引用本文： 王曉旭, 何敏, 譚文甫, 譚光華, 楊俊濤, 洪亮. 腺病毒介導人TGF-β1基因轉染自體腘繩肌腱重建兔前交叉韌帶術后的表達. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(10): 1233-1237. doi: 10.7507/1002-1892.20160252 復制
前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）損傷是常見運動損傷，由此引起膝關節生物力學改變，繼發關節軟骨退變和半月板損傷，從而促進創傷性關節炎的發生及進展[1-3]。關節鏡下進行ACL重建是目前主要的治療方法[4-5]。其中，自體腘繩肌腱是常用移植物，但其腱-骨愈合過程緩慢，而術后遠期療效主要取決于重建后腱-骨界面的愈合情況[6]，因此如何促進ACL重建后的腱-骨愈合是研究重點。生長因子在腱-骨愈合過程中起著重要作用[7-8]。我們的前期研究結果表明，以腺病毒載體介導人TGF-β1（human TGF-β1，hTGF-β1）基因轉染腘繩肌腱后重建ACL，可促進腱-骨愈合[9]，但術后hTGF-β1基因在體內的表達情況尚不清楚。本研究擬應用Ad-hTGF-β1轉染自體腘繩肌腱并重建兔ACL，采用實時熒光定量PCR及Western blot法檢測hTGF-β1基因在術后不同時間點的表達情況，為ACL重建的基因治療提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物與主要試劑、儀器
15～20月齡雄性新西蘭大白兔48只，體質量（2.0±0.4）kg，由南華大學動物實驗部提供。實驗動物雙側后肢膝關節均無腫脹，前抽屜試驗及Lachman試驗陰性。
重組腺病毒載體Ad-hTGF-β1與腺病毒空載體Ad-綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）由上海和元生物公司完成病毒的構建、鑒定及滴度測定。ELISA試劑盒（長沙湘宇生物技術有限公司）；FastQuant RT kit及SuperReal PreMix Plus試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；鼠抗人TGF-β1單克隆抗體（Santa Cruz公司，美國）；鼠抗兔GAPDH單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記羊抗鼠二抗抗體IgG（Bioworld公司，美國）。核酸蛋白檢測儀（Eppendorf公司，德國）；凝膠成像分析系統（Bio-Rad公司，美國）；實時熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司，美國）；Image J圖像分析軟件（National Institutes of Health，美國）。
1.2 實驗方法
1.2.1 實驗分組
將48只新西蘭大白兔隨機分為A、B、C 3組，每組16只。A組以Ad-hTGF-β1轉染雙側腘繩肌腱并重建相對應的ACL，B組為Ad-GFP轉染重建組，C組為DMEM處理組。
1.2.2 Ad-hTGF-β1及Ad-GFP體外轉染腘繩肌腱
實驗動物術前禁飲食12h，以10%水合氯醛（0.3mL/100g）腹腔注射麻醉。于雙側脛骨結節內側約0.5cm處作長1.0cm縱切口，在股內側肌后方游離并切取腘繩肌腱，予以含青霉素的生理鹽水反復漂洗后置于6孔板，A、B組分別加入含有Ad-hTGF-β1、Ad-GFP的DMEM培養液（滴度為5×108PFU/mL），C組加入等量DMEM培養液，將培養板置于37℃、5%CO2、飽和濕度孵箱內培養12h。取A、B組轉染后肌腱行冰凍切片，熒光顯微鏡觀察其綠色熒光表達；取A組轉染后肌腱按照ELISA試劑盒說明，測定肌腱組織中的TGF-β1蛋白表達量。
1.2.3 ACL重建
術前準備及麻醉方法同上，從髕旁內側入路暴露膝關節（注意避開原切口），將髕骨推至外側，充分暴露并在上下止點處離斷ACL，行Lachman試驗及前抽屜試驗均為陽性。將處理后的腘繩肌腱折疊成雙股并予以尼龍線編織縫合，以ACL股骨側起點及脛骨側止點為標志，分別鉆取直徑1.5mm的股骨及脛骨骨隧道；將雙股腘繩肌腱導入骨隧道，于股骨及脛骨骨干距隧道外口約0.5cm處各鉆取一骨橋，懸吊法固定肌腱兩端，行Lachman試驗及前抽屜試驗均為陰性后逐層縫合。術后自由放養，予以青霉素20萬U肌肉注射1周預防感染。
1.2.4 大體觀察
各組分別于術后2、4、6、8周隨機取4只動物，采用空氣栓塞法處死并取雙側膝關節進行大體觀察。
