鼠骨骼肌制定，批次處理組織量少，支架材料產量低，難以實現臨床大體積組織缺損修復對支架材料量的需求。本課題組在前期研究中針對豬骨骼肌組織脫細胞處理方法進行探索，將豬骨骼肌切成2 mm薄片后再行去垢劑脫細胞處理，該方法所需脫細胞時間為6 d，但操作步驟繁瑣，且制備過程受操作者主觀影響較大[7]。本研究中，經過勻漿預處理后的豬骨骼肌組織大體結構被破壞，能夠與脫細胞試劑充分混合接觸；由于在后續的胰蛋白酶-EDTA溶液震蕩消化過程中，肌纖維極易相互纏繞成團，球磨處理能夠進一步提高后續脫細胞處理的效率，在進一步降低去垢劑溶液濃度的同時將脫細胞時間縮短至僅4 h，更有利于ECM中生物活性蛋白成分的保留。本研究的勻漿-球磨-去垢劑脫細胞方案對體積較大的豬骨骼肌脫細胞處理僅需1 d時間，耗時短，且處理過程中主要采用勻漿機、球磨儀及離心機等機械設備，操作簡便，相同參數條件下處理結果穩定，避免了操作者的主觀影響，具有良好可重復性。
此外，本研究體外細胞培養結果顯示DPMT浸提液對于HUVECs生長具有促進作用。動物實驗結果顯示皮下植入7 d時，DPMT內部即可見大量新生血管環結構，14 d時血管環數量進一步增加。提示DPMT具有一定誘導新生毛細血管環形成的潛能，但有待進一步研究證實。
綜上述，勻漿-球磨-去垢劑多步驟脫細胞方案具有省時高效、可重復性佳等優點；所制備的DPMT脫細胞、脫脂效果完全，主要成分為Ⅰ型膠原及Ⅳ型膠原，內部呈均質疏松網狀結構，蛋白質成分保存良好，細胞相容性佳，具有一定的抗降解能力和良好的生物相容性，且可能具有誘導血管新生潛能，有待進一步研究確定。
乳腺癌位居我國女性惡性腫瘤的首位，成為危害女性身心健康的主要疾病[1-2]。外科手術是治療乳腺癌的主要手段之一，但會導致乳腺軟組織缺失，嚴重影響患者生存質量，因此軟組織修復重建成為研究熱點[3]。目前軟組織修復方法主要包括自體組織移植與異體材料填充，但分別存在供區有限、供區功能影響、創傷大等不足[4]，以及異物反應、包膜攣縮、填充物破裂等不良反應[5]。采用組織工程方法制備異源性細胞外基質（extracellular matrix，ECM）支架材料誘導實現組織原位再生，為軟組織修復提供了新思路。豬骨骼肌由多層膜性結構包裹而成，血管網絡豐富，含有多種生物活性成分，且與人同源性高。本課題組前期初步探索了豬骨骼肌脫細胞方法，并對制備的豬骨骼肌脫細胞ECM支架材料力學特性進行了初步研究[6-7]，但其脫細胞處理過程耗時費力，且脫細胞效果受操作者人為影響較大。我們在前期研究基礎上進一步探索，提出了一種優化豬骨骼肌脫細胞方法（勻漿-球磨-去垢劑多步驟脫細胞方法）制備豬骨骼肌來源無細胞基質（decellularized porcine muscle tissue，DPMT）。本研究旨在探討該方法的可行性，以期為軟組織修復重建提供理想的組織工程支架材料制備方法。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
2月齡SPF級雄性健康SD大鼠20只，體質量250～300 g，由成都達碩生物科技有限公司提供，四川大學華西醫學實驗動物中心飼養。市售新鮮健康成年家豬腰部骨骼肌組織，均于處死1 h內收集標本。小鼠成纖維細胞系（NIH3T3）和人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）購自ATCC細胞庫（CRL-1658，CRL-1730）。
胰蛋白酶、PicoGreen? dsDNA定量試劑盒（Invitrogen公司，美國）；EDTA（Sanland公司，美國）；Triton X-100、脫氧膽酸鈉、金屬蛋白酶K、碘化丙啶（propidium iodide，PI）、鈣黃綠素（Sigma公司，美國）；BCA法蛋白定量試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公司）；Anti-CD31抗體（Abcam公司，英國）；DAB（北京中杉金橋生物技術有限公司）；DMEM培養基、FBS（GIBCO公司，美國）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；Dojindo公司，日本）。
