引用本文： 劉浩, 芮永軍, 孫振中, 湯峰林, 丁濤. BMP-14聯合Noggin shRNA共轉染對脂肪來源干細胞成骨分化能力的影響. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(10): 1270-1275. doi: 10.7507/1002-1892.20160259 復制
骨缺損的修復一直是困擾臨床骨科醫師的難題之一。近年來，隨著細胞生物學研究的進展，以基因治療與骨組織工程相結合的方法修復骨缺損已得到國內外學者的廣泛認同，成為目前臨床上最有效、副作用最小的骨缺損修復方法[1]。1965年，Urist[2]發現了BMPs，其具有誘導成骨和成軟骨的能力，是目前認為誘導成骨能力最強的一類誘導因子。其中重組人BMP-2（recombinant human BMP-2，rhBMP-2）和rhBMP-7分別于2002年和2003年被美國食物藥品監督管理局（FDA）批準用于臨床[3]。除了這兩種BMPs外，人們仍在不斷尋找新的具有更強骨誘導活性的BMPs，從而為臨床修復骨缺損帶來新的希望，其中BMP-14是研究熱點之一。
BMP-14是Storm于1994年發現的一種生長因子，在肢體骨骼發育和關節形成中有著很重要的作用[4]。BMP-14基因自然突變的小鼠表現為嚴重的四肢畸形：長骨短縮、指（趾）骨扁平并伴有多關節融合，這提示了BMP-14在生物工程領域的治療作用。在研究BMPs的過程中，人們發現BMPs修飾的成骨分化被細胞外基質BMPs的抑制劑所調節，包括Noggin、Chordin、Gremlin和Follistatin[5]。其中Noggin是與BMPs最具親和力的一種蛋白，Noggin通過與細胞表面的BMPs受體相競爭，特異性地與BMPs結合，阻礙BMPs與其自身受體結合及下游區的信號傳導，從而拮抗BMPs的作用[6]。
迄今為止，國內外在骨組織工程領域的研究大多集中在某一種骨誘導因子上，如單獨使用BMP-2或BMP-7，其結果往往需要使用超生理劑量才能達到促進成骨及骨再生的要求。而對于兩種基因聯合轉染，既往研究通過將具有協同作用的促成骨基因同時過表達來發揮作用，比如BMP-2聯合VEGF或BMP-2聯合BMP-7，其結果顯著改善了干細胞成骨分化的速度和程度。據此我們猜想，若同時干預同一信號通路上的增強性基因BMP-14和抑制性基因Noggin（即沉默細胞中的抑制性基因、聯合增強性基因），理論上可以進一步提高干細胞的成骨分化能力，并有望發現一種超越現有骨誘導活性的成骨因子組合；同時還可以制成一種具有臨床應用價值及超強骨誘導活性，能促進骨愈合或脊柱融合的自體骨新材料，為臨床治療骨缺損帶來重大改變。故本實驗針對BMP-14和其拮抗劑Noggin的特點，分別構建慢病毒過表達載體及干擾載體，將兩種重組慢病毒共轉染大鼠脂肪來源干細胞（adipose derived stem cells，ADSCs），并檢測聯合作用下ADSCs的成骨分化能力，為基因治療骨缺損探索新的思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康成年雄性SD大鼠5只，體質量250～ 300 g，由無錫市人民醫院實驗動物中心提供。
Ⅰ型膠原酶、抗壞血酸、地塞米松、胰島素、茜素紅（Sigma公司，美國）；FBS（HyClone公司，美國）；β-甘油磷酸鈉、PCR引物（Invitrogen公司，美國）；Trizol、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo公司，美國）；SYBR Green PCR Master Mix（江蘇同科醫藥公司）；慢病毒表達質粒（北京英茂盛業生物科技有限公司）；BMP-14（A-10） 單克隆抗體、Noggin多克隆抗體、β-actin（Santa Cruz公司，美國）。293FT細胞株由本實驗室凍存。