1.2.5 實時熒光定量PCR檢測
采用預冷組織研磨器，將各組重建后的腘繩肌腱加入液氮快速研磨至粉末狀，按Trizol試劑盒說明提取肌腱組織總RNA，應用核酸蛋白檢測儀檢測少許RNA樣品的260 nm及280 nm處吸光度（A）值比值（A260/A280），以確定總RNA的濃度及純度，將剩余樣品按FastQuant RT kit說明書合成cDNA第一鏈。引物設計與合成由上海生工生物工程有限公司完成，引物序列（5'→3'）：hTGF-β1上游CTGTCCAACATGATCGTGCG，下游GACACAGAGATCCGCAG-TCC；GAPDH上游TGGTGAAGGTCGGAGTGAAC，下游TGCCGTGGGT-GGAATCATAC。按SuperReal PreMix Plus試劑盒說明書建立實時熒光定量PCR 20 μL反應體系；反應條件：95℃預變性15 min；95℃變性10 s，60℃退火32 s，72℃延伸30 s，40個循環。以2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。
1.2.6 Western
blot檢測 采用預冷組織研磨器，將各組重建后的腘繩肌腱加入液氮快速研磨至粉末狀。將粉末移至EP管中，加入混有蛋白酶抑制劑的裂解液，冰上靜置30 min，4℃、離心半徑3 cm、12000 r/min離心10 min，取上清即為組織總蛋白，取少量蛋白樣本進行BCA法蛋白定量。將剩余樣本加入蛋白上樣緩沖液并進行變性，同上法離心10min后4℃保存，制備濃度為15%的SDS-PAGE凝膠。取蛋白樣品20 μL上樣，行SDS-PAGE凝膠電泳后轉移至聚偏氟乙烯膜，室溫下脫脂奶粉封閉1.5h，予以鼠抗人TGF-β1單克隆抗體（1∶200）及鼠抗兔GAPDH單克隆抗體（1∶5 000），4℃下孵育過夜，TBST洗膜3次，室溫下加入辣根過氧化物酶標記羊抗鼠二抗抗體IgG（1∶2 000）孵育1 h，TBST洗膜3次。將聚偏氟乙烯膜置入發光液中孵育1 min，使用凝膠成像分析系統進行成像，采用Image J圖像分析軟件測定灰度值。
1.3 統計學方法
采用SPSS20.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 熒光顯微鏡觀察及ELISA檢測
A、B組轉染12 h后，熒光顯微鏡均可見綠色熒光表達（圖 1）。A組Ad-hTGF-β1轉染腘繩肌腱12h后，TGF-β1蛋白表達量為（221.0±12.2） ng/ mL，表明目的基因經腺病毒載體轉染腘繩肌腱后可有效表 達。
圖1
A、B組轉染12 h后熒光顯微鏡觀察（×200） ? A組 ? B 組
Figure1.
Fluorescence microscopy observation at 12 hours after transfected in groups A and B (×200) ? Group A ? Group B
2.2 大體觀察
術后各時間點各組膝關節周圍無紅腫及發熱，切口愈合良好，無感染跡象，關節腔內可見滑膜明顯增生，半月板未見明顯磨損或破裂，移植肌腱固定牢靠，張力良好。術后2周，可見移植肌腱與骨隧道間仍有間隙；4周，可見骨隧道內口有部分瘢痕組織填充；6周，可見骨隧道內口瘢痕組織填充較前增多；8 周，骨隧道內口可見大量瘢痕組織填充，外口有部分骨樣組織生長。
2.3 實時熒光定量PCR檢測
術后各時間點B、C組均未能檢測到hTGF-β1 mRNA表達；術后2、4、6、8周，A組hTGF-β1 mRNA相對表達量逐漸下降，分別為1.004±0.072、0.785± 0.038、0.469±0.053、0.172±0.021，各時間點間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。
2.4 Western blot檢測
術后各時間點B、C組TGF-β1蛋白條帶均為弱陽性，A組TGF-β1蛋白表達量均顯著高于B、C組，差異有統計學意義（P＜0.05），B、C組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。A組TGF-β1蛋白表達量隨時間延長逐漸降低，各時間點間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 2。
圖2
Western blot檢測各組轉染后各時間點TGF-β1蛋白表達 ? TGF-β1蛋白條帶 1：2周 2：4周 3：6周 4：8周 ? TGF-β1蛋白表達量
Figure2.
