引用本文： 任莉榮, 徐永清, 王海, 何曉清, 宋慕國, 陳學秋. 金黃色葡萄球菌肽聚糖促進破骨細胞分化的分子機制研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(10): 1244-1248. doi: 10.7507/1002-1892.20160254 復制
骨髓炎是一種急性或慢性骨組織感染，以化膿性炎癥、異常骨重建及難控性骨吸收為特征[1]，常導致感染性骨缺損，由于感染與骨缺損合并存在，治療困難，是骨科難治性疾病之一。金黃色葡萄球菌是引起骨髓炎最常見的致病菌[2]，其引起感染性骨缺損的機制主要為感染導致的骨形成不足[3-5]及骨破壞增加[6]。金黃色葡萄球菌肽聚糖（Staphylococcal peptidoglycan，PGN-sa）是金黃色葡萄球菌細胞壁上的重要毒力成分，前期研究發現[7]，PGN-sa具有促進破骨細胞分化形成的作用。本研究通過檢測破骨細胞分化過程中相關蛋白的表達，對PGN-sa促進破骨細胞分化形成的分子機制進行深入研究。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
Raw264.7細胞由昆明動物研究所提供。H-DMEM培養基（HyClone公司，美國）；FBS（杭州四季青生物工程材料有限公司）；PGN-sa（Invitrogen公司，美國）；細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、p38、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、NF-κB、NF-κB抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB-α）、Akt、GAPDH、活化T細胞核因子1 （nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1，NFATc1）抗體及磷酸化抗體p-p38、p-ERK、p-JNK、p-Akt、p-NF-κB，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（Cell Signaling Technology公司，美國）；化學發光底物（Millipore公司，德國）；TNF-α、IL-1α、IL-6 ELISA試劑盒（Abcam公司，英國）；NF-κB激活的強效抑制劑SC75741（目錄號S7273，上海藍木化工有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術有限公司）。酶標儀（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；凝膠成像儀、垂直電泳槽、Image-lab 軟件5.2.1（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 實驗方法及檢測指標
1.2.1 Western
blot 檢測相關蛋白表達 ① NFATc1表達：將Raw264.7細胞以5×105個/孔濃度接種于6孔板，用完全培養基（含15%FBS、1%青鏈霉素混合液的H-DMEM培養基）培養24h后，加入200ng/ mL PGN-sa或150 nmol/L SC75741+200ng/mL
PGN-sa分別培養0、1、2、3 d，每個時間點設4個復孔，SC75741作用24 h后撤出，培養2 d及3 d的組別換液后重復加入PGN-sa繼續培養。② 破骨細胞分化信號通路相關蛋白（ERK、p38、JNK、NF-κB、IκB-α、Akt及p-ERK、p-p38、p-JNK、p-NF-κB、p-Akt）表達：將Raw264.7細胞以2×106個/孔濃度接種于6孔板，用完全培養基培養24 h后，加入200 ng/mL PGN-sa分別培養0、5、10、20、40、60 min，每個時間點設4 個復孔；為驗證NF-κB的作用，在培養基內提前1h加入150 nmol/L SC75741，再用PGN-sa刺激。
在對應時間點收集細胞，提取總蛋白，用BCA蛋白濃度測定法測定蛋白濃度，以20 μg總蛋白上樣量進行Western blot檢測。配制8%～12%的分離膠及5%濃縮膠，每孔加入20 μg 相應樣品，80V電泳20 min后改為120 V繼續電泳約80 min，用90V轉膜120～150 min，將蛋白轉移至聚偏氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉或牛血清白蛋白Tris-HCl緩沖鹽溶液室溫封閉1 h；再用相應一抗4℃孵育過夜，回收一抗后聚偏氟乙烯膜漂洗2遍，加入二抗室溫孵育1h；再漂洗3～4遍后加入發光液，于凝膠成像儀內進行曝光成像，圖像灰度值采用Image lab軟件進行分析，以目的蛋白與GAPDH灰度值的比值表示各蛋白表達量。