CO2培養箱、低溫高速離心機（Thermo公司，美國）；超凈工作臺（蘇州凈化設備工程公司）；倒置熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；ABI7500實時熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司，美國）。
1.2 大鼠ADSCs的分離、培養
將SD大鼠斷頸處死后，在超凈工作臺中分離腹股溝脂肪組織，PBS清洗后剪成1 mm3左右小塊；轉移至5 mL離心管中，加入5倍體積的0.1% Ⅰ型膠原酶溶液，置入37℃恒溫振蕩箱中振蕩消化60～90 min；用含10%FBS的DMEM培養液等體積中和，以離心半徑15 cm、1 500 r/min離心10 min后棄上清；160 mmol/L NH4Cl裂解紅細胞10 min，以離心半徑15 cm、1 000 r/min離心10 min，棄上清。用含10%FBS的DMEM培養液重懸細胞并計數，按2×105個/瓶密度接種于35 cm2培養瓶內，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養。培養48 h后首次換液，去除未貼壁細胞，以PBS沖洗3次，之后每2～3 d換液1次，5～7 d細胞生長融合至80%～90%時，進行傳代培養。按雷蕙嘉等[7]的方法鑒定為ADSCs。
1.3 BMP-14、Noggin shRNA重組慢病毒的構建
1.3.1 大鼠BMP-14表達載體構建
收集大鼠ADSCs，抽提RNA，嚴格按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書進行體外反轉錄得到cDNA，以此作為模板，結合引物進行PCR擴增得到BMP-14產物，引物序列：BMP-14上游5'-ATGAGACTCCCCAAACTCCT-3'，下游5'-CTACCTACAGCCACAAGATTC-3'，產物片段1 488 bp；通過XbaⅠ/EcoRⅠ酶切位點將BMP-14克隆入過表達載體pLV-增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescence protein，EGFP）-Puro。酶切鑒定結果顯示1、2、3、4、6均成功插入目的片段BMP-14，證明成功獲得BMP-14過表達載體。見圖 1。后續實驗選用pLV-EGFP-Puro-BMP-14-1。
圖1
pLV-EGFP-Puro-BMP-14酶切鑒定圖譜 M：2 000 bp marker 1～8：pLV-BMP-14酶切產物 ? ?1.3.2 大鼠Noggin
shRNA干擾載體構建 根據小干擾RNA的設計原則，針對目的基因Noggin的序列，合成一對驗證有效的shRNA寡核苷酸序列：上游5'-CCGGGCCAGCACTATCTACACATCCCTCGAGGGATGTGTAGATAGTGCTGGCTTTTTG-3'，下游5'-AATTCAAAAAGCCAGCACTATCTACACA-TCCCTCGAGGGATGTGTAGATAGTGCTGGC-3'，經退火使其變為雙鏈。pLKO.1質粒AgeⅠ/EcoRⅠ雙酶切后將Noggin shRNA插入pLKO.1，連接轉化后進行測序鑒定。通過序列比對，確認序列與Gene Bank中的序列完全一致，載體構建成功。見圖 2。
1.3.3 病毒包裝
使用Lipofectamine 2000轉染試劑將慢病毒包裝輔助質粒PLP1、PLP2、PLP-VSVG混合物與構建的BMP-14、Noggin shRNA表達質粒共轉染至293FT細胞，轉染后48 h觀察轉染效率，收集培養上清進行濃縮，轉染后72 h再次收集濃縮。將上清以離心半徑15 cm、3 000 r/min離心15 min后，上清用0.45 μm濾器過濾以去除細胞碎片。由此包裝出攜帶BMP-14、Noggin shRNA的重組慢病毒（Lv-BMP-14、Lv-Noggin shRNA），分裝于-80℃冰箱凍存備用。Lv-EGFP已有備用凍存。