The expression of TGF-β1 protein by Western blot after transfection ? TGF-β1 protein bands 1: At 2 weeks 2: At 4weeks 3: At 6 weeks 4: At 8 weeks ? The expression of TGF-β1 protein
3 討論
生長因子能夠促進ACL重建后的腱-骨愈合，然而外源性生長因子的半衰期非常短（常為幾分鐘至幾小時），局部應用的最佳濃度難以確定，關節液的灌洗及蛋白酶類的水解作用也限制了其在ACL重建中的應用[10-11]。基因工程技術能延長生長因子的表達時間，為促進ACL重建的腱-骨愈合提供了新的思路。
3.1 TGF-β1基因的選擇
TGF-β1是具有多種生物學效應的多肽類物質，能調節細胞的增殖與分化，促進組織的生長與修復。TGF-β1能促進成纖維細胞的增殖，提高膠原蛋白、纖維連接蛋白的合成及細胞外基質的沉積，抑制新合成的細胞外基質降解[12-13]。Yamazaki等[14]應用犬自體屈肌腱進行ACL重建，將TGF-β1蛋白注射至骨隧道內，結果表明TGF-β1能促進骨隧道內Sharpy纖維及新骨的生成，提高移植肌腱的抗拉力負荷。還有研究將攜帶TGF-β1基因的質粒與脂質體的混合物注射至ACL重建的骨隧道內，其能促進成纖維細胞的增殖與膠原的合成，加速腱-骨界面組織結構的成熟，提高移植腱的力學性能[15]。因此，TGF-β1是能有效促進ACL重建術后腱-骨愈合的生長因子，TGF-β1基因可作為基因治療的目的基因。
3.2 腺病毒載體的選擇
腺病毒的病毒粒子相對穩定，故載體易于制備及純化，從而獲得較高的滴度及純度；腺病毒載體的基因容量較大且感染范圍廣，分裂期及靜止期的細胞均能被其感染；此外，目的基因不會被整合入宿主基因組，故不會有插入突變和導致惡性腫瘤的風險。因此，腺病毒是目前基因治療中應用最為廣泛的病毒載體[16-17]。其在ACL重建領域的應用也有相關報道，有研究以腺病毒為載體將TGF-β1及VEGF165基因轉染至BMSCs并應用于ACL重建，證實其對腱-骨愈合有促進作用[18]。但腺病毒載體仍有一些缺陷，如存在一定的免疫原性，會引起機體的免疫應答，目的基因表達的持續時間相對較短等。隨著對腺病毒載體相關研究的逐步深入，其不足得到了一定改進。
3.3 基因轉移的方式
目的基因轉移的方式包括體內基因轉移與體外基因轉移。其中，體外基因轉移具有更高的準確性、目的性和安全性。有研究將攜帶BMP-2基因的重組腺病毒載體（Ad-BMP-2）體外轉染兔的半腱肌并重建ACL，結果表明Ad-BMP-2能成功轉染半腱肌并能促進腱-骨愈合[19]。該實驗方法完成了基因的體外轉移，其實驗步驟較為精簡，實驗技術要求較低。本研究也采取體外基因轉移法，將自體腘繩肌腱置于含有Ad-hTGF-β1及Ad-GFP的培養基中進行培養，從而完成hTGF-β1基因的體外轉移。培養12h后熒光顯微鏡觀察示兩組均可見綠色熒光表達且無明顯差異，表明Ad-hTGF-β1及Ad-GFP在體外條件下均可成功轉染腘繩肌腱，其轉染效果無明顯差異。ELISA檢測示A組腘繩肌腱組織中有較高含量的TGF-β1蛋白，表明目的基因在轉染后能進行有效表達。
3.4 術后hTGF-β1基因的表達
由于腺病毒載體不會將目的基因整合至宿主的染色體，且腺病毒載體具有一定免疫原性從而在體內引起免疫應答，使得目的基因在體內表達的時間相對較短。然而，有研究將重組腺病毒載體直接注射至兔的髕腱，其表達時間可持續6周以上，這可能是因為肌腱組織血運較少，從而具有較低的免疫反應性[20]。ACL重建的骨隧道較為封閉，局部血運相對較差，使得局部免疫應答相對較弱，從而有利于目的基因在腱-骨界面的表達。本研究對術后各時間點hTGF-β1基因表達產物的檢測顯示，重組腺病毒載體組中的hTGF-β1基因表達產物可持續至術后第8周。這表明Ad-hTGF-β1能在體外條件下成功轉染腘繩肌腱，其在ACL重建術后能有效表達較長時間，為促進腱-骨愈合的基因治療提供了實驗依據。此外，本實驗結果還顯示hTGF-β1基因的表達隨時間推移逐漸減少，表明其在腱-骨界面的表達和作用是暫時的，不會引起膠原纖維、細胞外基質及骨質等過度增生。Western blot檢測示，各時間點B、C組TGF-β1蛋白條帶均為弱陽性，這可能是由于肌腱組織本身具有少量TGF-β1，而不同種屬來源的TGF-β1具有高度同源性。
