引用本文： 方清清, 李志忠, 周建, 閆娟麗, 石文貴, 謝艷芳, 陳克明. 信號分子p38參與低頻脈沖電磁場促進成骨細胞礦化成熟的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(10): 1238-1243. doi: 10.7507/1002-1892.20160253 復制
骨重建過程是一個動態平衡過程，成骨細胞負責骨形成，而破骨細胞負責骨吸收[1-2]，通過持續不斷的重塑維持骨骼結構與功能的穩定性[3]。骨動態平衡一旦遭到破環就會引起一系列疾病。骨質疏松癥就是一種常見的骨代謝疾病，多見于老年人，由于患者骨微結構發生改變，骨脆性增加，極易發生骨折，給患者及家人造成了極大的經濟負擔[4]。低頻電磁場作為一種物理療法，近年來引起了人們的廣泛關注。研究表明[5-7]，低頻脈沖電磁場可以調節BMSCs的成骨性分化，預防骨量丟失，促進肩袖損傷大鼠模型的腱-骨愈合。然而其作用機制至今仍不十分明確。
絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）作為普遍存在于哺乳動物細胞中的一條高度保守的信號通路，在調控細胞增殖、分化及對外界環境的應激反應過程中起著重要作用[8-9]。經典的MAPKs家族包括細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinases，ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun amino N-terminal kinases，JNK）以及p38激酶。MAPKs的酪氨酸殘基和/或蘇氨酸殘基被上游激酶磷酸化而活化，活化的MAPKs再通過磷酸化底物的酪氨酸殘基和/或蘇氨酸殘基調節細胞的信號級聯反應[10]。研究表明ERK和JNK信號通路參與淫羊藿苷誘導的成骨細胞礦化成熟[11]，p38信號通路對于小鼠的骨骼發育和骨代謝平衡至關重要[12]。本課題組前期研究發現，50 Hz、0.6 mT低頻脈沖電磁場可顯著促進大鼠顱骨成骨細胞的礦化成熟[13]，那么其在促進骨形成的過程中是否激活了MAPKs信號通路尚不可知。我們進一步對此進行了研究，以期更深入了解低頻脈沖電磁場促進骨形成的機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
出生48 h內的SPF級Wistar大鼠6只，雌雄不限，由甘肅省中醫學院動物實驗中心提供。
FBS（蘭州民海生物工程有限公司）；α-MEM培養液、Ⅱ型膠原酶（GIBCO公司，美國）；胰蛋白酶（西安科昊生物工程有限責任公司）；PIRA蛋白裂解液（北京普利萊基因技術有限公司）；苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、ECL Plus超敏發光液（北京索萊寶科技有限公司）；p-ERK1/2抗體、ERK1/2抗體、p-JNK1/2抗體、JNK1/2抗體、p-p38抗體、p38抗體（Abcam公司，美國）；辣根過氧化物酶標記二抗（上海碧云天生物技術有限公司）；ALP試劑盒（南京建成生物工程研究所）；DMSO、p-p38抑制劑SB202190、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、磷酸化的維生素C、α-萘基磷酸鈉、茜素紅、固藍B鹽（Sigma公司，美國）。
立式電熱壓力滅菌器（上海申安醫療器械有限公司）；恒溫水浴箱（北京長風儀器儀表公司）；CO2培養箱（Thermo Revco公司，美國）；醫用凈化工作臺（吳江市通達空調凈化設備廠）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；調速平板振蕩器（姜堰市新康醫療器械有限公司）；全波長酶標儀（Epoch Biotek公司，美國）；臺式高速冷凍離心機（Kendro公司，美國）；水平搖床（沃德生物醫學儀器公司）；電泳儀（Bio-Rad公司，美國）；細胞培養皿（Coring Costar公司，美國）；移液槍（Eppendorf公司，德國）。