1.4 基因轉染及實驗分組
實驗分為3組，分別為對照組（A組，空載體病毒Lv-EGFP轉染ADSCs）、BMP-14組（B組，Lv-BMP-14轉染ADSCs）和BMP-14+Noggin shRNA組（C組，Lv-BMP-14+Lv-Noggin shRNA轉染ADSCs）。具體轉染方法：取狀態良好的第3代ADSCs，以3×105個 /孔密度鋪于6孔板，37℃培養過夜；轉染前從冰箱取出病毒在冰上緩慢融化，用含10%FBS的DMEM培養液準確稀釋慢病毒原液；吸去細胞原有培養基，加入1/2體積的已稀釋慢病毒液，輕輕“8”字混勻。37℃孵育4～6 h后更換新鮮培養液；48～72 h后倒置熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況，倒置相差顯微鏡觀察細胞生長情況并及時換液。
1.5 觀測指標
1.5.1 實時熒光定量PCR檢測相關基因表達
各組分別于轉染后3、7、14 d收集細胞，抽提RNA，反轉錄為cDNA，根據檢測基因的不同，使用 Primer Premier 5.0 軟件設計相應引物。引物序列：BMP-14上游5'-TGTCCGATGCTGACAGAAAG-3'，下游5'-TCCTTCTCCAAGGCACTGAT-3'；成骨相關基因Ⅰ型膠原上游5'-GTCTCAAGATGGTGGCCGTT-3'，下游5'-TCCGCTCTTCCAGTCAGAGT-3'；ALP上游5'-CAAGGACATCGCCTATCAG-3'，下游5'-CAGTGCGGTTCCAGACATA-3'；骨鈣素（osteocalcin ，OCN）上游5'-TCTGAAATACGGTAACCCG-3'，下游5'-GAGTTCTACAAGACAGCAGGC-3'。反應體系：SYBR Green Master mix（2×）10 μL，引物（10 μmol/ L）1 μL，模板（cDNA）1 μL，最后ddH2O補足至總體積20 μL；混勻后上機。反應條件：95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環。采用2-ΔΔCt法并以GAPDH為內參計算BMP-14及成骨相關基因Ⅰ型膠原、ALP、OCN mRNA相對表達量，根據BMP-14的mRNA相對表達量評估Noggin基因沉默的效率。
1.5.2 茜素紅染色觀察
轉染后14 d取3組細胞，PBS清洗后，95%乙醇固定10 min，0.1%茜素紅染液染色5 min，ddH2O清洗后，倒置相差顯微鏡觀察。
1.6 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示；組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 轉染效率觀察
轉染后48 h熒光倒置顯微鏡觀察示，各組ADSCs熒光陽性細胞比率均達90%以上；倒置相差顯微鏡觀察示各組細胞生長狀態良好。說明重組慢病毒轉染效率高，外源基因可有效表達。見圖 3、4。
2.2 實時熒光定量PCR檢測
2.2.1 Noggin基因沉默效率觀察
轉染后3 d，各組BMP-14 mRNA相對表達量比較差異無統計學意義（P＞0.05）。轉染后7、14 d，C組BMP-14 mRNA相對表達量高于A、B組，B組高于A組，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 1。
表1
實時熒光定量PCR檢測各組各時間點各基因mRNA相對表達量（n=9，x±s）
Table1.
