引用本文： 尤武林, 王建偉, 黃桂成, 張亞峰. 過表達插頭框轉錄因子C2經Wnt信號通路調節BMSCs成骨分化的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(10): 1276-1281. doi: 10.7507/1002-1892.20160260 復制
MSCs是一種存在于多種組織內的非造血干細胞，易于擴增、分化為各種不同細胞[1]。從骨髓中分離出來的BMSCs是成體干細胞中最具有細胞治療臨床應用潛力的細胞之一，其在某些因子調控下可向不同組織細胞分化，分化過程中同時伴有特異性標志物水平的上調[2]。如何更好地調控、誘導MSCs向成骨細胞分化，是解決骨組織工程種子細胞來源的一個前提。許多細胞因子已被發現能促進BMSCs向骨細胞、軟骨細胞等方向分化[3]。過表達插頭框轉錄因子C2（forkhead/Fox transcription factor 2，Foxc2）是屬于人類forkhead家族的一個重要轉錄因子，最初克隆于小鼠腦組織，直接調控內皮細胞中趨化因子受體4的表達[4]，參與調控內皮基因表達及血管的發生[5]；更重要的是，Foxc2基因的表達能夠影響通路的開啟，Wnt和BMP-2信號通路的激活直接影響成骨細胞分化過程[6-8]。本研究通過高表達轉錄因子Foxc2刺激BMSCs成骨分化，觀察Wnt信號途徑中β鏈蛋白（β-catenin）的表達水平；另外，通過抑制β-catenin的表達，驗證Foxc2介導的成骨分化過程是否與Wnt-β-catenin通路的激活有關。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
1.5月齡雄性純種新西蘭大耳白兔3只，體質量1.5～2.5 kg，由南京中醫藥大學實驗動物中心提供。
L-DMEM、FBS（GIBCO公司，美國）；水溶性四氮唑-1（water soluble tetrazolium-1，WST-1）試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；β-catenin抑制劑XAV-939（Sigma公司，美國）；羊抗兔IgG-FITC二抗、兔抗Ⅰ型膠原（collagen typeⅠ，COLⅠ）抗體、兔抗過氧化物酶體增殖體激活受體γ2（peroxisome proliferator activated receptor gamma 2，PPARγ-2）抗體（Novus公司，美國）；兔抗骨鈣素（osteocalcin，OCN）抗體（Abcam公司，美國）；兔抗β-catenin 抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；抗β-actin二抗（Santa Cruz公司，美國）。熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；ABI 7500實時熒光定量儀（Life Technologies公司，美國）。
1.2 BMSCs的培養及鑒定
取3只新西蘭大白兔的股骨和脛骨，采用全骨髓密度梯度離心法合并貼壁培養法培養BMSCs并傳代，蘇木素染色后光鏡下觀察細胞形態變化。取生長良好的第5代BMSCs，向培養板中分別加入成骨誘導培養基（含0.1 μmol/L 地塞米松、10 mmol/L β甘油磷酸鈉、1.05 mmol/L維生素C及10%FBS的L-DMEM培養基），成脂誘導培養基（含100U/ mL青霉素、100 U/mL鏈霉素、10 μmol/L地塞米松、10mg/mL胰島素、0.5 mmol/L異丁基-甲基黃嘌呤、200 μmol/L吲哚美辛的L-DMEM培養基）進行成骨、成脂誘導分化鑒定。
1.3 WST-1法檢測慢病毒轉染后細胞活性
取第5代BMSCs分為3組，A組為Lv-綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）轉染組，B組為Lv-Foxc2轉染組，C組為未轉染組。參照文獻[9]方法轉染細胞72 h后，各組BMSCs以2×104個/孔密度培養于96孔板，24 h后每孔添加10 μL WST-1溶液，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養4 h，然后將培養板完全振蕩（1 000 r/min）1 min，檢測波長450 nm處吸光度（A）值。以C組A值作為100%對照。檢測3次，取均值。