1.2 低頻電磁場細胞處理儀
本實驗所用低頻電磁場細胞處理儀由本課題組自行研制，整套裝置包括電腦控制系統、數模轉化系統、信號放大裝置、線圈、磁場傳感器和溫度傳感器等，可產生頻率5～200 Hz、強度0～9.0 mT的不同類型均勻磁場，保證60 mm培養皿內所有細胞受到相同磁場處理。實驗過程中，數模轉化系統將電腦控制系統產生的數字信號轉化為模擬信號，再經信號放大裝置放大后由線圈產生電磁場。其中線圈長27 cm、內徑10 cm，經嚴格消毒后置于37℃恒溫培養箱中，通過導線與其他裝置連接；磁場傳感器和溫度傳感器實時監測線圈內部區域磁場強度及溫度的變化，以確保實驗的可控性。
1.3 大鼠顱骨成骨細胞的分離培養
取6只Wistar大鼠采用脫臼法處死后，75%乙醇浸泡消毒；取出顱骨，剔除血管及結締組織，PBS漂洗后剪成約2 mm2大小的骨碎片，0.25%胰蛋白酶37℃消化10 min；棄消化液，換用0.1%Ⅱ型膠原酶37℃消化10 min；棄消化液，用0.1%Ⅱ型膠原酶37℃消化3次，每次20 min；收集消化液，使用含10%FBS的α-MEM培養液終止消化反應，200目細胞篩過濾，除去殘余骨碎片，以離心半徑15.7 cm、1000 r/min離心10 min；棄上清，沉淀經反復吹打重懸后，以3×104個/mL濃度接種于90 mm培養皿，置于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養，待細胞生長至90%以上融合時消化傳代用于實驗。
1.4 觀測指標
1.4.1 Western
blot檢測 取原代大鼠顱骨成骨細胞，以3×104個/mL濃度接種于60 mm培養皿中，待生長至完全融合時分為7組，分別置于低頻電磁場細胞處理儀中，經50 Hz、0.6 mT低頻脈沖電磁場連續處理0、5、10、20、40、60、120 min后立即取出，棄培養液，用4℃預冷的PBS清洗3次；吸盡殘余PBS，加入300 μL含1%PMSF的PIRA蛋白裂解液，于冰上靜置10 min裂解細胞；收集細胞裂解液，4℃以離心半徑8.7 cm、12 000 r/min離心30 min；收集上清，取20 μL使用BCA蛋白定量法測定蛋白質濃度，剩余上清加入1/4體積的蛋白上樣緩沖液，沸水浴10min；取20 μg進行SDS-PAGE凝膠電泳，之后電轉至聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，加入一抗（p-ERK1/2抗體、ERK1/2抗體、p- JNK1/2抗體、JNK1/2抗體、p-p38抗體、p38抗體）4℃孵育過夜，TBST清洗5次，每次8 min；加入二抗室溫孵育2 h，TBST清洗5次，每次8 min；ECL Plus超敏發光液暗室發光顯影，結果條帶使用ipp軟件掃描量 化。
1.4.2 ALP活性測定
取原代大鼠顱骨成骨細胞，以3×104個/mL濃度接種于30 mm培養皿中，待生長至完全融合時隨機分為對照組（A組）、低頻脈沖電磁場處理組（B組）、SB202190組（C組）、SB202190+低頻脈沖電磁場處理組（D組）。A組不作任何處理；B組使用50 Hz、0.6 mT低頻脈沖電磁場每天處理1.5 h；C組僅加入1×10-8 μmol/L SB202190；D組加入1×10-8 μmol/L SB202190，同時采用50 Hz、0.6 mT低頻脈沖電磁場每天處理1.5 h。連續處理1、4、7 d后棄培養液，用4℃預冷的PBS清洗3次；吸盡殘余PBS，按照ALP試劑盒說明書檢測細胞ALP活性。
1.4.3 ALP組織化學染色觀察