Comparison of gene mRNA expression levels among groups at each time point by real time fluorescence quantitative PCR（n=9，x±s）
2.2.2 成骨相關基因表達
轉染后3 d，C組各基因mRNA相對表達量均顯著高于A、B組，差異有統計學意義（P＜0.05）；A、B組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。轉染后7、14 d，C組各基因mRNA相對表達量顯著高于A、B組，B組高于A組，除轉染后7 d A、B組間Ⅰ型膠原mRNA相對表達量比較差異無統計學意義（P＞0.05）外，其余各組間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 1。
2.3 茜素紅染色觀察
轉染后14 d 茜素紅染色示，A、B、C組鈣結節量呈遞增趨勢（圖 5）。
3 討論
近年來，由于創傷、先天畸形、腫瘤等原因引起的骨缺損在臨床上越來越多見，大面積骨缺損的修復是臨床治療中的一大難題。治療骨缺損最常用方法是自體骨移植及同種異體骨移植。但自體骨移植存在供區骨量不足、供區損傷、延長手術時間及增加手術風險等問題，同種異體骨移植可能會引起機體排斥反應、疾病傳播和骨不連等術后并發癥，使得這兩種方法在臨床應用受限[8-10]。目前，組織工程技術聯合轉基因治療的開展可改進上述弊端，成為解決這一難題的有效方法[11]。
組織工程技術的三大要素是種子細胞、誘導因子、支架材料，其中種子細胞的獲得、培養與分化是組織工程的前提和基礎[12]。隨著組織工程學研究的進展，目前已證實種子細胞的來源多種多樣，包括骨、骨膜、骨髓、骨外組織、早期胚胎等，各種來源均有其優缺點。Zuk等[13]首次提出了ADSCs，因其具有取材方便、生長增殖能力強以及多向分化潛能等優點而受到廣泛關注，成為目前種子細胞的研究熱點。故本實驗選擇大鼠ADSCs作為研究細胞。
骨誘導因子是一種蛋白質或多肽，具有促進MSCs生長、增殖、成骨分化和基質合成等作用，在骨組織工程中具有重要作用[14]。BMPs屬于TGF-β超家族成員，部分成員具有誘導成骨和成軟骨的能力，其作用于未分化的MSCs，能跨種屬誘導成骨。除了已在臨床應用的BMP-2和BMP-7外，研究人員仍在積極探索其他更具成骨活性的BMPs。前期研究發現，BMP-14可能同樣具有良好的骨誘導潛力，引起了學者們的廣泛關注。體外實驗證明BMP-14能誘導MSCs向軟骨細胞方向分化[15]；同時，BMP-14能誘導多能間充質細胞[16]、ADSCs[17]、BMSCs[18]和骨膜細胞[19]等多種細胞向成骨細胞分化。BMP-14在誘導軟骨分化過程中發揮的重要作用已被廣泛接受，但其促進成骨誘導的作用卻鮮有報道。因此，本實驗選擇BMP-14作為骨誘導因子作進一步研究。根據實驗結果，B組成骨相關基因mRNA相對表達量高于A組，我們初步認為BMP-14能夠誘導大鼠ADSCs向成骨細胞分化，而BMP-14的成骨誘導水平究竟如何還有待更多研究明確。
在研究BMPs的過程中，人們發現了包括Noggin、Chordin、Gremlin等在內的BMP拮抗劑。在眾多可下調BMP信號的細胞外拮抗劑中，Noggin是與 BMPs最具親和力的一種蛋白。本實驗通過構建有效的慢病毒干擾載體（Lv-Noggin shRNA），聯合Lv-BMP-14共轉染大鼠ADSCs，結果發現聯合轉染組BMP-14 mRNA相對表達量明顯高于BMP-14單獨轉染組，表明Lv-Noggin shRNA成功干擾了Noggin基因。
若是單純將細胞因子使用于機體內，往往會因機體的降解、稀釋作用及其半衰期過短等因素而很難有效發揮作用[20]。所以我們采用了轉基因治療，即利用載體將目的基因轉運到細胞內，使細胞表達并產生蛋白[21]。這樣不僅克服了外源性蛋白價格昂貴和效果不理想等缺點，還能夠更強地促進骨形成[22]。本實驗選擇使用的慢病毒載體成功將目的基因運載到細胞中，轉染后ADSCs熒光陽性細胞比率均高達90%以上，且細胞生長狀態良好，外源基因得到了有效表達。
