引用本文： 李國棟, 徐永清, 何曉清, 楊帆, 陳德偉, 羅浩天, 楊曦. Tempol對大鼠任意皮瓣成活影響的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(10): 1264-1269. doi: 10.7507/1002-1892.20160258 復制
大面積皮膚、軟組織缺損伴骨骼、肌腱、血管和神經外露時，單純縫合常不能覆蓋創面，植皮修復存在缺乏血供、成活困難的問題，故臨床多選擇鄰近超長任意皮瓣（long random pattern skin flap，LRPSF）移植修復。在皮瓣移植過程中，會伴有不同程度氧化應激損傷及各種炎性反應，影響皮瓣血管生成，引起部分組織細胞壞死，降低皮瓣成活率[1]。
Tempol是近年發現的一種新型硝基氧化還原劑，其為4-羥基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧自由基，能通過促進活性氧簇代謝，降低組織活性氧簇含量，并增加NO的生物利用度[2]。與其他氧自由基清除劑相比，Tempol具有以下優點：第一，抗氧化應激作用強，Tempol對線粒體氧化應激損傷具有較強的保護效應。 Zhu等[3]發現在心肌缺血再灌注損傷過程中Tempol能維持線粒體功能，降低氧化應激并提高組織氧供，減輕缺血再灌注損傷。此外，Tempol能通過抗氧化應激及抗炎作用促進脊髓損傷患者血管新生和脊髓再生[4]。第二，作為小分子藥物，Tempol滲透能力強，口服后迅速分布于線粒體周圍。第三，Tempol毒性很小，治療劑量幾乎無毒性[5]。
本實驗通過制備大鼠LRPSF模型并腹腔注射Tempol，采用Micro-CT成像觀察皮瓣血管形態，分析新生血管參數變化；免疫組織化學染色觀察VEGF變化，HE染色觀察炎性反應，并檢測LRPSF中氧化應激標志物超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA），以及炎性因子IL-6和TNF-α水平。分析研究Tempol對LRPSF成活及血管生成的影響，為臨床有效應用皮瓣、減輕皮瓣壞死提供新思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
成年雄性SD大鼠84只，體質量（300±20）g，由第三軍醫大學實驗動物中心提供。
Tempol、明膠（Sigma公司，美國）；多聚甲醛、水合氯醛、紅色氧化鉛（上海生工生物工程有限公司）；蘇木素染色液、伊紅染色液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；VEGF抗體（Santa Cruz公司，美國）；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司）；SOD、MDA試劑盒（南京建成生物技術公司）；TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒（伊萊瑞特生物科技有限公司）。
Nikon eclipce 50 正置顯微鏡（Nikon公司，日本）；Micro-CT、3D-Viewer v2.2軟件（Quantum FX. PE公司，美國）；Image J 2x軟件（National Institutes of Health，美國）；MATLAB 2012b軟件（MathWorks公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