取原代大鼠顱骨成骨細胞，以3×104個/mL濃度接種于30 mm培養皿中，待生長至90%以上融合時換用成骨誘導培養液（含10%FBS、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、1×10-8 mol/L地塞米松、1×10-4 mol/L磷酸化的維生素C的α-MEM培養液）培養，同時按照1.4.2方法分組并進行相應處理9 d，然后棄培養液，用37℃預熱的PBS清洗3 次，4%甲醛固定10 s；棄甲醛，37℃預熱的PBS清洗3次，加入一定量新鮮配制的ALP染色液，37℃避光水浴孵育，至培養皿上ALP陽性染色斑點不再增多時棄染色液，PBS清洗3次，室溫晾干，拍照記錄實驗結果，圖片使用ipp軟件掃描量化，檢測ALP陽性克隆數及陽性克隆面積。
1.4.4 茜素紅染色觀察
取原代大鼠顱骨成骨細胞，培養及處理方法同1.4.3。細胞經連續處理12d后棄培養液，4℃預冷的PBS清洗3次，吸盡殘余PBS，4%甲醛室溫固定10 min；棄甲醛，PBS清洗3 次，加入1%茜素紅染色液37℃水浴1 h；棄染色液，PBS清洗3次，照相記錄實驗結果，圖片使用ipp軟件掃描量化，檢測鈣結節數量及面積。
1.5 統計學處理
采用SPSS20.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 Western blot檢測
處理各時間點p-ERK1/2、p-JNK1/2蛋白表達量無顯著變化，差異無統計學意義（P＞0.05）。而p-p38蛋白表達量則在處理5 min后開始升高，至40 min時達峰值，之后開始逐步下降，但各時間點均顯著高于0min時，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 1。
圖1
低頻脈沖電磁場處理不同時間后MAPKs磷酸化水平的變化 ? 電泳? ?2.2 ALP活性測定
處理1、4、7 d，B組ALP活性顯著高于A、C、D組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；A、C、D組間差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖 2。
2.3 ALP染色觀察
A、B、C、D組ALP陽性克隆數分別為（968±22）、（1 280±21）、（945±19）、（1 086±24）個，ALP陽性克隆面積分別為（1.452 6±0.114 6）、（2.115 6±0.096 4）、（1.4200±0.087 6）、（1.579 8±0.115 6） cm2，B組均顯著多于A、C、D組，差異有統計學意義（P＜0.05）；此外，D組ALP陽性克隆數顯著高于A組（P＜0.01）。見圖 3。
圖3
各組處理9 d時ALP組織化學染色觀察 ? A組 ? B組 ? C組 ? D組 ? ?2.4 茜素紅染色觀察
A、B、C、D組鈣結節數量分別為（1 779±76）、（2529±120）、（1 827±42）、（2 067±46）個，鈣結節面積分別為（0.656 1±0.060 6）、（0.953 8±0.034 4）、（0.6625± 0.039 8）、（0.745 9±0.052 3） cm2，B組均顯著多于A、C、D組，差異有統計學意義（P＜0.05）；此外，D組鈣結節數量顯著多于A組（P＜0.01）。見圖 4。
3 討論
作為細胞信號轉導過程中的重要分子，經典MAPKs的磷酸化水平受到嚴格調控，細胞外信號分子通過與受體相互作用而激活受體，活化的受體結合鳥苷酸釋放因子和GTP酶活化蛋白而調節Ras的活性，使GTP與GDP之間發生交換，從而啟動級聯反應，激活絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase kinase kinases，MAPKKKs），活化的MAPKKKs結合并磷酸化MAPKKs（mitogen-activated protein kinase kinases）的絲氨酸/蘇氨酸殘基，使其活化，進而磷酸化MAPKs的絲氨酸/蘇氨酸殘基，激活一系列底物，從而引起相應的生物效應[14]。研究表明其在骨重建過程中發揮重要作用：ERK和p38 MAPK信號通路在人參屬三七皂苷促進BMSCs成骨分化的過程中扮演重要角色[15]；雌激素介導的MEK-ERK信號通路參與接骨木提取物香草酸促進骨形成的過程[16]；p-JNK參與BMP誘導的成骨細胞骨鈣素的分泌[17]。