單獨使用一種BMP，往往需要使用超生理劑量才能達到促進成骨的要求[23]。而聯合轉染多種基因不僅可產生協同作用，更將顯著縮短轉染所需時間及減少誘導因子所需劑量[24-26]。本實驗根據“基因強化組織工程”的原理，利用慢病毒載體分別將兩種目的基因（BMP-14、Noggin shRNA）同時轉運至大鼠ADSCs，從正向、反向兩個方面同時干預，結果極大地提高了干細胞的成骨分化能力。
根據本實驗結果可以發現，應用轉基因干細胞治療骨缺損擁有巨大潛力。我們驗證了同時干預增強性和抑制性基因的可行性和優越性，并且評估了大鼠ADSCs的轉基因效果和體外成骨分化能力。這為基因治療骨缺損探索出一種新的思路，同時為以后研究其他誘導因子聯合轉染提供了實驗參考。但體內環境下的骨修復過程比體外復雜得多，其受到多方面因素的影響，還有待進一步深入研究。
骨缺損的修復一直是困擾臨床骨科醫師的難題之一。近年來，隨著細胞生物學研究的進展，以基因治療與骨組織工程相結合的方法修復骨缺損已得到國內外學者的廣泛認同，成為目前臨床上最有效、副作用最小的骨缺損修復方法[1]。1965年，Urist[2]發現了BMPs，其具有誘導成骨和成軟骨的能力，是目前認為誘導成骨能力最強的一類誘導因子。其中重組人BMP-2（recombinant human BMP-2，rhBMP-2）和rhBMP-7分別于2002年和2003年被美國食物藥品監督管理局（FDA）批準用于臨床[3]。除了這兩種BMPs外，人們仍在不斷尋找新的具有更強骨誘導活性的BMPs，從而為臨床修復骨缺損帶來新的希望，其中BMP-14是研究熱點之一。
BMP-14是Storm于1994年發現的一種生長因子，在肢體骨骼發育和關節形成中有著很重要的作用[4]。BMP-14基因自然突變的小鼠表現為嚴重的四肢畸形：長骨短縮、指（趾）骨扁平并伴有多關節融合，這提示了BMP-14在生物工程領域的治療作用。在研究BMPs的過程中，人們發現BMPs修飾的成骨分化被細胞外基質BMPs的抑制劑所調節，包括Noggin、Chordin、Gremlin和Follistatin[5]。其中Noggin是與BMPs最具親和力的一種蛋白，Noggin通過與細胞表面的BMPs受體相競爭，特異性地與BMPs結合，阻礙BMPs與其自身受體結合及下游區的信號傳導，從而拮抗BMPs的作用[6]。
迄今為止，國內外在骨組織工程領域的研究大多集中在某一種骨誘導因子上，如單獨使用BMP-2或BMP-7，其結果往往需要使用超生理劑量才能達到促進成骨及骨再生的要求。而對于兩種基因聯合轉染，既往研究通過將具有協同作用的促成骨基因同時過表達來發揮作用，比如BMP-2聯合VEGF或BMP-2聯合BMP-7，其結果顯著改善了干細胞成骨分化的速度和程度。據此我們猜想，若同時干預同一信號通路上的增強性基因BMP-14和抑制性基因Noggin（即沉默細胞中的抑制性基因、聯合增強性基因），理論上可以進一步提高干細胞的成骨分化能力，并有望發現一種超越現有骨誘導活性的成骨因子組合；同時還可以制成一種具有臨床應用價值及超強骨誘導活性，能促進骨愈合或脊柱融合的自體骨新材料，為臨床治療骨缺損帶來重大改變。故本實驗針對BMP-14和其拮抗劑Noggin的特點，分別構建慢病毒過表達載體及干擾載體，將兩種重組慢病毒共轉染大鼠脂肪來源干細胞（adipose derived stem cells，ADSCs），并檢測聯合作用下ADSCs的成骨分化能力，為基因治療骨缺損探索新的思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康成年雄性SD大鼠5只，體質量250～ 300 g，由無錫市人民醫院實驗動物中心提供。
Ⅰ型膠原酶、抗壞血酸、地塞米松、胰島素、茜素紅（Sigma公司，美國）；FBS（HyClone公司，美國）；β-甘油磷酸鈉、PCR引物（Invitrogen公司，美國）；Trizol、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo公司，美國）；SYBR Green PCR Master Mix（江蘇同科醫藥公司）；慢病毒表達質粒（北京英茂盛業生物科技有限公司）；BMP-14（A-10） 單克隆抗體、Noggin多克隆抗體、β-actin（Santa Cruz公司，美國）。293FT細胞株由本實驗室凍存。
