引用本文： 李爭爭, 趙軍偉, 移志剛, 羅偉, 李康, 汪玉良, 汪靜, 安麗萍, 馬靖林. 腦信號蛋白3A在創傷性顱腦損傷伴脛骨骨折愈合過程中的表達變化. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(10): 1225-1232. doi: 10.7507/1002-1892.20160251 復制
腦信號蛋白3A（Semaphorin 3A，Sema3A）屬于信號素家族中Ⅲ型分泌型蛋白，在神經損傷后少突膠質細胞的定向遷移及軸突再生中發揮重要作用。近年來，Sema3A在骨穩態和骨重建方面的研究越來越多，Hayashi等[1]發現Sema3A在成骨細胞中表達，是目前發現的唯一雙重調節成骨細胞和破骨細胞的因子；Fukuda等[2]發現神經元分泌的Sema3A通過間接調控骨小梁感覺神經分布來調節骨重塑，而不是直接作用于成骨細胞，獨立于局部Sema3A的功能。同時，Hashimoto等[3]發現脊髓橫斷后，對側大腦皮質和患側三叉神經脊束核Sema3A表達上調；Zhang等[4]發現創傷性顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）患者血液中Sema3A濃度上升。TBI后骨折愈合過程中軟骨痂生成較多，骨小梁排列疏松、結構紊亂，生物力學強度下降，為病理性骨痂，導致骨折愈合時間延長，甚至骨折不愈合。骨折愈合涉及神經纖維的生成及細胞分化等過程，Sema3A參與調節骨骼神經纖維的長入以及軟骨細胞、成骨細胞分化的調節，且Sema3A受神經損傷調控[1, 3-7]。因此，Sema3A在骨折愈合時骨痂中的表達變化可能與TBI及病理性骨痂生成存在密切關系。本實驗通過創建TBI合并脛骨骨折模型，探索Sema3A在神經損傷后骨折愈合過程中的表達變化及作用機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
8～10周齡SPF級健康成年雌性Wistar大鼠192只，體質量220～250g，購于甘肅中醫藥大學動物實驗中心。
兔抗大鼠Sema3A一抗（Santa Cruz公司，美國）；β-actin一抗、超敏二步法免疫組織化學檢測試劑盒、辣根過氧化酶標記山羊抗兔二抗、小鼠抗β-actin二抗、山羊血清、載玻片（北京中杉金橋生物工程有限公司）。光學顯微鏡、體視顯微鏡（Olympus公司，日本）；AI600超敏多功能成像儀（GE公司，美國）。
1.2 實驗方法
1.2.1 實驗分組
將192只大鼠隨機分為4組，每組48只，分別為脛骨骨折組（A組）、TBI組（B組）、TBI合并脛骨骨折組（C組）和對照組（D組）。
1.2.2 模型建立
① 右側脛骨骨折模型：取A、C組大鼠以2%戊巴比妥鈉溶液（0.2 mL/100 g）腹腔注射麻醉，右側脛骨備皮。脛骨上段縱向切口，暴露脛骨，于脛骨粗隆鉆孔，將1.0 mm克氏針插入脛骨髓腔；于脛骨中上1/3處橫斷脛骨，克氏針自鉆孔順行插入骨折遠端。確認對位對線良好、固定牢靠后，剪斷多余克氏針，逐層縫合。
② TBI模型：將Feeney法自由落體顱腦損傷裝置適當改進后制備TBI模型[8]。取B、C組大鼠，同上法麻醉，沿大鼠顱腦正中線頭皮切口，暴露右側額骨，體視顯微鏡下使用牙科磨鉆于矢狀縫右側、冠狀縫尾側區域內開窗，直徑約6 mm，保持硬腦膜完整。安裝打擊裝置，打擊棒下端正對骨窗，打擊棒35 g，打擊高度40 cm，垂直落下造成腦損傷，明膠海綿局部止血，縫合頭皮[9]。術后1 d待麻醉完全蘇醒后，按照改良神經功能損傷（NSS）評分[10]，評估TBI模型，均需達到中重度顱腦損傷。