1.2.2 ELISA檢測TNF-α、IL-1α及IL-6表達
實驗分為A、B、C、D 4組，每組設6個復孔。將Raw264.7細胞以1×105個/孔濃度種于24孔板，培養24 h后，分別于A、B、C、D組對應孔內加入100、200、400ng/ mL PGN-sa及PBS；于培養1、2、3 d時收集上清液，按ELISA試劑盒說明書檢測450 nm波長下的吸光度（A）值，作為TNF-α、IL-1α及IL-6的蛋白表達量。
1.3 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 Western blot檢測
2.1.1 NFATc1表達
隨培養時間延長，NFATc1蛋白表達量呈逐漸增加趨勢，各時間點間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；但加入SC75741后，NFATc1蛋白表達在2、3 d明顯受到抑制，2、3 d時的蛋白表達量與未加入SC75741前比較，差異有統計學意義（P＜0.001）。見圖 1。
圖1
Western blot檢測PGN-sa刺激后各時間點NFATc1蛋白表達 ? 電泳圖 1：0d 2：1 d 3：2 d 4：3 d ? NFATc1蛋白表達量 ? ?2.1.2 破骨細胞分化信號通路相關蛋白表達
IκB-α蛋白表達量在PGN-sa刺激后5 min及10 min時明顯降低，20 min后恢復正常，5、10 min的蛋白表達量與其余時間點間比較，差異有統計學意義（P＜0.001）；而p-NF-κB的蛋白表達量于PGN-sa刺激后5 min及10 min時明顯增高，20 min后恢復正常，5、10 min的蛋白表達量與其余時間點間比較，差異有統計學意義（P＜0.001），且5 min時的蛋白表達量高于10 min時（P＜0.001）。加入SC75741后，各時間點間比較IκB-α及p-NF-κB的蛋白表達量差異無統計學意義（P＞0.05）；與未加入SC75741比較，IκB-α、p-NF-κB蛋白表達量在5、10 min時差異有統計學意義（P＜0.05）。而其他蛋白（ERK、p38、JNK、NF-κB、Akt及p-p38、p-ERK、p-JNK、p-Akt）表達量隨時間延長無明顯變化，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖 2。
2.2 ELISA檢測
各時間點A～D組TNF-α及IL-1α均未見表達。各組IL-6蛋白表達量隨時間延長呈遞增趨勢，各時間點間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。培養1d時，各組間比較IL-6蛋白表達量差異無統計學意義（P＞0.05）；2、3 d時，A、B、C組IL-6蛋白表達量顯著高于D組，A、B、C組間呈遞增趨勢，各組間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 3。
3 討論
破骨細胞為多核巨細胞，起源于單核巨噬細胞系[8]，由其前體細胞相互融合而形成[9]。大量研究發現，許多細胞因子參與了破骨細胞的分化過程，而NF-κB受體活化因子配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）在破骨細胞分化形成過程中的作用尤為重要[10]。RANKL與其受體--NF-κB受體活化因子結合后，可通過NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶（包含ERK、JNK、p38）及PI3K/Akt信號通路促進破骨細胞的分化形成[11-13]。而NFATc1是在破骨細胞的終末分化階段起決定性作用，它的激活直接上調了破骨細胞特異性基因的表達[14]。