CO2培養箱、低溫高速離心機（Thermo公司，美國）；超凈工作臺（蘇州凈化設備工程公司）；倒置熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；ABI7500實時熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司，美國）。
1.2 大鼠ADSCs的分離、培養
將SD大鼠斷頸處死后，在超凈工作臺中分離腹股溝脂肪組織，PBS清洗后剪成1 mm3左右小塊；轉移至5 mL離心管中，加入5倍體積的0.1% Ⅰ型膠原酶溶液，置入37℃恒溫振蕩箱中振蕩消化60～90 min；用含10%FBS的DMEM培養液等體積中和，以離心半徑15 cm、1 500 r/min離心10 min后棄上清；160 mmol/L NH4Cl裂解紅細胞10 min，以離心半徑15 cm、1 000 r/min離心10 min，棄上清。用含10%FBS的DMEM培養液重懸細胞并計數，按2×105個/瓶密度接種于35 cm2培養瓶內，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養。培養48 h后首次換液，去除未貼壁細胞，以PBS沖洗3次，之后每2～3 d換液1次，5～7 d細胞生長融合至80%～90%時，進行傳代培養。按雷蕙嘉等[7]的方法鑒定為ADSCs。
1.3 BMP-14、Noggin shRNA重組慢病毒的構建
1.3.1 大鼠BMP-14表達載體構建
收集大鼠ADSCs，抽提RNA，嚴格按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書進行體外反轉錄得到cDNA，以此作為模板，結合引物進行PCR擴增得到BMP-14產物，引物序列：BMP-14上游5'-ATGAGACTCCCCAAACTCCT-3'，下游5'-CTACCTACAGCCACAAGATTC-3'，產物片段1 488 bp；通過XbaⅠ/EcoRⅠ酶切位點將BMP-14克隆入過表達載體pLV-增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescence protein，EGFP）-Puro。酶切鑒定結果顯示1、2、3、4、6均成功插入目的片段BMP-14，證明成功獲得BMP-14過表達載體。見圖 1。后續實驗選用pLV-EGFP-Puro-BMP-14-1。
圖1
pLV-EGFP-Puro-BMP-14酶切鑒定圖譜 M：2 000 bp marker 1～8：pLV-BMP-14酶切產物 ? ?1.3.2 大鼠Noggin
shRNA干擾載體構建 根據小干擾RNA的設計原則，針對目的基因Noggin的序列，合成一對驗證有效的shRNA寡核苷酸序列：上游5'-CCGGGCCAGCACTATCTACACATCCCTCGAGGGATGTGTAGATAGTGCTGGCTTTTTG-3'，下游5'-AATTCAAAAAGCCAGCACTATCTACACA-TCCCTCGAGGGATGTGTAGATAGTGCTGGC-3'，經退火使其變為雙鏈。pLKO.1質粒AgeⅠ/EcoRⅠ雙酶切后將Noggin shRNA插入pLKO.1，連接轉化后進行測序鑒定。通過序列比對，確認序列與Gene Bank中的序列完全一致，載體構建成功。見圖 2。
1.3.3 病毒包裝
使用Lipofectamine 2000轉染試劑將慢病毒包裝輔助質粒PLP1、PLP2、PLP-VSVG混合物與構建的BMP-14、Noggin shRNA表達質粒共轉染至293FT細胞，轉染后48 h觀察轉染效率，收集培養上清進行濃縮，轉染后72 h再次收集濃縮。將上清以離心半徑15 cm、3 000 r/min離心15 min后，上清用0.45 μm濾器過濾以去除細胞碎片。由此包裝出攜帶BMP-14、Noggin shRNA的重組慢病毒（Lv-BMP-14、Lv-Noggin shRNA），分裝于-80℃冰箱凍存備用。Lv-EGFP已有備用凍存。
1.4 基因轉染及實驗分組