1.3 觀測指標
1.3.1 HE染色觀察
各組分別于術后3、5、7、14、21、28 d頸椎脫臼處死8只大鼠，A、C組自大鼠骨折斷端上下各0.5 cm處剪斷，B、D組取相應部位脛骨，4%多聚甲醛固定，15%EDTA-2Na脫鈣，常規石蠟切片，行HE染色觀察A、C組骨痂形態結構與細胞種類，以及B、D組右側脛骨相同部位骨膜、皮質、骨小梁及骨髓腔變化。
1.3.2 免疫組織化學染色觀察
各組于各時間點取部分切片，按照免疫組織化學染色試劑盒說明書，行Sema3A免疫組織化學染色。于200倍鏡下每張切片每個目標區域選取5個不同且不重疊的視野計數陽性細胞，Sema3A陽性染色表現為細胞膜或細胞質呈棕黃色或棕褐色染色，軟骨細胞體積大，較易觀察；成骨細胞體積較小，不易觀察，為骨小梁周圍棕黃色或棕褐色條帶，條帶內成骨細胞核計數即為成骨細胞陽性細胞數。
1.3.3 Western
blot檢測Sema3A蛋白表達 各時間點A、C組自大鼠骨折斷端上下各0.5 cm處剪斷，B、D組取相應部位脛骨，沖洗骨髓腔，低溫液氮下研磨骨組織至粉末狀；加入1%Triton X-100裂解液[11]冰上裂解2 h，4℃以離心半徑6 cm、12 000 r/min離心30 min，吸取上清行BCA蛋白定量；加蛋白上樣緩沖液煮沸，用于免疫蛋白印跡。經配膠、電泳、轉膜、封閉、孵育抗體后，添加化學發光液，超敏多功能成像儀采集圖像，Image J圖像分析軟件分析圖像，以Sema3A/β-actin比值作為Sema3A蛋白相對表達 量。
1.4 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 HE染色觀察
D組各時間點骨小梁未見明顯異常，無紊亂及斷裂，骨膜完整，骨皮質中骨細胞分布、大小均勻（圖 1 a）。術后3、5 d，B組與D組相比無明顯差異；A、C組骨折線清晰可見，骨折斷端無明顯骨痂生長，可見炎性細胞及纖維組織填充。7 d，A組骨折斷端可見纖維組織自骨膜下向斷端間隙生長，骨外膜軟骨細胞增生，新生軟骨細胞體積較小、排列緊密（圖 1 b）；B組骨膜稍紊亂，骨膜下骨皮質輕度增生，骨小梁未見明顯異常（圖 1 c）；C組骨折斷端被纖維組織填充，骨折斷端骨外膜下軟骨細胞增生，新生軟骨細胞體積較大，排列較疏松（圖 1 d）。14 d，A組可見骨外膜軟骨細胞增生填充骨折斷端，生成軟骨痂，骨痂中軟骨細胞排列規則，軟骨痂致密、類骨質較少（圖 1 e），軟骨痂向骨折斷端中心長入，出現新生骨小梁，排列緊密，周圍可見較多成骨細胞生成；B組骨膜平整，骨膜下可見輕度增生新生骨小梁及類骨質（圖 1 f）；C組骨折斷端骨外膜下軟骨痂增生，軟骨細胞排列疏松，類骨質較多（圖 1 g），軟骨痂向骨折斷端長入，新生骨小梁出現，周圍可見少量成骨細胞。21d，A組可見軟骨痂逐漸消失被成熟骨小梁代替，新生骨小梁排列緊密、密度高（圖 1 h）；B組骨膜平整、連續，骨膜下新生骨小梁及類骨質消失，骨皮質中骨細胞分布正常（圖 1 i）；C組軟骨痂被新生骨小梁代替，骨小梁排列較疏松、密度低，殘存少量軟骨細胞及類骨質（圖 1 j）。28 d，A、C組骨折線均模糊，A組骨折處愈合良好，骨痂范圍縮小，骨小梁排列緊密規則；C組可見大量肥厚性骨痂向外膨脹性生長，骨痂面積明顯大于A組，骨小梁結構疏松，排列紊亂；B組無明顯異常。
圖1
術后各時間點各組HE染色觀察（×200） ? D組7 d ? A組7 d ? B組7d ? C組7 d ? A組14 d ? B組14 d ? C組14 d ? A組21 d ? B組21 d ? C組21 d
Figure1.