將84只大鼠隨機分為Tempol組及對照組，每組42只。兩組參照Mcfarlane皮瓣模型[6]方法制備大鼠LRPSF模型。用10%水合氯醛（100 mg/kg）腹腔注射麻醉后，以大鼠背部正中線為中心，上至肩頸交界處，下至髂腰交界處，以尾端為蒂，切取面積為9 cm×3 cm的LRPSF。Tempol組：術前15 min及術后7 d內每天腹腔注射Tempol（100 mg/ kg）[4]；對照組：同時間點腹腔注射相同體積生理鹽水。術后大鼠單籠飼養，常規進食水，自然光照射，室溫控制在23℃左右。
1.3 觀測指標
1.3.1 皮瓣成活率檢測
術后觀察各組大鼠成活以及皮瓣成活情況。術后第7天注射后30 min，各組隨機取6只大鼠過量麻醉處死，背部皮瓣照相，采用Image J 2x軟件測量皮瓣成活面積，按以下公式計算皮瓣成活率：皮瓣成活面積/皮瓣總面積×100%。每只大鼠測量2次，取均值。
1.3.2 Micro-CT血管成像
術后第7天注射后30 min各組隨機取6只大鼠，行Micro-CT掃描。大鼠同上法麻醉后，暴露胸腔及心臟，于左心室插管至主動脈，見回血插管成功后，剪開右心耳，生理鹽水置換大鼠全身血液，4%多聚甲醛灌注固定血管，然后用1 g/mL明膠氧化鉛[7]（預熱至40℃）灌注大鼠全身血管，將整只大鼠置于4℃冰箱保存24 h，拆除縫線，剪下皮瓣，行Micro-CT掃描；將所得圖像在3D-Viewer v2.2軟件中進行3D重建，利用MATLAB 2012b軟件將重建所得圖像進行分析、編程，計算皮瓣處血管容積和血管總長度。
1.3.3 組織學及免疫組織化學染色觀察
術后第7 天注射后30 min各組隨機取6只大鼠過量麻醉處死。于皮瓣中部剪取面積為3 cm×1 cm的組織，置于多聚甲醛固定后行5 μm厚冰凍切片，分別行HE染色及VEGF免疫組織化學染色，鏡下觀察皮瓣組織結構層次、炎性浸潤程度和VEGF表達情況。
1.3.4 SOD、MDA及組織炎性因子測定
于術后即刻及第1、3、7天注射后30 min各組隨機取6只大鼠過量麻醉處死，于皮瓣中部剪取面積為3 cm×1 cm的組織，立即置于液氮中進行組織勻漿，利用水溶性四氮唑-1法法及可見光法，測量組織SOD和MDA含量；利用ELISA法測量組織勻漿TNF-α和IL-6含 量。
1.4 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 皮瓣成活率檢測
術后各組大鼠均存活至實驗完成，無積血、積液和感染等發生。大體觀察示，術后第1天，兩組皮瓣未見明顯壞死，皮瓣略蒼白，部分皮瓣遠端青紫；第3天，兩組皮瓣遠端出現不同程度壞死，壞死界限不清，但Tempol組壞死較輕；第7天，兩組皮瓣壞死面積較第3天時擴大，皮瓣遠端皺縮，壞死界限明確，Tempol組皮瓣遠端壞死、皺縮程度以及皮瓣水腫程度均輕于對照組。見圖 1。術后第7天Tempol組皮瓣成活率為79.53%±4.55%，顯著高于對照組的59.24%±4.23%，比較差異有統計學意義（t=7.960，P=0.000）。
圖1
術后第7天兩組皮瓣大體觀察 箭頭示皮瓣缺血壞死部位 ? 對照組 ? Tempol組 ? ?2.2 Micro-CT血管成像觀察
術后第7天，Tempol組皮瓣遠端有大量新生血管形成，血管分布及血管連續性均優于對照組（圖 2）。對照組血管容積為（1 005.747± 183.246） mm3，Tempol組為（2 129.019±579.623） mm3；對照組血管總長度為（151.20±12.19） mm，Tempol組為（294.10±19.46） mm。Tempol組血管容積、血管總長度均高于對照組，比較差異有統計學意義（t=4.526，P=0.001；t=6.222，P=0.001）。