低頻電磁場在骨骼肌肉系統疾病方面的治療效果已得到了廣泛認可[18-20]，研究者們對其作用機制也進行了探討，文獻報道低頻電磁場可通過Ca2+/鈣調蛋白、NO-cGMP-PKG、Wnt/Lrp5/β-catenin等信號通路參與促進骨形成[21-23]。然而MAPKs信號通路與低頻電磁場促進骨形成之間的關系卻鮮有報道，對此本研究通過檢測50 Hz、0.6 mT低頻脈沖 電 磁場處理后MAPKs磷酸化水平的變化及其與大鼠 顱骨成骨細胞礦化成熟之間的關系發現，p38參與50 Hz、0.6 mT低頻脈沖電磁場促進骨形成的過 程。
通過采用Western blot檢測低頻脈沖電磁場處理不同時間后MAPKs磷酸化水平的變化發現，p- ERK1/2和p-JNK1/2的蛋白表達量無明顯變化，而p-p38的蛋白表達量卻發生顯著變化，說明50 Hz、0.6mT低頻脈沖電磁場激活了信號分子p38；而使用抑制劑SB202190抑制p-p38的活性后，由低頻脈沖電磁場所引起的ALP活性升高、ALP染色陽性克隆及鈣化結節數量和面積的增加被削弱，說明信號分子p38參與了50 Hz、0.6 mT低頻脈沖電磁場促進大鼠顱骨成骨細胞礦化成熟的過程。
然而，在實驗過程中我們發現，使用SB202190抑制p-p38活性后，由低頻脈沖電磁場所引起的ALP染色陽性克隆及鈣化結節陽性克隆并未完全回歸對照組水平（D組仍顯著高于A組），提示我們在50 Hz、0.6 mT低頻脈沖電磁場促進骨形成的過程中，尚有其他信號通路參與其中，這也與文獻報道結果相吻合。此外，在經典的信號分子p-p38的激活過程中，MAPKKKs中的MEKK1-3、MLK2/3、ASK1、Tpl2、TAK1和TAO1/2等，MAPKKs中的MEK3和MEK6參與其中，逐級激活[10]。那么50 Hz、0.6 mT低頻脈沖電磁場是通過經典的信號轉導方式激活p-p38，還是通過其他信號通路激活p-p38，仍有待研究，以明確在細胞這個非線性的系統中，各個信號通路之間的相互聯系、協調作用以及低頻電磁場促進骨形成的具體機制。
骨重建過程是一個動態平衡過程，成骨細胞負責骨形成，而破骨細胞負責骨吸收[1-2]，通過持續不斷的重塑維持骨骼結構與功能的穩定性[3]。骨動態平衡一旦遭到破環就會引起一系列疾病。骨質疏松癥就是一種常見的骨代謝疾病，多見于老年人，由于患者骨微結構發生改變，骨脆性增加，極易發生骨折，給患者及家人造成了極大的經濟負擔[4]。低頻電磁場作為一種物理療法，近年來引起了人們的廣泛關注。研究表明[5-7]，低頻脈沖電磁場可以調節BMSCs的成骨性分化，預防骨量丟失，促進肩袖損傷大鼠模型的腱-骨愈合。然而其作用機制至今仍不十分明確。
絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）作為普遍存在于哺乳動物細胞中的一條高度保守的信號通路，在調控細胞增殖、分化及對外界環境的應激反應過程中起著重要作用[8-9]。經典的MAPKs家族包括細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinases，ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun amino N-terminal kinases，JNK）以及p38激酶。MAPKs的酪氨酸殘基和/或蘇氨酸殘基被上游激酶磷酸化而活化，活化的MAPKs再通過磷酸化底物的酪氨酸殘基和/或蘇氨酸殘基調節細胞的信號級聯反應[10]。研究表明ERK和JNK信號通路參與淫羊藿苷誘導的成骨細胞礦化成熟[11]，p38信號通路對于小鼠的骨骼發育和骨代謝平衡至關重要[12]。本課題組前期研究發現，50 Hz、0.6 mT低頻脈沖電磁場可顯著促進大鼠顱骨成骨細胞的礦化成熟[13]，那么其在促進骨形成的過程中是否激活了MAPKs信號通路尚不可知。我們進一步對此進行了研究，以期更深入了解低頻脈沖電磁場促進骨形成的機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