組織搗碎勻漿機（江蘇金壇恒豐制造有限公司）；低溫球磨儀（Retsch公司，德國）；DW3真空凍干機（Christ公司，德國）；水平離心機（北京醫用離心機廠）；掃描電鏡（Hitachi公司，日本）；熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡（Nikon公司，日本）；熒光酶標儀（Leica公司，德國）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）。
1.2 DPMT制備
① 漂洗：取新鮮豬腰部骨骼肌，去離子水反復漂洗，剔除附著的肌腱及表面筋膜組織；② 勻漿：將骨骼肌切成大小約2 cm×1 cm ×1 cm的組織塊，再次浸泡漂洗數次，去除肌肉間血液，加入等體積PBS，置于組織搗碎勻漿機中，以12 000 r/min勻漿處理4 min；③ 胰蛋白酶消化：向混合液中加入3倍體積胰蛋白酶消化液（0.1% 胰蛋白酶+0.05%EDTA），置于37℃恒溫搖床中消化2 h；④ 離心漂洗：將混合液以離心半徑17.4 cm、3 500 r/min 離心5 min，棄上層溶液，加入大量PBS反復漂洗；⑤ 低溫球磨：將漂洗后的組織碎片置于液氮中快速冷凍5 min后，以25 Hz球磨打粉5 min；⑥ 去垢劑脫細胞：將粉狀材料置于10倍體積去垢劑混合溶液（1% Triton X-100+0.2%脫氧膽酸鈉），室溫下震蕩4 h，同上法離心5 min，棄上清后大量PBS漂洗；⑦ 脫脂：將材料置于10倍體積甲醇、乙醇混合有機溶液，甲醇∶乙醇（V/V）=1∶1，室溫下震蕩脫脂2 h，同上法離心5 min，棄上清液，大量PBS漂洗至無氣味；⑧ 低溫凍干：將粉狀材料放入不同模具中，凍干制成不同形狀DPMT。
1.3 觀測指標
1.3.1 組織學及掃描電鏡觀察
取DPMT與新鮮豬骨骼肌分別置于4%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，常規5 μm連續切片，行HE染色、DAPI染色；DPMT切片同時行天狼猩紅染色。DPMT與新鮮豬骨骼肌組織塊冰凍切片后行油紅O染色。將DPMT使用真空凍干機凍干，使用手術刀切取平整觀察切面，掃描電鏡觀察。
1.3.2 DPMT成分定量檢測
將新鮮豬骨骼肌和DPMT凍干后，液氮快速冷凍5 min，以25 Hz球磨5 min；各取一定體積粉狀材料，參照PicoGreen? dsDNA定量試劑盒說明書測定DNA含量。另取新鮮豬骨骼肌和DPMT，參照BCA法蛋白定量試劑盒說明書檢測材料中總蛋白質含量。
1.3.3 DPMT體外細胞相容性評價
① 脂肪來源干細胞（adipose derived stem cells，ADSCs）分離培養：取于四川大學華西醫院接受乳腺癌手術患者自愿捐贈的正常脂肪組織，參照本課題組前期實驗方法分離培養ADSCs并鑒定[7]。選擇第3代ADSCs進行后續實驗。
② DPMT體外細胞毒性評級：參照《中華人民共和國國家標準：醫療器械生物學評價GB/T 16886》規定[8]，制備DPMT浸提液。將DPMT材料修剪成長1 cm、寬1 cm、厚0.1～0.2 cm大小膜片狀，環氧乙烷消毒，添加一定體積含5%FBS的DMEM培養基浸泡材料，37℃孵箱內孵育24 h，制備濃度梯度為25%、50%、75%、100%的浸提液，4℃冰箱保存。