實驗分為3組，分別為對照組（A組，空載體病毒Lv-EGFP轉染ADSCs）、BMP-14組（B組，Lv-BMP-14轉染ADSCs）和BMP-14+Noggin shRNA組（C組，Lv-BMP-14+Lv-Noggin shRNA轉染ADSCs）。具體轉染方法：取狀態良好的第3代ADSCs，以3×105個 /孔密度鋪于6孔板，37℃培養過夜；轉染前從冰箱取出病毒在冰上緩慢融化，用含10%FBS的DMEM培養液準確稀釋慢病毒原液；吸去細胞原有培養基，加入1/2體積的已稀釋慢病毒液，輕輕“8”字混勻。37℃孵育4～6 h后更換新鮮培養液；48～72 h后倒置熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況，倒置相差顯微鏡觀察細胞生長情況并及時換液。
1.5 觀測指標
1.5.1 實時熒光定量PCR檢測相關基因表達
各組分別于轉染后3、7、14 d收集細胞，抽提RNA，反轉錄為cDNA，根據檢測基因的不同，使用 Primer Premier 5.0 軟件設計相應引物。引物序列：BMP-14上游5'-TGTCCGATGCTGACAGAAAG-3'，下游5'-TCCTTCTCCAAGGCACTGAT-3'；成骨相關基因Ⅰ型膠原上游5'-GTCTCAAGATGGTGGCCGTT-3'，下游5'-TCCGCTCTTCCAGTCAGAGT-3'；ALP上游5'-CAAGGACATCGCCTATCAG-3'，下游5'-CAGTGCGGTTCCAGACATA-3'；骨鈣素（osteocalcin ，OCN）上游5'-TCTGAAATACGGTAACCCG-3'，下游5'-GAGTTCTACAAGACAGCAGGC-3'。反應體系：SYBR Green Master mix（2×）10 μL，引物（10 μmol/ L）1 μL，模板（cDNA）1 μL，最后ddH2O補足至總體積20 μL；混勻后上機。反應條件：95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環。采用2-ΔΔCt法并以GAPDH為內參計算BMP-14及成骨相關基因Ⅰ型膠原、ALP、OCN mRNA相對表達量，根據BMP-14的mRNA相對表達量評估Noggin基因沉默的效率。
1.5.2 茜素紅染色觀察
轉染后14 d取3組細胞，PBS清洗后，95%乙醇固定10 min，0.1%茜素紅染液染色5 min，ddH2O清洗后，倒置相差顯微鏡觀察。
1.6 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示；組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 轉染效率觀察
轉染后48 h熒光倒置顯微鏡觀察示，各組ADSCs熒光陽性細胞比率均達90%以上；倒置相差顯微鏡觀察示各組細胞生長狀態良好。說明重組慢病毒轉染效率高，外源基因可有效表達。見圖 3、4。
2.2 實時熒光定量PCR檢測
2.2.1 Noggin基因沉默效率觀察
轉染后3 d，各組BMP-14 mRNA相對表達量比較差異無統計學意義（P＞0.05）。轉染后7、14 d，C組BMP-14 mRNA相對表達量高于A、B組，B組高于A組，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 1。
表1
實時熒光定量PCR檢測各組各時間點各基因mRNA相對表達量（n=9，x±s）
Table1.
Comparison of gene mRNA expression levels among groups at each time point by real time fluorescence quantitative PCR（n=9，x±s）
2.2.2 成骨相關基因表達
轉染后3 d，C組各基因mRNA相對表達量均顯著高于A、B組，差異有統計學意義（P＜0.05）；A、B組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。轉染后7、14 d，C組各基因mRNA相對表達量顯著高于A、B組，B組高于A組，除轉染后7 d A、B組間Ⅰ型膠原mRNA相對表達量比較差異無統計學意義（P＞0.05）外，其余各組間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 1。