2.3 組織學觀察
術后第7天，對照組可見皮膚各層組織結構層次不清、明顯組織炎性反應及炎性細胞浸潤；Tempol組可見皮膚各層組織結構層次尚清楚，組織炎性反應及炎性細胞浸潤較輕。見圖 3。
2.4 免疫組織化學染色觀察
術后第7天，兩組VEGF主要表達于皮瓣組織真皮層內血管周圍與基質細胞內，其中Tempol組VEGF蛋白染色明顯深于對照組。見圖 4。
2.5 SOD、MDA及炎性因子含量測定
術后即刻兩組SOD、MDA以及TNF-α、IL-6含量比較，差異均無統計學意義（P＜0.05）；術后第1、3、7天，Tempol組SOD含量明顯高于對照組，MDA及TNF-α、IL-6含量明顯低于對照組，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 5。
3 討論
LRPSF具有隨意性、靈活性、使用方便等特點，可在身體任何部位、任何方向獲得，已廣泛應用于整形外科手術中。但是，當皮瓣長寬比例大于2∶1時，皮瓣遠端容易發生較嚴重的缺血壞死，導致手術失敗[8]。因此，降低LRPSF遠端壞死有利于提高皮瓣成活率，降低二次手術風險，減少圍手術期并發 癥。
本研究采用大鼠LRPSF模型，皮瓣長寬比例為3∶1，該模型啃食率低，便于觀察，適用于皮瓣成活的干預研究[9]。明膠氧化鉛灌注結合Micro-CT能對感興趣血管體區進行掃描，可在不破壞標本的情況下了解樣本內部顯微結構，實現血管三維重建和有關血管參數計算；與大體巨微解剖對比，Micro-CT能夠從三維角度顯示穿支血管的分布和走行，以及穿支血管體區間相互連接，可清晰顯示大鼠背部穿支血管三維形態，是研究LRPSF血管生成的可靠方法[10]。為此，我們選擇該方法觀察術后皮瓣血管形成情況。
研究發現，氧化應激損傷、皮瓣缺血和炎性反應是影響皮瓣成活的重要原因[11-13]。Tempol是一種可自由通過細胞膜的氧自由基清除劑，具有很強的抗氧化應激作用，能夠提高組織細胞中抗氧化酶活性、保護線粒體、降低脂質過氧化物和自由基含量，明顯減輕組織和細胞氧化應激損傷[14]。本研究結果表明，Tempol能改善LRPSF缺血再灌注損傷，提高皮瓣成活率，分析其作用機制包括以下三方面。
第一，Tempol能顯著減少大鼠皮瓣壞死面積，表明Tempol具有降低遠端皮瓣壞死的作用。缺血是皮瓣發生壞死的重要原因，VEGF是促進血管生成最重要的因子之一，它是通過促進血管內皮細胞增殖與再生，促進血管生成[15-16]。血管容積和血管總長度分別表示相同面積皮瓣區域內進入血管的造影劑量及各血管長度總和，很大程度上反映了血管的生成。本研究結果表明Tempol能夠提高皮瓣組織中VEGF的表達，增加血管容積和總血管長度，改善皮瓣血供環境。
第二，減輕隨意皮瓣缺血再灌注損傷是提高隨意皮瓣成活率的關鍵，缺血再灌注損傷是一個復雜的病理生理過程，包括組織缺血、炎性反應、氧自由基損傷等[1, 10-13]，既往研究發現天然水蛭素通過改善大鼠背部任意皮瓣缺血程度，促進隨意皮瓣早期斷蒂并成活[10]；此外，黑大豆皮中的花青素也可通過減輕炎性反應，進而有效減少缺血再灌注損傷[11]。氧化應激一直被認為是皮瓣缺血再灌注損傷的關鍵，Zhou等[9]研究發現，在皮瓣缺血再灌注損傷模型中，骨化三醇通過提高SOD、降低MDA含量，發揮抗氧化應激作用，進而提高皮瓣成活率，但骨化三醇存在抗氧化作用較弱、結構不穩定、半衰期短等缺陷。