將ADSCs、NIH3T3和HUVECs以4×103個/孔接種于96孔細胞培養板，根據不同細胞種類選擇相應完全培養基，另每孔分別加入100 μL不同濃度梯度DPMT浸提液（濃度梯度設置為0、25%、50%、75%、100%），每2天換液1次。于培養后第1、3、5天采用CCK-8試劑盒檢測吸光度（A）值，定義0濃度組為陰性對照組，其余濃度組為實驗組，計算其相對增殖率（relative growth rate，RGR），RGR=實驗組A值/陰性對照組A值；按照以下標準對材料毒性進行分級：0級，RGR≥100%；1級，80%≤RGR＜100%；2級，50%≤RGR＜80%；3級，30%≤RGR＜50%；4級，RGR＜30%。其中0～1級為材料無細胞毒性；2級為輕度細胞毒性，需結合細胞形態綜合評價；3～4級為中度細胞毒性；5級為明顯細胞毒性。
③ 活死細胞染色：將DPMT冰凍切片制成大小為1.00 cm×1.00 cm×0.01 cm的薄膜，凍干后環氧乙烷消毒。將消毒后的DPMT置于6孔細胞培養板（1片/孔），每孔加入無血清DMEM培養基500 μL浸泡過夜，吸棄培養基；在DPMT表面添加濃度為1×107 個 / mL的HUVECs細胞懸液，每孔5 μL；置于37℃、5%CO2細胞培養箱中孵育30 min；同上法再次接種細胞，兩次共接種HUVECs 1×105個。每孔添加含5%FBS的DMEM培養基5 μL，于37℃、5%CO2細胞培養箱中孵育30 min；同上法重復添加培養基2 次，待HUVECs于DPMT表面貼壁生長后，每孔加入500 μL含5%FBS的DMEM培養基，于37℃、5%CO2細胞培養箱中孵育；每2天換液1次，于培養后3 d行熒光活死細胞染色（鈣黃綠素/PI法），激光共聚焦顯微鏡下觀察。
1.3.4 DPMT體內生物相容性評價
采用SD大鼠背部皮下植入模型評價DPMT的生物相容性。取20只SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛（1 mL/300 g）麻醉后，取俯臥位，于背部近后肢處作2～3 cm切口，分離皮下筋膜腔，將大小為1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm的DPMT浸泡于無菌PBS中水化后，植入皮下筋膜腔內，縫合筋膜及皮膚。術后觀察大鼠成活情況以及材料植入部位有無感染等發生；于3、7、14、28 d各取5只大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉后斷頸處死，將移植物及周圍皮膚一并切取，直尺測量剩余材料橫徑。然后行組織切片，HE染色及CD31免疫組織化學染色，觀察DPMT中炎性細胞浸潤及血管環結構新生情況。400倍鏡下每張切片取6個視野，于HE染色切片上人工計數炎性細胞（包括中性粒細胞及淋巴細胞）和成纖維細胞；于CD31染色切片上人工計數血管環結構。
1.4 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 DPMT制備觀察
勻漿-球磨-去垢劑多步驟脫細胞方法操作簡便，制備DPMT僅需1 d時間。混合等體積PBS勻漿處理后，肌肉組織碎片處于液相均質懸濁狀態，靜置無分層現象；經胰蛋白酶-EDTA震蕩消化處理后，肌纖維及肌筋膜混合片段呈淡黃色絮狀；低溫球磨后，組織呈粉末狀；在脫細胞、脫脂過程中，肌肉組織自發相互纏繞成為細絮狀，最終形成呈乳白色半透明狀態的DPMT；凍干處理后，DPMT呈乳白色膜片狀整體結構，可根據需求修剪成為不同形狀，再次充分水化后DPMT仍能保持結構完整性。見圖 1。
圖1
DPMT制備過程大體觀察 ? 將新鮮豬骨骼肌組織切成大小為2 cm×1 cm×1 cm的組織塊 ? 組織勻漿后 ? 經胰蛋白酶-EDTA振蕩消化后的組織碎片 ? 低溫球磨后組織呈粉末狀 ? 脫細胞、脫脂處理后獲得DPMT ? 低溫凍干后的DPMT ? 修剪成1 cm×1 cm大小的DPMT ? DPMT水化后能保持結構完整性 ? ?2.2 組織學及掃描電鏡觀察
HE染色示，新鮮豬骨骼肌中肌纖維呈束狀規則排列，細胞核位于肌纖維邊緣；DPMT呈松散均質狀，其內未見藍染細胞核。DAPI染色示，新鮮豬骨骼肌見藍色熒光的細胞核呈條束狀排列；DPMT中未見藍色熒光的細胞核或雙鏈DNA片段結構。油紅O染色示，新鮮豬骨骼肌組織中可見脂滴成分，DPMT中無脂滴殘留。天狼猩紅染色示，DPMT主要成分為Ⅰ型膠原，其間散在分布Ⅳ型膠原。見圖 2。掃描電鏡觀察示DPMT呈均質疏松網狀，纖維結構間未見細胞殘留（圖 3）。