1.4 過表達Foxc2對Wnt-β-catenin信號通路的影響
1.4.1 免疫熒光染色觀察
取第5代BMSCs分為2組，A組為Lv-GFP轉染組，B組為Lv-Foxc2轉染組。慢病毒轉染后2周，4%甲醛固定各組細胞，50μg/ mL DAPI行細胞核染色，用1∶100稀釋的一抗OCN、COLⅠ和β-catenin，以及結合德克薩斯紅的二抗進行細胞染色，熒光顯微鏡下觀察染色情況。
1.4.2 Western
blot檢測 首先，同1.4.1方法分組后，慢病毒轉染2周，采用Western blot法檢測A、B組β-catenin蛋白表達。然后，在B組慢病毒轉染BMSCs后，添加不同劑量（0、0.1、1.0 μmol/L）XAV-939，分別行成骨、成脂誘導2周，采用Western blot法檢測各組成骨因子COLⅠ、OCN及成脂因子PPARγ-2蛋白的表達。操作方法：根據說明書提取BMSCs總蛋白并離心，二喹啉甲酸試劑盒測定蛋白濃度，待完成轉膜、封閉等一系列操作后，加入一抗兔抗COLⅠ、OCN、PPARγ-2及β-catenin抗體，以β-actin作為內參，4℃過夜，用TBST洗膜，加入二抗后孵育1 h，進行清洗、發光、顯影及定影，目的蛋白條帶灰度值利用Image J分析軟件分析。
1.4.3 實時熒光定量PCR檢測
首先，同1.4.1方法分組后，慢病毒轉染2周，采用實時熒光定量PCR檢測A、B組β-catenin mRNA的表達。然后，在B組慢病毒轉染BMSCs后，添加不同劑量（0、0.1、1.0μmol/L）XAV-939，分別行成骨、成脂誘導2周，采用實時熒光定量PCR法檢測各組成骨因子COLⅠ、OCN及成脂因子PPARγ-2 mRNA相對表達量。引物由Primer5軟件自行設計，引物序列見表 1。
表1
實時熒光定量PCR引物序列
Table1.
Primersequences for real time fluorescence quantitative PCR
1.5 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs形態學觀察及鑒定
原代細胞經蘇木素染色后光鏡下觀察，細胞呈梭形，周圍有突起，相互連接，細胞核呈藍色卵圓形，細胞質呈淡藍色，許多細胞呈分裂相表現（圖 1）。
圖1
原代BMSCs蘇木素染色觀察（×200） ? ?成骨誘導分化培養2周，茜素紅染色呈陽性，鏡下觀察見細胞呈集落生長，鈣結節形成；成脂誘導分化培養2周，油紅O染色示細胞中含大小不等的橘紅色脂滴。見圖 2。
2.2 WST-1法檢測慢病毒轉染后細胞活性
慢病毒轉染72 h后，B組細胞活性為130.85%±0.15%，顯著高于A組的100.45%±0.35%，差異有統計學意義（t=7.500，P=0.004）。
2.3 過表達Foxc2對Wnt-β-catenin信號通路的影 響
2.3.1 免疫熒光染色觀察
慢病毒轉染后2 周，熒光顯微鏡觀察示B組細胞OCN、COLⅠ及β-catenin染色均為陽性，A組染色均為陰性。見圖 3～5。
圖4
各組轉染2周OCN免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×400） 從左至右分別為OCN、DAPI、OCN/DAPI染色 ? A組 ? B組 ? ?2.3.2 Western
blot檢測 慢病毒轉染2周，A、B組β-catenin蛋白表達量分別為0.15±0.05和7.12±0.65，B組顯著高于A組，差異有統計學意義（t=35.770，P=0.000）。見圖 6。添加XAV-939后，細胞中成骨因子OCN、COLⅠ蛋白表達量逐漸減少，而成脂因子PPARγ-2蛋白表達量明顯增高，且表達具有劑量依賴性，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 7。
圖6
Western blot檢測A、B組轉染2周 β-catenin蛋白表達 1：A組 2：B組 ? ?2.3.3 實時熒光定量PCR檢測
慢病毒轉染2周，A、B組β-catenin mRNA相對表達量分別為0.85±0.45和5.78±1.25，B組顯著高于A組，差異有統計學意義（t=4.750，P=0.000）。添加XAV-939后，細胞中成骨因子OCN、COLⅠmRNA相對表達量逐漸減少，而成脂因子PPARγ-2 mRNA相對表達量明顯增高，且表達具有劑量依賴性，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 8。