與之相比，Tempol具有以下優勢：① 抗氧化作用強于骨化三醇，可有效清除氧自由基，明顯減輕氧化應激反應；② 可自由通過細胞膜屏障，并在線粒體周圍有效聚集，空間上有利于對抗線粒體依賴的氧化應激途徑；③ 配制方法簡便，易溶于水，給藥方便，可口服、腹腔注射、鼠尾靜脈注射等。氧化應激反應會釋放大量氧自由基，這些氧自由基與組織細胞表面的脂質、蛋白質結合發生反應，產生大量脂質過氧化物產物，引發組織、細胞發生氧化反應，引起組織、細胞損傷甚至凋亡、壞死[17]。SOD是體內最重要的抗氧化應激酶之一，SOD通過清除超氧陰離子自由基（O2-），將有害的超氧自由基轉換成過氧化氫，經體內過氧化物酶分解，轉變成水，保護細胞免受損傷[18]；MDA是經典的體內脂質過氧化損傷終產物，能夠反映組織受氧化應激損傷的程度，與細胞損傷程度密切相關，同時還可間接反映機體氧自由基的量[19]。本研究結果顯示，Tempol組LRPSF組織中SOD含量提高，同時MDA含量降低，表明Tempol能夠明顯降低大鼠皮瓣組織細胞氧化應激損傷，其機制與減輕皮瓣組織脂質過氧化損傷、清除氧自由基和增強抗氧化酶活力，促進皮瓣組織啟動抗氧化機制，發揮抗氧化作用有關。
第三，LRPSF移植后炎性反應造成皮瓣組織真皮層發生凝固性壞死，炎性反應越嚴重，皮瓣組織發生凝固性壞死的程度也越嚴重，因此炎性反應在皮瓣成活中發揮重要作用；適當的炎性反應有利于皮瓣組織愈合，而過重的炎性反應將嚴重影響皮瓣成活，減輕加重的炎性反應，能夠促進皮瓣組織、切口愈合[20]。TNF-α和IL-6均是體內最重要的炎性因子之一，與炎性反應啟動，炎性介質釋放，炎性細胞趨化、聚集、浸潤，炎性反應擴大各個環節密切相關[21]。我們發現給予Tempol后，皮瓣組織TNF-α、IL-6和炎性細胞浸潤程度顯著降低，表明Tempol能夠減輕皮瓣損傷過程中的炎性反應。
綜上述，氧自由基清除劑Tempol能夠提高大鼠LRRSF成活率和促進血管生成，其機制與增加VEGF表達量，降低氧化應激損傷和炎性反應有關。本研究進一步豐富了LRPSF成活理論，為臨床減輕LRPSF遠端壞死提供了新思路。
大面積皮膚、軟組織缺損伴骨骼、肌腱、血管和神經外露時，單純縫合常不能覆蓋創面，植皮修復存在缺乏血供、成活困難的問題，故臨床多選擇鄰近超長任意皮瓣（long random pattern skin flap，LRPSF）移植修復。在皮瓣移植過程中，會伴有不同程度氧化應激損傷及各種炎性反應，影響皮瓣血管生成，引起部分組織細胞壞死，降低皮瓣成活率[1]。
Tempol是近年發現的一種新型硝基氧化還原劑，其為4-羥基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧自由基，能通過促進活性氧簇代謝，降低組織活性氧簇含量，并增加NO的生物利用度[2]。與其他氧自由基清除劑相比，Tempol具有以下優點：第一，抗氧化應激作用強，Tempol對線粒體氧化應激損傷具有較強的保護效應。 Zhu等[3]發現在心肌缺血再灌注損傷過程中Tempol能維持線粒體功能，降低氧化應激并提高組織氧供，減輕缺血再灌注損傷。此外，Tempol能通過抗氧化應激及抗炎作用促進脊髓損傷患者血管新生和脊髓再生[4]。第二，作為小分子藥物，Tempol滲透能力強，口服后迅速分布于線粒體周圍。第三，Tempol毒性很小，治療劑量幾乎無毒性[5]。
本實驗通過制備大鼠LRPSF模型并腹腔注射Tempol，采用Micro-CT成像觀察皮瓣血管形態，分析新生血管參數變化；免疫組織化學染色觀察VEGF變化，HE染色觀察炎性反應，并檢測LRPSF中氧化應激標志物超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA），以及炎性因子IL-6和TNF-α水平。分析研究Tempol對LRPSF成活及血管生成的影響，為臨床有效應用皮瓣、減輕皮瓣壞死提供新思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