本研究中，PGN-sa作用于Raw264.7細胞后5 min及10 min，IκB-α表達明顯降低，同時p-NF-κB表達明顯增高，二者在時間上具有一致性。在NF-κB經典信號通路中，IκB-α的降解導致細胞質內NF-κB發生磷酸化，隨后p-NF-κB從細胞質移位進入細胞核，與相應啟動子結合而啟動轉錄過程[15]。本實驗在研究破骨細胞分化過程中相關信號通路時，僅發現NF-κB經典信號通路中的兩個重要相關蛋白（IκB-α和p-NF-κB）表達發生改變，其他信號通路相關蛋白表達無變化，提示NF-κB經典信號通路可能參與了PGN-sa誘導的破骨細胞分化過程。同時，NFATc1的表達隨PGN-sa作用時間延長而增高，其表達增高可直接導致破骨細胞特異性基因表達增高，間接驗證了PGN-sa具有促進破骨細胞分化形成的作用。隨后，我們用NF-κB激活的強效抑制劑SC75741重復實驗發現，SC75741抑制了IκB-α的降解及NF-κB的磷酸化，隨后也抑制了NFATc1 的 增 高表達，由此說明PGN-sa通過NF-κB信號通路激活了NFATc1，進而促進破骨細胞分化形成。此外，PGN被Toll樣受體2（Toll-like receptor 2，TLR-2）[16]識別，而破骨細胞及其前體細胞均表達所有的TLRs[17]，PGN-sa是否與TLR-2結合導致NFκB的激活，進而促進破骨細胞的分化，有待進一步研 究。
在破骨細胞的分化過程中，一些促炎性細胞因子，如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-11等在無RANKL的條件下，同樣能促進破骨細胞的分化形成[18-20]。本研究中，在PGN-sa的作用下，TNF-α及IL-1α均無明顯表達，但IL-6表達增多，并呈現一定的時間劑量依賴關系，提示IL-6在PGN-sa誘導的破骨細胞分化過程中起一定作用。但實驗中我們同樣發現，在無PGN-sa的作用下，Raw264.7細胞本身也合成分泌一定量IL-6，雖然PGN-sa的作用導致IL-6的表達增高，但其是否促進破骨細胞的分化形成，或促進Raw264.7細胞的存活，需要進一步研究。在炎癥相關性疾病研究中，NF-κB信號通路調控了許多包括IL-6在內的炎性細胞因子的產生[21]，PGN-sa是否通過NF-κB的激活而上調IL-6的表達，也需要進一步研究。
綜上述，感染性骨缺損是難治性骨髓炎的一個重要原因，而感染性骨缺損的發生機制與感染導致的成骨不足及破骨活性的增強有關。本研究在既往研究基礎上，進一步對PGN-sa促進破骨細胞分化的機制進行研究并發現，PGN-sa通過NF-κB信號通路促進破骨細胞的分化形成，而IL-6在這一過程中可能起一定作用；但PGN-sa是否通過TLR-2激活NF-κB，而NF-κB的激活與IL-6的表達增高是否存在直接關系，仍需進一步研究。本研究通過探討感染性骨缺損的相關機制，有望對臨床藥物的研制及骨髓炎的治療提供新的靶點及策略。
骨髓炎是一種急性或慢性骨組織感染，以化膿性炎癥、異常骨重建及難控性骨吸收為特征[1]，常導致感染性骨缺損，由于感染與骨缺損合并存在，治療困難，是骨科難治性疾病之一。金黃色葡萄球菌是引起骨髓炎最常見的致病菌[2]，其引起感染性骨缺損的機制主要為感染導致的骨形成不足[3-5]及骨破壞增加[6]。金黃色葡萄球菌肽聚糖（Staphylococcal peptidoglycan，PGN-sa）是金黃色葡萄球菌細胞壁上的重要毒力成分，前期研究發現[7]，PGN-sa具有促進破骨細胞分化形成的作用。本研究通過檢測破骨細胞分化過程中相關蛋白的表達，對PGN-sa促進破骨細胞分化形成的分子機制進行深入研究。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
Raw264.7細胞由昆明動物研究所提供。H-DMEM培養基（HyClone公司，美國）；FBS（杭州四季青生物工程材料有限公司）；PGN-sa（Invitrogen公司，美國）；細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、p38、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、NF-κB、NF-κB抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB-α）、Akt、GAPDH、活化T細胞核因子1 （nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1，NFATc1）抗體及磷酸化抗體p-p38、p-ERK、p-JNK、p-Akt、p-NF-κB，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（Cell Signaling Technology公司，美國）；化學發光底物（Millipore公司，德國）；TNF-α、IL-1α、IL-6 ELISA試劑盒（Abcam公司，英國）；NF-κB激活的強效抑制劑SC75741（目錄號S7273，上海藍木化工有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術有限公司）。酶標儀（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；凝膠成像儀、垂直電泳槽、Image-lab 軟件5.2.1（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 實驗方法及檢測指標