2.3 茜素紅染色觀察
轉染后14 d 茜素紅染色示，A、B、C組鈣結節量呈遞增趨勢（圖 5）。
3 討論
近年來，由于創傷、先天畸形、腫瘤等原因引起的骨缺損在臨床上越來越多見，大面積骨缺損的修復是臨床治療中的一大難題。治療骨缺損最常用方法是自體骨移植及同種異體骨移植。但自體骨移植存在供區骨量不足、供區損傷、延長手術時間及增加手術風險等問題，同種異體骨移植可能會引起機體排斥反應、疾病傳播和骨不連等術后并發癥，使得這兩種方法在臨床應用受限[8-10]。目前，組織工程技術聯合轉基因治療的開展可改進上述弊端，成為解決這一難題的有效方法[11]。
組織工程技術的三大要素是種子細胞、誘導因子、支架材料，其中種子細胞的獲得、培養與分化是組織工程的前提和基礎[12]。隨著組織工程學研究的進展，目前已證實種子細胞的來源多種多樣，包括骨、骨膜、骨髓、骨外組織、早期胚胎等，各種來源均有其優缺點。Zuk等[13]首次提出了ADSCs，因其具有取材方便、生長增殖能力強以及多向分化潛能等優點而受到廣泛關注，成為目前種子細胞的研究熱點。故本實驗選擇大鼠ADSCs作為研究細胞。
骨誘導因子是一種蛋白質或多肽，具有促進MSCs生長、增殖、成骨分化和基質合成等作用，在骨組織工程中具有重要作用[14]。BMPs屬于TGF-β超家族成員，部分成員具有誘導成骨和成軟骨的能力，其作用于未分化的MSCs，能跨種屬誘導成骨。除了已在臨床應用的BMP-2和BMP-7外，研究人員仍在積極探索其他更具成骨活性的BMPs。前期研究發現，BMP-14可能同樣具有良好的骨誘導潛力，引起了學者們的廣泛關注。體外實驗證明BMP-14能誘導MSCs向軟骨細胞方向分化[15]；同時，BMP-14能誘導多能間充質細胞[16]、ADSCs[17]、BMSCs[18]和骨膜細胞[19]等多種細胞向成骨細胞分化。BMP-14在誘導軟骨分化過程中發揮的重要作用已被廣泛接受，但其促進成骨誘導的作用卻鮮有報道。因此，本實驗選擇BMP-14作為骨誘導因子作進一步研究。根據實驗結果，B組成骨相關基因mRNA相對表達量高于A組，我們初步認為BMP-14能夠誘導大鼠ADSCs向成骨細胞分化，而BMP-14的成骨誘導水平究竟如何還有待更多研究明確。
在研究BMPs的過程中，人們發現了包括Noggin、Chordin、Gremlin等在內的BMP拮抗劑。在眾多可下調BMP信號的細胞外拮抗劑中，Noggin是與 BMPs最具親和力的一種蛋白。本實驗通過構建有效的慢病毒干擾載體（Lv-Noggin shRNA），聯合Lv-BMP-14共轉染大鼠ADSCs，結果發現聯合轉染組BMP-14 mRNA相對表達量明顯高于BMP-14單獨轉染組，表明Lv-Noggin shRNA成功干擾了Noggin基因。
若是單純將細胞因子使用于機體內，往往會因機體的降解、稀釋作用及其半衰期過短等因素而很難有效發揮作用[20]。所以我們采用了轉基因治療，即利用載體將目的基因轉運到細胞內，使細胞表達并產生蛋白[21]。這樣不僅克服了外源性蛋白價格昂貴和效果不理想等缺點，還能夠更強地促進骨形成[22]。本實驗選擇使用的慢病毒載體成功將目的基因運載到細胞中，轉染后ADSCs熒光陽性細胞比率均高達90%以上，且細胞生長狀態良好，外源基因得到了有效表達。
單獨使用一種BMP，往往需要使用超生理劑量才能達到促進成骨的要求[23]。而聯合轉染多種基因不僅可產生協同作用，更將顯著縮短轉染所需時間及減少誘導因子所需劑量[24-26]。本實驗根據“基因強化組織工程”的原理，利用慢病毒載體分別將兩種目的基因（BMP-14、Noggin shRNA）同時轉運至大鼠ADSCs，從正向、反向兩個方面同時干預，結果極大地提高了干細胞的成骨分化能力。
根據本實驗結果可以發現，應用轉基因干細胞治療骨缺損擁有巨大潛力。我們驗證了同時干預增強性和抑制性基因的可行性和優越性，并且評估了大鼠ADSCs的轉基因效果和體外成骨分化能力。這為基因治療骨缺損探索出一種新的思路，同時為以后研究其他誘導因子聯合轉染提供了實驗參考。但體內環境下的骨修復過程比體外復雜得多，其受到多方面因素的影響，還有待進一步深入研究。