成年雄性SD大鼠84只，體質量（300±20）g，由第三軍醫大學實驗動物中心提供。
Tempol、明膠（Sigma公司，美國）；多聚甲醛、水合氯醛、紅色氧化鉛（上海生工生物工程有限公司）；蘇木素染色液、伊紅染色液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；VEGF抗體（Santa Cruz公司，美國）；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司）；SOD、MDA試劑盒（南京建成生物技術公司）；TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒（伊萊瑞特生物科技有限公司）。
Nikon eclipce 50 正置顯微鏡（Nikon公司，日本）；Micro-CT、3D-Viewer v2.2軟件（Quantum FX. PE公司，美國）；Image J 2x軟件（National Institutes of Health，美國）；MATLAB 2012b軟件（MathWorks公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
將84只大鼠隨機分為Tempol組及對照組，每組42只。兩組參照Mcfarlane皮瓣模型[6]方法制備大鼠LRPSF模型。用10%水合氯醛（100 mg/kg）腹腔注射麻醉后，以大鼠背部正中線為中心，上至肩頸交界處，下至髂腰交界處，以尾端為蒂，切取面積為9 cm×3 cm的LRPSF。Tempol組：術前15 min及術后7 d內每天腹腔注射Tempol（100 mg/ kg）[4]；對照組：同時間點腹腔注射相同體積生理鹽水。術后大鼠單籠飼養，常規進食水，自然光照射，室溫控制在23℃左右。
1.3 觀測指標
1.3.1 皮瓣成活率檢測
術后觀察各組大鼠成活以及皮瓣成活情況。術后第7天注射后30 min，各組隨機取6只大鼠過量麻醉處死，背部皮瓣照相，采用Image J 2x軟件測量皮瓣成活面積，按以下公式計算皮瓣成活率：皮瓣成活面積/皮瓣總面積×100%。每只大鼠測量2次，取均值。
1.3.2 Micro-CT血管成像
術后第7天注射后30 min各組隨機取6只大鼠，行Micro-CT掃描。大鼠同上法麻醉后，暴露胸腔及心臟，于左心室插管至主動脈，見回血插管成功后，剪開右心耳，生理鹽水置換大鼠全身血液，4%多聚甲醛灌注固定血管，然后用1 g/mL明膠氧化鉛[7]（預熱至40℃）灌注大鼠全身血管，將整只大鼠置于4℃冰箱保存24 h，拆除縫線，剪下皮瓣，行Micro-CT掃描；將所得圖像在3D-Viewer v2.2軟件中進行3D重建，利用MATLAB 2012b軟件將重建所得圖像進行分析、編程，計算皮瓣處血管容積和血管總長度。
1.3.3 組織學及免疫組織化學染色觀察
術后第7 天注射后30 min各組隨機取6只大鼠過量麻醉處死。于皮瓣中部剪取面積為3 cm×1 cm的組織，置于多聚甲醛固定后行5 μm厚冰凍切片，分別行HE染色及VEGF免疫組織化學染色，鏡下觀察皮瓣組織結構層次、炎性浸潤程度和VEGF表達情況。
1.3.4 SOD、MDA及組織炎性因子測定