HE staining observation in 4 groups at different time points after operation (HE×200) ? Group D at 7 days ? Group A at 7 days ? Group B at 7 days
? Group C at 7 days ? Group A at 14 days ? Group B at 14 days ? Group C at 14 days
? Group A at 21 days ? Group B at 21 days ?Group C at 21 days
2.2 免疫組織化學染色觀察
D組各時間點Sema3A陽性染色無明顯差異，主要表達于骨膜、骨小梁周圍成骨細胞及骨髓細胞（圖 2 a）。術后3、5 d，A、C組Sema3A陽性染色主要表達于骨折斷端少量纖維組織及骨髓細胞，B組主要表達于骨膜、骨小梁及骨髓細胞。7 d，A組Sema3A陽性染色在骨折斷端骨外膜下增生的軟骨細胞無明顯表達（圖 2 b）；B組主要表達于骨膜、骨小梁周圍成骨細胞及骨髓細胞（圖 2 c）；C組主要表達于骨折斷端骨外膜下增生的軟骨細胞（圖 2 d）。14d，A組Sema3A陽性染色在骨外膜軟骨細胞少量表達（圖 2 e），而在骨折斷端新生骨小梁周圍成骨細胞表達明顯增多（圖 2 f）；B組主要表達于骨膜、骨膜下新生骨小梁周圍的成骨細胞（圖 2 g）；C組在骨外膜軟骨細胞表達明顯增多（圖 2 h），而在骨折斷端新生骨小梁周圍成骨細胞表達較少（圖 2 i）。21 d，A組Sema3A陽性染色在骨小梁周圍成骨細胞表達較多（圖 2 j）；B組主要表達于骨膜、骨小梁周圍的成骨細胞及骨髓（圖 2 k）；C組在骨小梁周圍成骨細胞表達較少，在殘存骨痂中軟骨細胞繼續表達（圖 2 l）。28d，A組Sema3A陽性染色表達于骨小梁周圍成骨細胞；B組主要表達于骨膜及骨髓；C組表達于骨小梁周圍成骨細胞。
圖2
術后各時間點各組免疫組織化學染色觀察（×200） ? D組7 d ? A組7 d ? B組7 d ? C組7 d ? A組14 d軟骨痂中軟骨細胞 ? A組14 d新生骨小梁周圍成骨細胞 ? B組14 d ? C組14 d軟骨痂中軟骨細胞 ? C組14 d新生骨小梁周圍成骨細胞 ? A組21 d ? B組21 d ? C組21 d
Figure2.
Immunohistochemistry staining in 4 groups different time points after operation ? Group D at 7 days ? Group A at 7days ? Group B at 7 days ? Group C at 7 days ? Group A at 14 days,showing chondrocyte in osteoid callus ? Group A at 14 days,showing osteoblasts in new bone trabecula ? Group B at 14 days ? Group C at 14 days,showing chondrocyte in osteoid callus ? Group C at 14 days showing osteoblasts in new bone trabecula ? Group A at 21 days ? Group B at 21 days ? Group C at 21 days
由于B、D組無骨折，無骨痂生成，B、D組Sema3A陽性染色僅在7、14 d時在骨膜、骨膜下新生骨小梁周圍的成骨細胞觀察到輕微變化，故只比較了A、C組的統計學結果。而3、5 d骨折斷端為血腫、炎性細胞及少許纖維組織，無骨痂或軟骨細胞生成，故未納入統計比較。7 d時A、C組骨折斷端骨膜下軟骨細胞增生較多，未見成骨細胞生成；28 d時A、C組骨折線均模糊，軟骨痂被骨小梁代替，無殘存軟骨細胞。故最終只統計了A、C組14、21 d的軟骨細胞和成骨細胞陽性表達數以及7 d的軟骨細胞陽性表達數和28 d的成骨細胞陽性表達數。結果顯示，7、14、21 d C組軟骨細胞陽性表達數均顯著高于A組，14、21d成骨細胞陽性表達數均顯著低于A組，差異均有統計學意義（P＜0.01）；28 d時A、C組間比較軟骨細胞及成骨細胞陽性表達數，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。
表1
術后各時間點A、C組Sema3A免疫組織化學染色陽性細胞計數（n=8，x±s）
Table1.