1.2.1 Western
blot 檢測相關蛋白表達 ① NFATc1表達：將Raw264.7細胞以5×105個/孔濃度接種于6孔板，用完全培養基（含15%FBS、1%青鏈霉素混合液的H-DMEM培養基）培養24h后，加入200ng/ mL PGN-sa或150 nmol/L SC75741+200ng/mL
PGN-sa分別培養0、1、2、3 d，每個時間點設4個復孔，SC75741作用24 h后撤出，培養2 d及3 d的組別換液后重復加入PGN-sa繼續培養。② 破骨細胞分化信號通路相關蛋白（ERK、p38、JNK、NF-κB、IκB-α、Akt及p-ERK、p-p38、p-JNK、p-NF-κB、p-Akt）表達：將Raw264.7細胞以2×106個/孔濃度接種于6孔板，用完全培養基培養24 h后，加入200 ng/mL PGN-sa分別培養0、5、10、20、40、60 min，每個時間點設4 個復孔；為驗證NF-κB的作用，在培養基內提前1h加入150 nmol/L SC75741，再用PGN-sa刺激。
在對應時間點收集細胞，提取總蛋白，用BCA蛋白濃度測定法測定蛋白濃度，以20 μg總蛋白上樣量進行Western blot檢測。配制8%～12%的分離膠及5%濃縮膠，每孔加入20 μg 相應樣品，80V電泳20 min后改為120 V繼續電泳約80 min，用90V轉膜120～150 min，將蛋白轉移至聚偏氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉或牛血清白蛋白Tris-HCl緩沖鹽溶液室溫封閉1 h；再用相應一抗4℃孵育過夜，回收一抗后聚偏氟乙烯膜漂洗2遍，加入二抗室溫孵育1h；再漂洗3～4遍后加入發光液，于凝膠成像儀內進行曝光成像，圖像灰度值采用Image lab軟件進行分析，以目的蛋白與GAPDH灰度值的比值表示各蛋白表達量。
1.2.2 ELISA檢測TNF-α、IL-1α及IL-6表達
實驗分為A、B、C、D 4組，每組設6個復孔。將Raw264.7細胞以1×105個/孔濃度種于24孔板，培養24 h后，分別于A、B、C、D組對應孔內加入100、200、400ng/ mL PGN-sa及PBS；于培養1、2、3 d時收集上清液，按ELISA試劑盒說明書檢測450 nm波長下的吸光度（A）值，作為TNF-α、IL-1α及IL-6的蛋白表達量。
1.3 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 Western blot檢測
2.1.1 NFATc1表達
隨培養時間延長，NFATc1蛋白表達量呈逐漸增加趨勢，各時間點間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；但加入SC75741后，NFATc1蛋白表達在2、3 d明顯受到抑制，2、3 d時的蛋白表達量與未加入SC75741前比較，差異有統計學意義（P＜0.001）。見圖 1。
圖1
Western blot檢測PGN-sa刺激后各時間點NFATc1蛋白表達 ? 電泳圖 1：0d 2：1 d 3：2 d 4：3 d ? NFATc1蛋白表達量 ? ?2.1.2 破骨細胞分化信號通路相關蛋白表達
IκB-α蛋白表達量在PGN-sa刺激后5 min及10 min時明顯降低，20 min后恢復正常，5、10 min的蛋白表達量與其余時間點間比較，差異有統計學意義（P＜0.001）；而p-NF-κB的蛋白表達量于PGN-sa刺激后5 min及10 min時明顯增高，20 min后恢復正常，5、10 min的蛋白表達量與其余時間點間比較，差異有統計學意義（P＜0.001），且5 min時的蛋白表達量高于10 min時（P＜0.001）。加入SC75741后，各時間點間比較IκB-α及p-NF-κB的蛋白表達量差異無統計學意義（P＞0.05）；與未加入SC75741比較，IκB-α、p-NF-κB蛋白表達量在5、10 min時差異有統計學意義（P＜0.05）。而其他蛋白（ERK、p38、JNK、NF-κB、Akt及p-p38、p-ERK、p-JNK、p-Akt）表達量隨時間延長無明顯變化，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖 2。