于術后即刻及第1、3、7天注射后30 min各組隨機取6只大鼠過量麻醉處死，于皮瓣中部剪取面積為3 cm×1 cm的組織，立即置于液氮中進行組織勻漿，利用水溶性四氮唑-1法法及可見光法，測量組織SOD和MDA含量；利用ELISA法測量組織勻漿TNF-α和IL-6含 量。
1.4 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 皮瓣成活率檢測
術后各組大鼠均存活至實驗完成，無積血、積液和感染等發生。大體觀察示，術后第1天，兩組皮瓣未見明顯壞死，皮瓣略蒼白，部分皮瓣遠端青紫；第3天，兩組皮瓣遠端出現不同程度壞死，壞死界限不清，但Tempol組壞死較輕；第7天，兩組皮瓣壞死面積較第3天時擴大，皮瓣遠端皺縮，壞死界限明確，Tempol組皮瓣遠端壞死、皺縮程度以及皮瓣水腫程度均輕于對照組。見圖 1。術后第7天Tempol組皮瓣成活率為79.53%±4.55%，顯著高于對照組的59.24%±4.23%，比較差異有統計學意義（t=7.960，P=0.000）。
圖1
術后第7天兩組皮瓣大體觀察 箭頭示皮瓣缺血壞死部位 ? 對照組 ? Tempol組 ? ?2.2 Micro-CT血管成像觀察
術后第7天，Tempol組皮瓣遠端有大量新生血管形成，血管分布及血管連續性均優于對照組（圖 2）。對照組血管容積為（1 005.747± 183.246） mm3，Tempol組為（2 129.019±579.623） mm3；對照組血管總長度為（151.20±12.19） mm，Tempol組為（294.10±19.46） mm。Tempol組血管容積、血管總長度均高于對照組，比較差異有統計學意義（t=4.526，P=0.001；t=6.222，P=0.001）。
2.3 組織學觀察
術后第7天，對照組可見皮膚各層組織結構層次不清、明顯組織炎性反應及炎性細胞浸潤；Tempol組可見皮膚各層組織結構層次尚清楚，組織炎性反應及炎性細胞浸潤較輕。見圖 3。
2.4 免疫組織化學染色觀察
術后第7天，兩組VEGF主要表達于皮瓣組織真皮層內血管周圍與基質細胞內，其中Tempol組VEGF蛋白染色明顯深于對照組。見圖 4。
2.5 SOD、MDA及炎性因子含量測定
術后即刻兩組SOD、MDA以及TNF-α、IL-6含量比較，差異均無統計學意義（P＜0.05）；術后第1、3、7天，Tempol組SOD含量明顯高于對照組，MDA及TNF-α、IL-6含量明顯低于對照組，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 5。
3 討論
LRPSF具有隨意性、靈活性、使用方便等特點，可在身體任何部位、任何方向獲得，已廣泛應用于整形外科手術中。但是，當皮瓣長寬比例大于2∶1時，皮瓣遠端容易發生較嚴重的缺血壞死，導致手術失敗[8]。因此，降低LRPSF遠端壞死有利于提高皮瓣成活率，降低二次手術風險，減少圍手術期并發 癥。
本研究采用大鼠LRPSF模型，皮瓣長寬比例為3∶1，該模型啃食率低，便于觀察，適用于皮瓣成活的干預研究[9]。明膠氧化鉛灌注結合Micro-CT能對感興趣血管體區進行掃描，可在不破壞標本的情況下了解樣本內部顯微結構，實現血管三維重建和有關血管參數計算；與大體巨微解剖對比，Micro-CT能夠從三維角度顯示穿支血管的分布和走行，以及穿支血管體區間相互連接，可清晰顯示大鼠背部穿支血管三維形態，是研究LRPSF血管生成的可靠方法[10]。為此，我們選擇該方法觀察術后皮瓣血管形成情況。