3 討論
MSCs具有自我更新及多向分化潛能，在適當刺激下可分化為高特異性的細胞，在表型、功能和生物化學等方面，BMSCs可能具有不同細胞的混合表象[10]。體外誘導BMSCs成骨分化的方法多種多樣，使用較多的主要是各種藥物、生長因子及基因轉染誘導[11]。
BMSCs在成骨分化過程中受多種因素調控，因此利用這些因子促進成骨分化成為干細胞研究的熱點。在胚胎發育期，Foxc2作為E-twenty six蛋白的一個重要輔助因子，在成脂過程中的作用至關重要[12]，高表達Foxc2能夠上調整合素Integrin-1的水平，激活Wnt和BMP-2信號通路，進而調節成骨細胞分化過程[8]。Wnt信號轉導取決于β-catenin在細胞內的水平，當細胞內β-catenin的水平降低時，Wnt途徑處于關閉狀態；而當β-catenin升高達一定水平時，將激活Wnt信號途徑，信號由細胞膜順利轉導入細胞核內，從而對靶基因進行核轉錄。
β-catenin是一種細胞骨架蛋白，其能與上皮細胞鈣黏蛋白形成一黏附復合體，從而在細胞與細胞黏附中發揮重要作用。此外，β-catenin是Wnt信號轉導通路中非常關鍵的調節因子，Wnt蛋白和卷曲受體結合后，將信號傳入細胞內，導致細胞內的β-catenin水平升高，后者進入細胞核與TCF/LEF結合，控制目的基因的轉錄[13-15]。許多正性和負性調節因子可對β-catenin蛋白的穩定性以及其在細胞內的位置進行調控，負性調節因子對β-catenin的穩定性起破壞作用，降低其在細胞內的水平，從而關閉Wnt信號；正性調節因子在對Wnt信號反應時被激活，從而拮抗對復合體的破壞，使細胞內的β-catenin水平升高，進而啟動Wnt信號途徑[16]。如果這些調節因子的功能及調控異常，可導致Wnt信號通路異常激活，從而使基因表達、細胞粘連、發育等發生一系列異常[17]。Wnt信號的其他調節物，如MAPK途徑、TGF-β激活的激酶1等都參與Wnt信號的調節，其中TGF-β信號途徑能與Wnt信號途徑協同調節基因的表達[18]。本研究通過過表達Foxc2基因，發現BMSCs中β-catenin蛋白表達增高，添加β-catenin抑制劑后，細胞中成骨因子表達降低，成脂因子表達增加，說明外源性轉錄因子Foxc2促進BMSCs成骨分化過程中，可能與Wnt-β-catenin通路的激活有關。
綜上述，過表達Foxc2的BMSCs具有較高的細胞活性，Foxc2能促進BMSCs成骨分化，抑制其成脂分化。更重要的是，轉錄因子Foxc2介導的成骨分化可能激活了Wnt信號通路，Wnt-β-catenin途徑參與了轉染后BMSCs的成骨分化過程。
MSCs是一種存在于多種組織內的非造血干細胞，易于擴增、分化為各種不同細胞[1]。從骨髓中分離出來的BMSCs是成體干細胞中最具有細胞治療臨床應用潛力的細胞之一，其在某些因子調控下可向不同組織細胞分化，分化過程中同時伴有特異性標志物水平的上調[2]。如何更好地調控、誘導MSCs向成骨細胞分化，是解決骨組織工程種子細胞來源的一個前提。許多細胞因子已被發現能促進BMSCs向骨細胞、軟骨細胞等方向分化[3]。過表達插頭框轉錄因子C2（forkhead/Fox transcription factor 2，Foxc2）是屬于人類forkhead家族的一個重要轉錄因子，最初克隆于小鼠腦組織，直接調控內皮細胞中趨化因子受體4的表達[4]，參與調控內皮基因表達及血管的發生[5]；更重要的是，Foxc2基因的表達能夠影響通路的開啟，Wnt和BMP-2信號通路的激活直接影響成骨細胞分化過程[6-8]。本研究通過高表達轉錄因子Foxc2刺激BMSCs成骨分化，觀察Wnt信號途徑中β鏈蛋白（β-catenin）的表達水平；另外，通過抑制β-catenin的表達，驗證Foxc2介導的成骨分化過程是否與Wnt-β-catenin通路的激活有關。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
1.5月齡雄性純種新西蘭大耳白兔3只，體質量1.5～2.5 kg，由南京中醫藥大學實驗動物中心提供。