綜上述，本研究初步表明，在腺病毒載體介導下，hTGF-β1基因能成功轉染至腘繩肌腱并能在ACL重建術后有效表達。但本實驗也存在一些缺陷和問題，如重組腺病毒載體與腺病毒空載體均能在體外成功轉染腘繩肌腱，但未對其轉染效率進行有效的定量分析；本實驗對hTGF-β1的檢測只持續至術后8周，其更長時間的表達情況及表達終止時間尚不清楚；目的基因的表達受多種因素調控，其表達產物發揮生物學效應也受多種因素的影響，這些具體機制需要進一步研究。
前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）損傷是常見運動損傷，由此引起膝關節生物力學改變，繼發關節軟骨退變和半月板損傷，從而促進創傷性關節炎的發生及進展[1-3]。關節鏡下進行ACL重建是目前主要的治療方法[4-5]。其中，自體腘繩肌腱是常用移植物，但其腱-骨愈合過程緩慢，而術后遠期療效主要取決于重建后腱-骨界面的愈合情況[6]，因此如何促進ACL重建后的腱-骨愈合是研究重點。生長因子在腱-骨愈合過程中起著重要作用[7-8]。我們的前期研究結果表明，以腺病毒載體介導人TGF-β1（human TGF-β1，hTGF-β1）基因轉染腘繩肌腱后重建ACL，可促進腱-骨愈合[9]，但術后hTGF-β1基因在體內的表達情況尚不清楚。本研究擬應用Ad-hTGF-β1轉染自體腘繩肌腱并重建兔ACL，采用實時熒光定量PCR及Western blot法檢測hTGF-β1基因在術后不同時間點的表達情況，為ACL重建的基因治療提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物與主要試劑、儀器
15～20月齡雄性新西蘭大白兔48只，體質量（2.0±0.4）kg，由南華大學動物實驗部提供。實驗動物雙側后肢膝關節均無腫脹，前抽屜試驗及Lachman試驗陰性。
重組腺病毒載體Ad-hTGF-β1與腺病毒空載體Ad-綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）由上海和元生物公司完成病毒的構建、鑒定及滴度測定。ELISA試劑盒（長沙湘宇生物技術有限公司）；FastQuant RT kit及SuperReal PreMix Plus試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；鼠抗人TGF-β1單克隆抗體（Santa Cruz公司，美國）；鼠抗兔GAPDH單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記羊抗鼠二抗抗體IgG（Bioworld公司，美國）。核酸蛋白檢測儀（Eppendorf公司，德國）；凝膠成像分析系統（Bio-Rad公司，美國）；實時熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司，美國）；Image J圖像分析軟件（National Institutes of Health，美國）。
1.2 實驗方法
1.2.1 實驗分組
將48只新西蘭大白兔隨機分為A、B、C 3組，每組16只。A組以Ad-hTGF-β1轉染雙側腘繩肌腱并重建相對應的ACL，B組為Ad-GFP轉染重建組，C組為DMEM處理組。
1.2.2 Ad-hTGF-β1及Ad-GFP體外轉染腘繩肌腱