Positive cells of Sema3A of groups A and C at different time points after operation by immunohistochemistry staining（n=8，x±s）
2.3 Western blot檢測Sema3A蛋白表達
D組各時間點Sema3A蛋白表達無明顯變化；A組Sema3A蛋白表達于術后5 d逐漸升高，14 d達高峰后逐漸下降，28 d恢復正常；B組Sema3A蛋白表達于術后7 d逐漸升高，14 d達高峰，21 d逐漸下降，28 d恢復正常；C組Sema3A蛋白表達于術后5 d逐漸升高，14 d達高峰后緩慢下降，28 d仍在較高水平。見圖 3。
圖3
Western blot檢測術后各時間點各組Sema3A蛋白表達 1：3d 2：5 d 3：7 d 4：14 d 5：21 d 6：28 d
Figure3.
Expression of Sema 3A protein in 4 groups at different time points by Western blot 1: At 3 days 2: At 5 days 3: At 7 days 4: At 14 days 5: At 21 days 6: At 28 days
術后3、5 d各組Sema3A蛋白相對表達量比較差異無統計學意義（P＞0.05）。7 d，A、B、C組Sema3A蛋白相對表達量明顯高于D組，C組高于A、B組，A組高于B組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。14 d，A、B、C組Sema3A蛋白相對表達量較D組進一步升高，A、C組高于B組，C組高于A組，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。21 d，A組Sema3A蛋白相對表達量迅速下降，顯著低于B、C組，接近D組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；B、C組顯著高于D組，C組高于B組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。28d，C組Sema3A蛋白相對表達量仍顯著高于其余3組，B組高于A、D組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；A、D組間差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 2。
表2
Western blot檢測術后各時間點各組Sema3A蛋白相對表達量（n=8，x±s）
Table2.
Protein expression of Sema3A at different time points in each group by Western blot（n=8，x±s）
3 討論
Sema最早于1993年在研究神經生長錐的導向因子時被發現，Sema3A作為Sema家族最典型且最早被確定的神經導向因子，除了在神經損傷后少突膠質細胞的定向遷移及軸突再生中發揮重要作用，在免疫應答、心血管系統的形成以及腫瘤的發生等方面也發揮著重要作用[12, 13, 14, 15, 16]；同時，越來越多研究也發現Sema3A參與骨重建與骨重塑[1, 2]。
Okubo等[7]發現在人骨性關節炎中，Sema3A在軟骨細胞表達較正常軟骨顯著升高，并且其表達與軟骨細胞克隆密切相關，通過抑制VEGF165介導的軟骨細胞遷移而促進軟骨細胞克隆。軟骨細胞克隆是軟骨細胞在受損部位增殖以完成局部修復，但細胞不能自由移動到其他地方，最終發育成軟骨細胞群。本研究中，骨折愈合原始骨痂形成期，Sema3A在C組骨外膜軟骨痂軟骨細胞中表達顯著高于A組，可能同樣引起軟骨細胞在局部的過度增殖，具體機制尚不清楚。Gomez等[6]研究發現，體外培養成骨細胞和軟骨細胞分化時表達Sema3A信號系統的許多分子，Sema3A亦可能參與了軟骨細胞的分化。因此Sema3A在軟骨細胞過表達，促進軟骨細胞過度增生、分化，可能是TBI后骨折愈合中軟骨痂異常增多的原因之一。