2.3 DPMT成分定量檢測
新鮮豬骨骼肌組織中DNA含量為（140.724±10.422） ng/mg干重，DPMT中為（15.902±1.392） ng/ mg干重，組間比較差異有統計學意義（t=18.374，P=0.003）。
新鮮豬骨骼肌總蛋白質含量為（0.465 7± 0.005 4）mg/mL，DPMT為（0.3447±0.0041） mg/ mL，組間比較差異有統計學意義（t= -44.070，P=0.000）。樣本制備時設置各材料初始濃度為0.5 mg/mL，故新鮮豬骨骼肌中總蛋白質含量占其干重的93.14%，DPMT中總蛋白質含量占其干重的68.94%。
2.4 DPMT體外細胞相容性評價
2.4.1 DPMT細胞毒性評級
DPMT各濃度浸提液培養ADSCs、NIH3T3和HUVECs后，根據細胞毒性評級標準各時間點均為0～1級，提示DPMT無細胞毒性。各時間點隨DPMT浸提液濃度增加，HUVECs細胞生長數量呈上升趨勢，提示DPMT浸提液對于HUVECs體外增殖具有促進作用。見圖 4。
圖4
CCK-8法測定各時間點不同濃度DPMT浸提液中HUVECs A值
Figure4.
Absorption values of HUVECs incubated in DPMT extraction liquor in different concentrations at each time point using CCK-8 assay
2.4.2 活死細胞染色
培養3 d后激光共聚焦顯微鏡觀察示，HUVECs于DPMT表面生長良好，由于DPMT內部孔隙存在，細胞于支架材料中分布欠均勻，呈鋪展生長。見圖 5。
圖5
HUVECs接種于DPMT共培養3 d后激光共聚焦顯微鏡下觀察活死細胞染色情況 ? ～ ? 分別為活細胞染色、死細胞染色、重疊圖像（×40） ? ～ ? 分別為活細胞染色、死細胞染色、重疊圖像（×200） ? ?2.5 DPMT體內生物相容性評價
大鼠均成活至實驗完成，大體觀察植入部位皮膚無局部紅腫、粘連、積液、潰瘍或膿腫形成（圖 6）。大體觀察示，DPMT植入后3～14 d其大小無明顯變化，橫徑分別為（10.808±0.521）、（10.746±1.500）、（8.698±2.155）mm，28 d時DPMT已幾乎完全降解。見圖 7。
HE染色及 CD31免疫組織化學染色觀察示，術后3 d DPMT呈粉紅色均質狀，支架材料間隙中可見大量炎性細胞浸潤，以中性粒細胞為主，偶可見少量淋巴細胞和成纖維細胞；未見血管環結構新生。7 d，炎性細胞在DPMT中分布更均勻，但較3 d時顯著減少，仍以中性粒細胞為主，淋巴細胞增加，可見部分成纖維細胞，少量新生血管環結構形成。14 d，DPMT內炎性細胞與7 d時無明顯差異，以淋巴細胞為主，中性粒細胞較少，其間亦可見大量成纖維細胞，新生血管環結構較7 d時顯著增加。見圖 8、9。
細胞及血管環結構計數結果顯示，與術后3 d比較，術后7 d炎性細胞顯著減少，其中以中性粒細胞顯著減少為主，成纖維細胞顯著增加；14 d時炎性細胞亦顯著減少，其中以中性粒細胞顯著減少為主，淋巴細胞、成纖維細胞均顯著增加；比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。與術后7 d比較，術后14 d中性粒細胞顯著減少，淋巴細胞、成纖維細胞及血管環數量均顯著增加；比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。其余各時間點以上指標比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。
表1
術后各時間點HE染色細胞及 CD31染色血管環結構計數觀察（n=6，個/mm2，x±s）
Table1.