實驗動物術前禁飲食12h，以10%水合氯醛（0.3mL/100g）腹腔注射麻醉。于雙側脛骨結節內側約0.5cm處作長1.0cm縱切口，在股內側肌后方游離并切取腘繩肌腱，予以含青霉素的生理鹽水反復漂洗后置于6孔板，A、B組分別加入含有Ad-hTGF-β1、Ad-GFP的DMEM培養液（滴度為5×108PFU/mL），C組加入等量DMEM培養液，將培養板置于37℃、5%CO2、飽和濕度孵箱內培養12h。取A、B組轉染后肌腱行冰凍切片，熒光顯微鏡觀察其綠色熒光表達；取A組轉染后肌腱按照ELISA試劑盒說明，測定肌腱組織中的TGF-β1蛋白表達量。
1.2.3 ACL重建
術前準備及麻醉方法同上，從髕旁內側入路暴露膝關節（注意避開原切口），將髕骨推至外側，充分暴露并在上下止點處離斷ACL，行Lachman試驗及前抽屜試驗均為陽性。將處理后的腘繩肌腱折疊成雙股并予以尼龍線編織縫合，以ACL股骨側起點及脛骨側止點為標志，分別鉆取直徑1.5mm的股骨及脛骨骨隧道；將雙股腘繩肌腱導入骨隧道，于股骨及脛骨骨干距隧道外口約0.5cm處各鉆取一骨橋，懸吊法固定肌腱兩端，行Lachman試驗及前抽屜試驗均為陰性后逐層縫合。術后自由放養，予以青霉素20萬U肌肉注射1周預防感染。
1.2.4 大體觀察
各組分別于術后2、4、6、8周隨機取4只動物，采用空氣栓塞法處死并取雙側膝關節進行大體觀察。
1.2.5 實時熒光定量PCR檢測
采用預冷組織研磨器，將各組重建后的腘繩肌腱加入液氮快速研磨至粉末狀，按Trizol試劑盒說明提取肌腱組織總RNA，應用核酸蛋白檢測儀檢測少許RNA樣品的260 nm及280 nm處吸光度（A）值比值（A260/A280），以確定總RNA的濃度及純度，將剩余樣品按FastQuant RT kit說明書合成cDNA第一鏈。引物設計與合成由上海生工生物工程有限公司完成，引物序列（5'→3'）：hTGF-β1上游CTGTCCAACATGATCGTGCG，下游GACACAGAGATCCGCAG-TCC；GAPDH上游TGGTGAAGGTCGGAGTGAAC，下游TGCCGTGGGT-GGAATCATAC。按SuperReal PreMix Plus試劑盒說明書建立實時熒光定量PCR 20 μL反應體系；反應條件：95℃預變性15 min；95℃變性10 s，60℃退火32 s，72℃延伸30 s，40個循環。以2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。
1.2.6 Western
blot檢測 采用預冷組織研磨器，將各組重建后的腘繩肌腱加入液氮快速研磨至粉末狀。將粉末移至EP管中，加入混有蛋白酶抑制劑的裂解液，冰上靜置30 min，4℃、離心半徑3 cm、12000 r/min離心10 min，取上清即為組織總蛋白，取少量蛋白樣本進行BCA法蛋白定量。將剩余樣本加入蛋白上樣緩沖液并進行變性，同上法離心10min后4℃保存，制備濃度為15%的SDS-PAGE凝膠。取蛋白樣品20 μL上樣，行SDS-PAGE凝膠電泳后轉移至聚偏氟乙烯膜，室溫下脫脂奶粉封閉1.5h，予以鼠抗人TGF-β1單克隆抗體（1∶200）及鼠抗兔GAPDH單克隆抗體（1∶5 000），4℃下孵育過夜，TBST洗膜3次，室溫下加入辣根過氧化物酶標記羊抗鼠二抗抗體IgG（1∶2 000）孵育1 h，TBST洗膜3次。將聚偏氟乙烯膜置入發光液中孵育1 min，使用凝膠成像分析系統進行成像，采用Image J圖像分析軟件測定灰度值。
1.3 統計學方法
采用SPSS20.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 熒光顯微鏡觀察及ELISA檢測
A、B組轉染12 h后，熒光顯微鏡均可見綠色熒光表達（圖 1）。A組Ad-hTGF-β1轉染腘繩肌腱12h后，TGF-β1蛋白表達量為（221.0±12.2） ng/ mL，表明目的基因經腺病毒載體轉染腘繩肌腱后可有效表 達。
圖1
A、B組轉染12 h后熒光顯微鏡觀察（×200） ? A組 ? B 組
Figure1.