L-DMEM、FBS（GIBCO公司，美國）；水溶性四氮唑-1（water soluble tetrazolium-1，WST-1）試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；β-catenin抑制劑XAV-939（Sigma公司，美國）；羊抗兔IgG-FITC二抗、兔抗Ⅰ型膠原（collagen typeⅠ，COLⅠ）抗體、兔抗過氧化物酶體增殖體激活受體γ2（peroxisome proliferator activated receptor gamma 2，PPARγ-2）抗體（Novus公司，美國）；兔抗骨鈣素（osteocalcin，OCN）抗體（Abcam公司，美國）；兔抗β-catenin 抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；抗β-actin二抗（Santa Cruz公司，美國）。熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；ABI 7500實時熒光定量儀（Life Technologies公司，美國）。
1.2 BMSCs的培養及鑒定
取3只新西蘭大白兔的股骨和脛骨，采用全骨髓密度梯度離心法合并貼壁培養法培養BMSCs并傳代，蘇木素染色后光鏡下觀察細胞形態變化。取生長良好的第5代BMSCs，向培養板中分別加入成骨誘導培養基（含0.1 μmol/L 地塞米松、10 mmol/L β甘油磷酸鈉、1.05 mmol/L維生素C及10%FBS的L-DMEM培養基），成脂誘導培養基（含100U/ mL青霉素、100 U/mL鏈霉素、10 μmol/L地塞米松、10mg/mL胰島素、0.5 mmol/L異丁基-甲基黃嘌呤、200 μmol/L吲哚美辛的L-DMEM培養基）進行成骨、成脂誘導分化鑒定。
1.3 WST-1法檢測慢病毒轉染后細胞活性
取第5代BMSCs分為3組，A組為Lv-綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）轉染組，B組為Lv-Foxc2轉染組，C組為未轉染組。參照文獻[9]方法轉染細胞72 h后，各組BMSCs以2×104個/孔密度培養于96孔板，24 h后每孔添加10 μL WST-1溶液，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養4 h，然后將培養板完全振蕩（1 000 r/min）1 min，檢測波長450 nm處吸光度（A）值。以C組A值作為100%對照。檢測3次，取均值。
1.4 過表達Foxc2對Wnt-β-catenin信號通路的影響
1.4.1 免疫熒光染色觀察
取第5代BMSCs分為2組，A組為Lv-GFP轉染組，B組為Lv-Foxc2轉染組。慢病毒轉染后2周，4%甲醛固定各組細胞，50μg/ mL DAPI行細胞核染色，用1∶100稀釋的一抗OCN、COLⅠ和β-catenin，以及結合德克薩斯紅的二抗進行細胞染色，熒光顯微鏡下觀察染色情況。
1.4.2 Western
blot檢測 首先，同1.4.1方法分組后，慢病毒轉染2周，采用Western blot法檢測A、B組β-catenin蛋白表達。然后，在B組慢病毒轉染BMSCs后，添加不同劑量（0、0.1、1.0 μmol/L）XAV-939，分別行成骨、成脂誘導2周，采用Western blot法檢測各組成骨因子COLⅠ、OCN及成脂因子PPARγ-2蛋白的表達。操作方法：根據說明書提取BMSCs總蛋白并離心，二喹啉甲酸試劑盒測定蛋白濃度，待完成轉膜、封閉等一系列操作后，加入一抗兔抗COLⅠ、OCN、PPARγ-2及β-catenin抗體，以β-actin作為內參，4℃過夜，用TBST洗膜，加入二抗后孵育1 h，進行清洗、發光、顯影及定影，目的蛋白條帶灰度值利用Image J分析軟件分析。
1.4.3 實時熒光定量PCR檢測
首先，同1.4.1方法分組后，慢病毒轉染2周，采用實時熒光定量PCR檢測A、B組β-catenin mRNA的表達。然后，在B組慢病毒轉染BMSCs后，添加不同劑量（0、0.1、1.0μmol/L）XAV-939，分別行成骨、成脂誘導2周，采用實時熒光定量PCR法檢測各組成骨因子COLⅠ、OCN及成脂因子PPARγ-2 mRNA相對表達量。引物由Primer5軟件自行設計，引物序列見表 1。
表1
實時熒光定量PCR引物序列
Table1.