2.2 ELISA檢測
各時間點A～D組TNF-α及IL-1α均未見表達。各組IL-6蛋白表達量隨時間延長呈遞增趨勢，各時間點間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。培養1d時，各組間比較IL-6蛋白表達量差異無統計學意義（P＞0.05）；2、3 d時，A、B、C組IL-6蛋白表達量顯著高于D組，A、B、C組間呈遞增趨勢，各組間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 3。
3 討論
破骨細胞為多核巨細胞，起源于單核巨噬細胞系[8]，由其前體細胞相互融合而形成[9]。大量研究發現，許多細胞因子參與了破骨細胞的分化過程，而NF-κB受體活化因子配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）在破骨細胞分化形成過程中的作用尤為重要[10]。RANKL與其受體--NF-κB受體活化因子結合后，可通過NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶（包含ERK、JNK、p38）及PI3K/Akt信號通路促進破骨細胞的分化形成[11-13]。而NFATc1是在破骨細胞的終末分化階段起決定性作用，它的激活直接上調了破骨細胞特異性基因的表達[14]。
本研究中，PGN-sa作用于Raw264.7細胞后5 min及10 min，IκB-α表達明顯降低，同時p-NF-κB表達明顯增高，二者在時間上具有一致性。在NF-κB經典信號通路中，IκB-α的降解導致細胞質內NF-κB發生磷酸化，隨后p-NF-κB從細胞質移位進入細胞核，與相應啟動子結合而啟動轉錄過程[15]。本實驗在研究破骨細胞分化過程中相關信號通路時，僅發現NF-κB經典信號通路中的兩個重要相關蛋白（IκB-α和p-NF-κB）表達發生改變，其他信號通路相關蛋白表達無變化，提示NF-κB經典信號通路可能參與了PGN-sa誘導的破骨細胞分化過程。同時，NFATc1的表達隨PGN-sa作用時間延長而增高，其表達增高可直接導致破骨細胞特異性基因表達增高，間接驗證了PGN-sa具有促進破骨細胞分化形成的作用。隨后，我們用NF-κB激活的強效抑制劑SC75741重復實驗發現，SC75741抑制了IκB-α的降解及NF-κB的磷酸化，隨后也抑制了NFATc1 的 增 高表達，由此說明PGN-sa通過NF-κB信號通路激活了NFATc1，進而促進破骨細胞分化形成。此外，PGN被Toll樣受體2（Toll-like receptor 2，TLR-2）[16]識別，而破骨細胞及其前體細胞均表達所有的TLRs[17]，PGN-sa是否與TLR-2結合導致NFκB的激活，進而促進破骨細胞的分化，有待進一步研 究。
在破骨細胞的分化過程中，一些促炎性細胞因子，如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-11等在無RANKL的條件下，同樣能促進破骨細胞的分化形成[18-20]。本研究中，在PGN-sa的作用下，TNF-α及IL-1α均無明顯表達，但IL-6表達增多，并呈現一定的時間劑量依賴關系，提示IL-6在PGN-sa誘導的破骨細胞分化過程中起一定作用。但實驗中我們同樣發現，在無PGN-sa的作用下，Raw264.7細胞本身也合成分泌一定量IL-6，雖然PGN-sa的作用導致IL-6的表達增高，但其是否促進破骨細胞的分化形成，或促進Raw264.7細胞的存活，需要進一步研究。在炎癥相關性疾病研究中，NF-κB信號通路調控了許多包括IL-6在內的炎性細胞因子的產生[21]，PGN-sa是否通過NF-κB的激活而上調IL-6的表達，也需要進一步研究。
綜上述，感染性骨缺損是難治性骨髓炎的一個重要原因，而感染性骨缺損的發生機制與感染導致的成骨不足及破骨活性的增強有關。本研究在既往研究基礎上，進一步對PGN-sa促進破骨細胞分化的機制進行研究并發現，PGN-sa通過NF-κB信號通路促進破骨細胞的分化形成，而IL-6在這一過程中可能起一定作用；但PGN-sa是否通過TLR-2激活NF-κB，而NF-κB的激活與IL-6的表達增高是否存在直接關系，仍需進一步研究。本研究通過探討感染性骨缺損的相關機制，有望對臨床藥物的研制及骨髓炎的治療提供新的靶點及策略。