Fluorescence microscopy observation at 12 hours after transfected in groups A and B (×200) ? Group A ? Group B
2.2 大體觀察
術后各時間點各組膝關節周圍無紅腫及發熱，切口愈合良好，無感染跡象，關節腔內可見滑膜明顯增生，半月板未見明顯磨損或破裂，移植肌腱固定牢靠，張力良好。術后2周，可見移植肌腱與骨隧道間仍有間隙；4周，可見骨隧道內口有部分瘢痕組織填充；6周，可見骨隧道內口瘢痕組織填充較前增多；8 周，骨隧道內口可見大量瘢痕組織填充，外口有部分骨樣組織生長。
2.3 實時熒光定量PCR檢測
術后各時間點B、C組均未能檢測到hTGF-β1 mRNA表達；術后2、4、6、8周，A組hTGF-β1 mRNA相對表達量逐漸下降，分別為1.004±0.072、0.785± 0.038、0.469±0.053、0.172±0.021，各時間點間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。
2.4 Western blot檢測
術后各時間點B、C組TGF-β1蛋白條帶均為弱陽性，A組TGF-β1蛋白表達量均顯著高于B、C組，差異有統計學意義（P＜0.05），B、C組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。A組TGF-β1蛋白表達量隨時間延長逐漸降低，各時間點間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 2。
圖2
Western blot檢測各組轉染后各時間點TGF-β1蛋白表達 ? TGF-β1蛋白條帶 1：2周 2：4周 3：6周 4：8周 ? TGF-β1蛋白表達量
Figure2.
The expression of TGF-β1 protein by Western blot after transfection ? TGF-β1 protein bands 1: At 2 weeks 2: At 4weeks 3: At 6 weeks 4: At 8 weeks ? The expression of TGF-β1 protein
3 討論
生長因子能夠促進ACL重建后的腱-骨愈合，然而外源性生長因子的半衰期非常短（常為幾分鐘至幾小時），局部應用的最佳濃度難以確定，關節液的灌洗及蛋白酶類的水解作用也限制了其在ACL重建中的應用[10-11]。基因工程技術能延長生長因子的表達時間，為促進ACL重建的腱-骨愈合提供了新的思路。
3.1 TGF-β1基因的選擇
TGF-β1是具有多種生物學效應的多肽類物質，能調節細胞的增殖與分化，促進組織的生長與修復。TGF-β1能促進成纖維細胞的增殖，提高膠原蛋白、纖維連接蛋白的合成及細胞外基質的沉積，抑制新合成的細胞外基質降解[12-13]。Yamazaki等[14]應用犬自體屈肌腱進行ACL重建，將TGF-β1蛋白注射至骨隧道內，結果表明TGF-β1能促進骨隧道內Sharpy纖維及新骨的生成，提高移植肌腱的抗拉力負荷。還有研究將攜帶TGF-β1基因的質粒與脂質體的混合物注射至ACL重建的骨隧道內，其能促進成纖維細胞的增殖與膠原的合成，加速腱-骨界面組織結構的成熟，提高移植腱的力學性能[15]。因此，TGF-β1是能有效促進ACL重建術后腱-骨愈合的生長因子，TGF-β1基因可作為基因治療的目的基因。