出生48 h內的SPF級Wistar大鼠6只，雌雄不限，由甘肅省中醫學院動物實驗中心提供。
FBS（蘭州民海生物工程有限公司）；α-MEM培養液、Ⅱ型膠原酶（GIBCO公司，美國）；胰蛋白酶（西安科昊生物工程有限責任公司）；PIRA蛋白裂解液（北京普利萊基因技術有限公司）；苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、ECL Plus超敏發光液（北京索萊寶科技有限公司）；p-ERK1/2抗體、ERK1/2抗體、p-JNK1/2抗體、JNK1/2抗體、p-p38抗體、p38抗體（Abcam公司，美國）；辣根過氧化物酶標記二抗（上海碧云天生物技術有限公司）；ALP試劑盒（南京建成生物工程研究所）；DMSO、p-p38抑制劑SB202190、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、磷酸化的維生素C、α-萘基磷酸鈉、茜素紅、固藍B鹽（Sigma公司，美國）。
立式電熱壓力滅菌器（上海申安醫療器械有限公司）；恒溫水浴箱（北京長風儀器儀表公司）；CO2培養箱（Thermo Revco公司，美國）；醫用凈化工作臺（吳江市通達空調凈化設備廠）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；調速平板振蕩器（姜堰市新康醫療器械有限公司）；全波長酶標儀（Epoch Biotek公司，美國）；臺式高速冷凍離心機（Kendro公司，美國）；水平搖床（沃德生物醫學儀器公司）；電泳儀（Bio-Rad公司，美國）；細胞培養皿（Coring Costar公司，美國）；移液槍（Eppendorf公司，德國）。
1.2 低頻電磁場細胞處理儀
本實驗所用低頻電磁場細胞處理儀由本課題組自行研制，整套裝置包括電腦控制系統、數模轉化系統、信號放大裝置、線圈、磁場傳感器和溫度傳感器等，可產生頻率5～200 Hz、強度0～9.0 mT的不同類型均勻磁場，保證60 mm培養皿內所有細胞受到相同磁場處理。實驗過程中，數模轉化系統將電腦控制系統產生的數字信號轉化為模擬信號，再經信號放大裝置放大后由線圈產生電磁場。其中線圈長27 cm、內徑10 cm，經嚴格消毒后置于37℃恒溫培養箱中，通過導線與其他裝置連接；磁場傳感器和溫度傳感器實時監測線圈內部區域磁場強度及溫度的變化，以確保實驗的可控性。
1.3 大鼠顱骨成骨細胞的分離培養
取6只Wistar大鼠采用脫臼法處死后，75%乙醇浸泡消毒；取出顱骨，剔除血管及結締組織，PBS漂洗后剪成約2 mm2大小的骨碎片，0.25%胰蛋白酶37℃消化10 min；棄消化液，換用0.1%Ⅱ型膠原酶37℃消化10 min；棄消化液，用0.1%Ⅱ型膠原酶37℃消化3次，每次20 min；收集消化液，使用含10%FBS的α-MEM培養液終止消化反應，200目細胞篩過濾，除去殘余骨碎片，以離心半徑15.7 cm、1000 r/min離心10 min；棄上清，沉淀經反復吹打重懸后，以3×104個/mL濃度接種于90 mm培養皿，置于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養，待細胞生長至90%以上融合時消化傳代用于實驗。
1.4 觀測指標
1.4.1 Western