Primersequences for real time fluorescence quantitative PCR
1.5 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs形態學觀察及鑒定
原代細胞經蘇木素染色后光鏡下觀察，細胞呈梭形，周圍有突起，相互連接，細胞核呈藍色卵圓形，細胞質呈淡藍色，許多細胞呈分裂相表現（圖 1）。
圖1
原代BMSCs蘇木素染色觀察（×200） ? ?成骨誘導分化培養2周，茜素紅染色呈陽性，鏡下觀察見細胞呈集落生長，鈣結節形成；成脂誘導分化培養2周，油紅O染色示細胞中含大小不等的橘紅色脂滴。見圖 2。
2.2 WST-1法檢測慢病毒轉染后細胞活性
慢病毒轉染72 h后，B組細胞活性為130.85%±0.15%，顯著高于A組的100.45%±0.35%，差異有統計學意義（t=7.500，P=0.004）。
2.3 過表達Foxc2對Wnt-β-catenin信號通路的影 響
2.3.1 免疫熒光染色觀察
慢病毒轉染后2 周，熒光顯微鏡觀察示B組細胞OCN、COLⅠ及β-catenin染色均為陽性，A組染色均為陰性。見圖 3～5。
圖4
各組轉染2周OCN免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×400） 從左至右分別為OCN、DAPI、OCN/DAPI染色 ? A組 ? B組 ? ?2.3.2 Western
blot檢測 慢病毒轉染2周，A、B組β-catenin蛋白表達量分別為0.15±0.05和7.12±0.65，B組顯著高于A組，差異有統計學意義（t=35.770，P=0.000）。見圖 6。添加XAV-939后，細胞中成骨因子OCN、COLⅠ蛋白表達量逐漸減少，而成脂因子PPARγ-2蛋白表達量明顯增高，且表達具有劑量依賴性，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 7。
圖6
Western blot檢測A、B組轉染2周 β-catenin蛋白表達 1：A組 2：B組 ? ?2.3.3 實時熒光定量PCR檢測
慢病毒轉染2周，A、B組β-catenin mRNA相對表達量分別為0.85±0.45和5.78±1.25，B組顯著高于A組，差異有統計學意義（t=4.750，P=0.000）。添加XAV-939后，細胞中成骨因子OCN、COLⅠmRNA相對表達量逐漸減少，而成脂因子PPARγ-2 mRNA相對表達量明顯增高，且表達具有劑量依賴性，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 8。
3 討論
MSCs具有自我更新及多向分化潛能，在適當刺激下可分化為高特異性的細胞，在表型、功能和生物化學等方面，BMSCs可能具有不同細胞的混合表象[10]。體外誘導BMSCs成骨分化的方法多種多樣，使用較多的主要是各種藥物、生長因子及基因轉染誘導[11]。
BMSCs在成骨分化過程中受多種因素調控，因此利用這些因子促進成骨分化成為干細胞研究的熱點。在胚胎發育期，Foxc2作為E-twenty six蛋白的一個重要輔助因子，在成脂過程中的作用至關重要[12]，高表達Foxc2能夠上調整合素Integrin-1的水平，激活Wnt和BMP-2信號通路，進而調節成骨細胞分化過程[8]。Wnt信號轉導取決于β-catenin在細胞內的水平，當細胞內β-catenin的水平降低時，Wnt途徑處于關閉狀態；而當β-catenin升高達一定水平時，將激活Wnt信號途徑，信號由細胞膜順利轉導入細胞核內，從而對靶基因進行核轉錄。
β-catenin是一種細胞骨架蛋白，其能與上皮細胞鈣黏蛋白形成一黏附復合體，從而在細胞與細胞黏附中發揮重要作用。此外，β-catenin是Wnt信號轉導通路中非常關鍵的調節因子，Wnt蛋白和卷曲受體結合后，將信號傳入細胞內，導致細胞內的β-catenin水平升高，后者進入細胞核與TCF/LEF結合，控制目的基因的轉錄[13-15]。許多正性和負性調節因子可對β-catenin蛋白的穩定性以及其在細胞內的位置進行調控，負性調節因子對β-catenin的穩定性起破壞作用，降低其在細胞內的水平，從而關閉Wnt信號；正性調節因子在對Wnt信號反應時被激活，從而拮抗對復合體的破壞，使細胞內的β-catenin水平升高，進而啟動Wnt信號途徑[16]。如果這些調節因子的功能及調控異常，可導致Wnt信號通路異常激活，從而使基因表達、細胞粘連、發育等發生一系列異常[17]。Wnt信號的其他調節物，如MAPK途徑、TGF-β激活的激酶1等都參與Wnt信號的調節，其中TGF-β信號途徑能與Wnt信號途徑協同調節基因的表達[18]。本研究通過過表達Foxc2基因，發現BMSCs中β-catenin蛋白表達增高，添加β-catenin抑制劑后，細胞中成骨因子表達降低，成脂因子表達增加，說明外源性轉錄因子Foxc2促進BMSCs成骨分化過程中，可能與Wnt-β-catenin通路的激活有關。
綜上述，過表達Foxc2的BMSCs具有較高的細胞活性，Foxc2能促進BMSCs成骨分化，抑制其成脂分化。更重要的是，轉錄因子Foxc2介導的成骨分化可能激活了Wnt信號通路，Wnt-β-catenin途徑參與了轉染后BMSCs的成骨分化過程。