Cell count by HE staining and capillary ring structure by CD31 staining after surgery（n=6，/mm2，x±s）
3 討論
ECM是各器官或組織固有細胞的分泌產物[9]，為細胞提供支撐結構的同時也是細胞信號通路中的重要底物分子，在誘導細胞行為和維持細胞表型等方面亦起到至關重要的作用[10-11]，進而起到模板作用，引導具有特定結構和功能的組織再生[12]。因此，以ECM為基礎的天然生物支架材料已廣泛應用于組織工程和再生醫學領域[13-15]。
組織脫細胞是在最大程度保留ECM固有結構和成分的前提下，盡可能完全去除細胞成分，以消除其抗原性[11, 16-17]。不同脫細胞方法制備的ECM支架材料，其內部微結構、物理特性和組成成分存在一定差異，該差異會進一步影響種子細胞的生物學行為[12]。因此，ECM支架材料的制備方法對最終能否實現組織修復重建具有重要作用。目前常用的脫細胞方法包括化學試劑、生物試劑、物理法[18]，但單一方法常無法達到良好脫細胞效果，當前研究以多步驟聯合脫細胞方案為主。
近年來，骨骼肌ECM支架材料已用于下肢[19]、腹壁肌肉缺損修復[20]及脊髓損傷修復[21]研究中。骨骼肌由于肌纖維結構排列緊密，且表面包裹多層基膜結構，難以被化學及生物酶試劑滲透。Lin等[22]通過對比4種不同大鼠骨骼肌脫細胞方法，確定酶-去垢劑混合溶液浸泡法為最優方案，但所需脫細胞處理時間長達16 d，而且在脫細胞期間需不斷換液，試劑成本較大。Zhang等[21]采用了類似方案，僅提高了去垢劑濃度，脫細胞時間縮短至9 d，但每次脫細胞試劑溶液體積需達骨骼肌體積的30倍，試劑耗損較大。通過進一步增加去垢劑濃度后，Mligiliche等[23]將脫細胞所需時間縮短至6 d，但高濃度去垢劑長時間處理會導致支架材料中生物活性因子的損耗，進而影響后續材料與種子細胞的相互作用。卿泉等[24]通過對不同濃度試劑、溫度及時間梯度進行研究后，篩選出最佳大鼠骨骼肌束脫細胞方案，即采用1.0%SDS于4℃條件下震蕩處理72 h，所得材料肌纖維去除完全且ECM保留完好；但該研究中脫細胞效果評價方法較單一，且可重復性欠佳，故該方法有效性仍有待研究明確。需特別注意的是，目前常見的骨骼肌脫細胞方案大多針對大鼠骨骼肌制定，批次處理組織量少，支架材料產量低，難以實現臨床大體積組織缺損修復對支架材料量的需求。本課題組在前期研究中針對豬骨骼肌組織脫細胞處理方法進行探索，將豬骨骼肌切成2 mm薄片后再行去垢劑脫細胞處理，該方法所需脫細胞時間為6 d，但操作步驟繁瑣，且制備過程受操作者主觀影響較大[7]。本研究中，經過勻漿預處理后的豬骨骼肌組織大體結構被破壞，能夠與脫細胞試劑充分混合接觸；由于在后續的胰蛋白酶-EDTA溶液震蕩消化過程中，肌纖維極易相互纏繞成團，球磨處理能夠進一步提高后續脫細胞處理的效率，在進一步降低去垢劑溶液濃度的同時將脫細胞時間縮短至僅4 h，更有利于ECM中生物活性蛋白成分的保留。本研究的勻漿-球磨-去垢劑脫細胞方案對體積較大的豬骨骼肌脫細胞處理僅需1 d時間，耗時短，且處理過程中主要采用勻漿機、球磨儀及離心機等機械設備，操作簡便，相同參數條件下處理結果穩定，避免了操作者的主觀影響，具有良好可重復性。
此外，本研究體外細胞培養結果顯示DPMT浸提液對于HUVECs生長具有促進作用。動物實驗結果顯示皮下植入7 d時，DPMT內部即可見大量新生血管環結構，14 d時血管環數量進一步增加。提示DPMT具有一定誘導新生毛細血管環形成的潛能，但有待進一步研究證實。
綜上述，勻漿-球磨-去垢劑多步驟脫細胞方案具有省時高效、可重復性佳等優點；所制備的DPMT脫細胞、脫脂效果完全，主要成分為Ⅰ型膠原及Ⅳ型膠原，內部呈均質疏松網狀結構，蛋白質成分保存良好，細胞相容性佳，具有一定的抗降解能力和良好的生物相容性，且可能具有誘導血管新生潛能，有待進一步研究確定。