blot檢測 取原代大鼠顱骨成骨細胞，以3×104個/mL濃度接種于60 mm培養皿中，待生長至完全融合時分為7組，分別置于低頻電磁場細胞處理儀中，經50 Hz、0.6 mT低頻脈沖電磁場連續處理0、5、10、20、40、60、120 min后立即取出，棄培養液，用4℃預冷的PBS清洗3次；吸盡殘余PBS，加入300 μL含1%PMSF的PIRA蛋白裂解液，于冰上靜置10 min裂解細胞；收集細胞裂解液，4℃以離心半徑8.7 cm、12 000 r/min離心30 min；收集上清，取20 μL使用BCA蛋白定量法測定蛋白質濃度，剩余上清加入1/4體積的蛋白上樣緩沖液，沸水浴10min；取20 μg進行SDS-PAGE凝膠電泳，之后電轉至聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，加入一抗（p-ERK1/2抗體、ERK1/2抗體、p- JNK1/2抗體、JNK1/2抗體、p-p38抗體、p38抗體）4℃孵育過夜，TBST清洗5次，每次8 min；加入二抗室溫孵育2 h，TBST清洗5次，每次8 min；ECL Plus超敏發光液暗室發光顯影，結果條帶使用ipp軟件掃描量 化。
1.4.2 ALP活性測定
取原代大鼠顱骨成骨細胞，以3×104個/mL濃度接種于30 mm培養皿中，待生長至完全融合時隨機分為對照組（A組）、低頻脈沖電磁場處理組（B組）、SB202190組（C組）、SB202190+低頻脈沖電磁場處理組（D組）。A組不作任何處理；B組使用50 Hz、0.6 mT低頻脈沖電磁場每天處理1.5 h；C組僅加入1×10-8 μmol/L SB202190；D組加入1×10-8 μmol/L SB202190，同時采用50 Hz、0.6 mT低頻脈沖電磁場每天處理1.5 h。連續處理1、4、7 d后棄培養液，用4℃預冷的PBS清洗3次；吸盡殘余PBS，按照ALP試劑盒說明書檢測細胞ALP活性。
1.4.3 ALP組織化學染色觀察
取原代大鼠顱骨成骨細胞，以3×104個/mL濃度接種于30 mm培養皿中，待生長至90%以上融合時換用成骨誘導培養液（含10%FBS、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、1×10-8 mol/L地塞米松、1×10-4 mol/L磷酸化的維生素C的α-MEM培養液）培養，同時按照1.4.2方法分組并進行相應處理9 d，然后棄培養液，用37℃預熱的PBS清洗3 次，4%甲醛固定10 s；棄甲醛，37℃預熱的PBS清洗3次，加入一定量新鮮配制的ALP染色液，37℃避光水浴孵育，至培養皿上ALP陽性染色斑點不再增多時棄染色液，PBS清洗3次，室溫晾干，拍照記錄實驗結果，圖片使用ipp軟件掃描量化，檢測ALP陽性克隆數及陽性克隆面積。
1.4.4 茜素紅染色觀察
取原代大鼠顱骨成骨細胞，培養及處理方法同1.4.3。細胞經連續處理12d后棄培養液，4℃預冷的PBS清洗3次，吸盡殘余PBS，4%甲醛室溫固定10 min；棄甲醛，PBS清洗3 次，加入1%茜素紅染色液37℃水浴1 h；棄染色液，PBS清洗3次，照相記錄實驗結果，圖片使用ipp軟件掃描量化，檢測鈣結節數量及面積。
1.5 統計學處理
采用SPSS20.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 Western blot檢測
處理各時間點p-ERK1/2、p-JNK1/2蛋白表達量無顯著變化，差異無統計學意義（P＞0.05）。而p-p38蛋白表達量則在處理5 min后開始升高，至40 min時達峰值，之后開始逐步下降，但各時間點均顯著高于0min時，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 1。
圖1
低頻脈沖電磁場處理不同時間后MAPKs磷酸化水平的變化 ? 電泳? ?2.2 ALP活性測定
處理1、4、7 d，B組ALP活性顯著高于A、C、D組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；A、C、D組間差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖 2。
2.3 ALP染色觀察