研究發現，氧化應激損傷、皮瓣缺血和炎性反應是影響皮瓣成活的重要原因[11-13]。Tempol是一種可自由通過細胞膜的氧自由基清除劑，具有很強的抗氧化應激作用，能夠提高組織細胞中抗氧化酶活性、保護線粒體、降低脂質過氧化物和自由基含量，明顯減輕組織和細胞氧化應激損傷[14]。本研究結果表明，Tempol能改善LRPSF缺血再灌注損傷，提高皮瓣成活率，分析其作用機制包括以下三方面。
第一，Tempol能顯著減少大鼠皮瓣壞死面積，表明Tempol具有降低遠端皮瓣壞死的作用。缺血是皮瓣發生壞死的重要原因，VEGF是促進血管生成最重要的因子之一，它是通過促進血管內皮細胞增殖與再生，促進血管生成[15-16]。血管容積和血管總長度分別表示相同面積皮瓣區域內進入血管的造影劑量及各血管長度總和，很大程度上反映了血管的生成。本研究結果表明Tempol能夠提高皮瓣組織中VEGF的表達，增加血管容積和總血管長度，改善皮瓣血供環境。
第二，減輕隨意皮瓣缺血再灌注損傷是提高隨意皮瓣成活率的關鍵，缺血再灌注損傷是一個復雜的病理生理過程，包括組織缺血、炎性反應、氧自由基損傷等[1, 10-13]，既往研究發現天然水蛭素通過改善大鼠背部任意皮瓣缺血程度，促進隨意皮瓣早期斷蒂并成活[10]；此外，黑大豆皮中的花青素也可通過減輕炎性反應，進而有效減少缺血再灌注損傷[11]。氧化應激一直被認為是皮瓣缺血再灌注損傷的關鍵，Zhou等[9]研究發現，在皮瓣缺血再灌注損傷模型中，骨化三醇通過提高SOD、降低MDA含量，發揮抗氧化應激作用，進而提高皮瓣成活率，但骨化三醇存在抗氧化作用較弱、結構不穩定、半衰期短等缺陷。與之相比，Tempol具有以下優勢：① 抗氧化作用強于骨化三醇，可有效清除氧自由基，明顯減輕氧化應激反應；② 可自由通過細胞膜屏障，并在線粒體周圍有效聚集，空間上有利于對抗線粒體依賴的氧化應激途徑；③ 配制方法簡便，易溶于水，給藥方便，可口服、腹腔注射、鼠尾靜脈注射等。氧化應激反應會釋放大量氧自由基，這些氧自由基與組織細胞表面的脂質、蛋白質結合發生反應，產生大量脂質過氧化物產物，引發組織、細胞發生氧化反應，引起組織、細胞損傷甚至凋亡、壞死[17]。SOD是體內最重要的抗氧化應激酶之一，SOD通過清除超氧陰離子自由基（O2-），將有害的超氧自由基轉換成過氧化氫，經體內過氧化物酶分解，轉變成水，保護細胞免受損傷[18]；MDA是經典的體內脂質過氧化損傷終產物，能夠反映組織受氧化應激損傷的程度，與細胞損傷程度密切相關，同時還可間接反映機體氧自由基的量[19]。本研究結果顯示，Tempol組LRPSF組織中SOD含量提高，同時MDA含量降低，表明Tempol能夠明顯降低大鼠皮瓣組織細胞氧化應激損傷，其機制與減輕皮瓣組織脂質過氧化損傷、清除氧自由基和增強抗氧化酶活力，促進皮瓣組織啟動抗氧化機制，發揮抗氧化作用有關。
第三，LRPSF移植后炎性反應造成皮瓣組織真皮層發生凝固性壞死，炎性反應越嚴重，皮瓣組織發生凝固性壞死的程度也越嚴重，因此炎性反應在皮瓣成活中發揮重要作用；適當的炎性反應有利于皮瓣組織愈合，而過重的炎性反應將嚴重影響皮瓣成活，減輕加重的炎性反應，能夠促進皮瓣組織、切口愈合[20]。TNF-α和IL-6均是體內最重要的炎性因子之一，與炎性反應啟動，炎性介質釋放，炎性細胞趨化、聚集、浸潤，炎性反應擴大各個環節密切相關[21]。我們發現給予Tempol后，皮瓣組織TNF-α、IL-6和炎性細胞浸潤程度顯著降低，表明Tempol能夠減輕皮瓣損傷過程中的炎性反應。
綜上述，氧自由基清除劑Tempol能夠提高大鼠LRRSF成活率和促進血管生成，其機制與增加VEGF表達量，降低氧化應激損傷和炎性反應有關。本研究進一步豐富了LRPSF成活理論，為臨床減輕LRPSF遠端壞死提供了新思路。