3.2 腺病毒載體的選擇
腺病毒的病毒粒子相對穩定，故載體易于制備及純化，從而獲得較高的滴度及純度；腺病毒載體的基因容量較大且感染范圍廣，分裂期及靜止期的細胞均能被其感染；此外，目的基因不會被整合入宿主基因組，故不會有插入突變和導致惡性腫瘤的風險。因此，腺病毒是目前基因治療中應用最為廣泛的病毒載體[16-17]。其在ACL重建領域的應用也有相關報道，有研究以腺病毒為載體將TGF-β1及VEGF165基因轉染至BMSCs并應用于ACL重建，證實其對腱-骨愈合有促進作用[18]。但腺病毒載體仍有一些缺陷，如存在一定的免疫原性，會引起機體的免疫應答，目的基因表達的持續時間相對較短等。隨著對腺病毒載體相關研究的逐步深入，其不足得到了一定改進。
3.3 基因轉移的方式
目的基因轉移的方式包括體內基因轉移與體外基因轉移。其中，體外基因轉移具有更高的準確性、目的性和安全性。有研究將攜帶BMP-2基因的重組腺病毒載體（Ad-BMP-2）體外轉染兔的半腱肌并重建ACL，結果表明Ad-BMP-2能成功轉染半腱肌并能促進腱-骨愈合[19]。該實驗方法完成了基因的體外轉移，其實驗步驟較為精簡，實驗技術要求較低。本研究也采取體外基因轉移法，將自體腘繩肌腱置于含有Ad-hTGF-β1及Ad-GFP的培養基中進行培養，從而完成hTGF-β1基因的體外轉移。培養12h后熒光顯微鏡觀察示兩組均可見綠色熒光表達且無明顯差異，表明Ad-hTGF-β1及Ad-GFP在體外條件下均可成功轉染腘繩肌腱，其轉染效果無明顯差異。ELISA檢測示A組腘繩肌腱組織中有較高含量的TGF-β1蛋白，表明目的基因在轉染后能進行有效表達。
3.4 術后hTGF-β1基因的表達
由于腺病毒載體不會將目的基因整合至宿主的染色體，且腺病毒載體具有一定免疫原性從而在體內引起免疫應答，使得目的基因在體內表達的時間相對較短。然而，有研究將重組腺病毒載體直接注射至兔的髕腱，其表達時間可持續6周以上，這可能是因為肌腱組織血運較少，從而具有較低的免疫反應性[20]。ACL重建的骨隧道較為封閉，局部血運相對較差，使得局部免疫應答相對較弱，從而有利于目的基因在腱-骨界面的表達。本研究對術后各時間點hTGF-β1基因表達產物的檢測顯示，重組腺病毒載體組中的hTGF-β1基因表達產物可持續至術后第8周。這表明Ad-hTGF-β1能在體外條件下成功轉染腘繩肌腱，其在ACL重建術后能有效表達較長時間，為促進腱-骨愈合的基因治療提供了實驗依據。此外，本實驗結果還顯示hTGF-β1基因的表達隨時間推移逐漸減少，表明其在腱-骨界面的表達和作用是暫時的，不會引起膠原纖維、細胞外基質及骨質等過度增生。Western blot檢測示，各時間點B、C組TGF-β1蛋白條帶均為弱陽性，這可能是由于肌腱組織本身具有少量TGF-β1，而不同種屬來源的TGF-β1具有高度同源性。
綜上述，本研究初步表明，在腺病毒載體介導下，hTGF-β1基因能成功轉染至腘繩肌腱并能在ACL重建術后有效表達。但本實驗也存在一些缺陷和問題，如重組腺病毒載體與腺病毒空載體均能在體外成功轉染腘繩肌腱，但未對其轉染效率進行有效的定量分析；本實驗對hTGF-β1的檢測只持續至術后8周，其更長時間的表達情況及表達終止時間尚不清楚；目的基因的表達受多種因素調控，其表達產物發揮生物學效應也受多種因素的影響，這些具體機制需要進一步研究。