A、B、C、D組ALP陽性克隆數分別為（968±22）、（1 280±21）、（945±19）、（1 086±24）個，ALP陽性克隆面積分別為（1.452 6±0.114 6）、（2.115 6±0.096 4）、（1.4200±0.087 6）、（1.579 8±0.115 6） cm2，B組均顯著多于A、C、D組，差異有統計學意義（P＜0.05）；此外，D組ALP陽性克隆數顯著高于A組（P＜0.01）。見圖 3。
圖3
各組處理9 d時ALP組織化學染色觀察 ? A組 ? B組 ? C組 ? D組 ? ?2.4 茜素紅染色觀察
A、B、C、D組鈣結節數量分別為（1 779±76）、（2529±120）、（1 827±42）、（2 067±46）個，鈣結節面積分別為（0.656 1±0.060 6）、（0.953 8±0.034 4）、（0.6625± 0.039 8）、（0.745 9±0.052 3） cm2，B組均顯著多于A、C、D組，差異有統計學意義（P＜0.05）；此外，D組鈣結節數量顯著多于A組（P＜0.01）。見圖 4。
3 討論
作為細胞信號轉導過程中的重要分子，經典MAPKs的磷酸化水平受到嚴格調控，細胞外信號分子通過與受體相互作用而激活受體，活化的受體結合鳥苷酸釋放因子和GTP酶活化蛋白而調節Ras的活性，使GTP與GDP之間發生交換，從而啟動級聯反應，激活絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase kinase kinases，MAPKKKs），活化的MAPKKKs結合并磷酸化MAPKKs（mitogen-activated protein kinase kinases）的絲氨酸/蘇氨酸殘基，使其活化，進而磷酸化MAPKs的絲氨酸/蘇氨酸殘基，激活一系列底物，從而引起相應的生物效應[14]。研究表明其在骨重建過程中發揮重要作用：ERK和p38 MAPK信號通路在人參屬三七皂苷促進BMSCs成骨分化的過程中扮演重要角色[15]；雌激素介導的MEK-ERK信號通路參與接骨木提取物香草酸促進骨形成的過程[16]；p-JNK參與BMP誘導的成骨細胞骨鈣素的分泌[17]。
低頻電磁場在骨骼肌肉系統疾病方面的治療效果已得到了廣泛認可[18-20]，研究者們對其作用機制也進行了探討，文獻報道低頻電磁場可通過Ca2+/鈣調蛋白、NO-cGMP-PKG、Wnt/Lrp5/β-catenin等信號通路參與促進骨形成[21-23]。然而MAPKs信號通路與低頻電磁場促進骨形成之間的關系卻鮮有報道，對此本研究通過檢測50 Hz、0.6 mT低頻脈沖 電 磁場處理后MAPKs磷酸化水平的變化及其與大鼠 顱骨成骨細胞礦化成熟之間的關系發現，p38參與50 Hz、0.6 mT低頻脈沖電磁場促進骨形成的過 程。
通過采用Western blot檢測低頻脈沖電磁場處理不同時間后MAPKs磷酸化水平的變化發現，p- ERK1/2和p-JNK1/2的蛋白表達量無明顯變化，而p-p38的蛋白表達量卻發生顯著變化，說明50 Hz、0.6mT低頻脈沖電磁場激活了信號分子p38；而使用抑制劑SB202190抑制p-p38的活性后，由低頻脈沖電磁場所引起的ALP活性升高、ALP染色陽性克隆及鈣化結節數量和面積的增加被削弱，說明信號分子p38參與了50 Hz、0.6 mT低頻脈沖電磁場促進大鼠顱骨成骨細胞礦化成熟的過程。
然而，在實驗過程中我們發現，使用SB202190抑制p-p38活性后，由低頻脈沖電磁場所引起的ALP染色陽性克隆及鈣化結節陽性克隆并未完全回歸對照組水平（D組仍顯著高于A組），提示我們在50 Hz、0.6 mT低頻脈沖電磁場促進骨形成的過程中，尚有其他信號通路參與其中，這也與文獻報道結果相吻合。此外，在經典的信號分子p-p38的激活過程中，MAPKKKs中的MEKK1-3、MLK2/3、ASK1、Tpl2、TAK1和TAO1/2等，MAPKKs中的MEK3和MEK6參與其中，逐級激活[10]。那么50 Hz、0.6 mT低頻脈沖電磁場是通過經典的信號轉導方式激活p-p38，還是通過其他信號通路激活p-p38，仍有待研究，以明確在細胞這個非線性的系統中，各個信號通路之間的相互聯系、協調作用以及低頻電磁場促進骨形成的具體機制。