Gomez等[6]發現在體內神經、血管侵入軟骨內骨化中心前，Sema3A表達于骨化中心的前肥大和肥大軟骨細胞，Sema3A在時間和空間模式上的表達平行于骨組織的神經支配、甚至更早，表明軟骨細胞表達Sema3A信號系統，是骨化中心的神經和血管能夠有序長入所必需的。健康椎間盤內無血管和神經纖維，椎間盤變性過程中有傷害性神經纖維和血管由變性椎間盤外向內生長，這可能與疼痛有關[17]。Tolofari等[18]在研究椎間盤變性中發現Sema3A在健康椎間盤內充當神經長入的屏障，主要高度表達在外纖維環，而變性椎間盤在這一區域顯著下降。Tanelian等[19]在成年兔角膜上皮細胞轉染Sema3A，可排斥三叉神經感覺神經的傳入。以上研究均提示，Sema3A在局部的高表達可能影響神經纖維在組織局部的長入。Behar等[20]研究發現，Sema3A基因敲除小鼠出現軟骨結構異常、椎體融合、部分肋骨重合等骨發育異常。Fukuda等[2]發現神經元分泌的Sema3A與觀察到的骨量異常有關，獨立于骨局部的Sema3A作用，進一步研究表明神經元通過自分泌Sema3A調節感覺神經纖維在骨小梁的分布。提示感覺神經元分泌的Sema3A調節骨發育通過調節感覺神經纖維在骨小梁的分布間接調節骨重塑，而不是直接作用于成骨細胞。因此，TBI后骨折愈合過程中，軟骨細胞過表達Sema3A，局部異常表達的Sema3A可能排斥感覺神經纖維在骨痂部位的長入，感覺神經支配減少后，由感覺神經纖維自分泌的Sema3A介導的新生感覺神經纖維進一步減少，引起參與骨調節的相關神經肽的分泌異常，可能是TBI后骨折愈合過程中軟骨痂異常增多的原因之一。屈墨羱等[21]在骨質疏松大鼠骨折模型的骨折局部給予注射Sema3A，發現能促進骨折愈合中期骨痂形成，縮短骨痂形成周期，進一步印證了Sema3A可介導軟骨痂異常增多。
Hayashi等[1]研究發現Sema3A 在成骨細胞中表達，雙重調節破骨細胞和成骨細胞，進一步研究發現Sema3A主要通過與其受體Nrp-1結合，阻斷下游的ITAM和Rho A信號通路，抑制RANKL誘導的破骨細胞分化，通過經典的Wnt 3a-β-catenin-Runx2蛋白信號通路促進成骨細胞分化。邱雨等[22]在Sema3A對成牙骨質細胞系增殖和礦化功能研究中發現，Sema3A通過抑制骨鈣素和Runx2基因表達，從而抑制細胞的礦化能力，成牙骨質細胞與成骨細胞有相似之處，兩者均與礦化有關。本研究中，C組Sema3A在軟骨痂新生骨小梁周圍的成骨細胞表達明顯低于A組，Sema3A成骨細胞分化降低，這可能是TBI后骨折愈合時骨小梁排列疏松、骨痂生物力學強度差、軟骨痂向硬骨痂轉換障礙的原因之一。
綜上述，Sema3A在TBI后骨折愈合過程中，在軟骨痂中軟骨細胞高表達、新生骨小梁周圍成骨細胞低表達，可能通過影響軟骨細胞分化、增生，排斥軟骨痂骨化中心內感覺神經纖維長入，未能及時調控成骨細胞分化促進新生骨小梁成熟，是導致TBI后骨折愈合時軟骨痂生成較多、新生骨小梁排列疏松、骨痂生物強度降低的原因之一。通過對TBI后骨折愈合過程中Sema3A在空間和時間表達模式上的研究發現，Sema3A可能在TBI后的骨折愈合中發揮了重要作用。Nrp-1是Sema3A的功能性受體[23]，目前對于Sema3A及Nrp-1的相關研究中報道的阻滯劑，如SICHI[24]、decorin[25]、Nrp-1抑制肽[26]等均不理想，進行相關干預后未進一步觀察軟骨細胞、成骨細胞、感覺神經纖維分布等的變化，為本研究不足之處，但為后續相關干預提供了初步的理論基礎。隨著對Sema3A及其阻滯劑的進一步研究，將為TBI后骨折愈合的治療提供更多理論依據。
腦信號蛋白3A（Semaphorin 3A，Sema3A）屬于信號素家族中Ⅲ型分泌型蛋白，在神經損傷后少突膠質細胞的定向遷移及軸突再生中發揮重要作用。近年來，Sema3A在骨穩態和骨重建方面的研究越來越多，Hayashi等[1]發現Sema3A在成骨細胞中表達，是目前發現的唯一雙重調節成骨細胞和破骨細胞的因子；Fukuda等[2]發現神經元分泌的Sema3A通過間接調控骨小梁感覺神經分布來調節骨重塑，而不是直接作用于成骨細胞，獨立于局部Sema3A的功能。同時，Hashimoto等[3]發現脊髓橫斷后，對側大腦皮質和患側三叉神經脊束核Sema3A表達上調；Zhang等[4]發現創傷性顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）患者血液中Sema3A濃度上升。TBI后骨折愈合過程中軟骨痂生成較多，骨小梁排列疏松、結構紊亂，生物力學強度下降，為病理性骨痂，導致骨折愈合時間延長，甚至骨折不愈合。骨折愈合涉及神經纖維的生成及細胞分化等過程，Sema3A參與調節骨骼神經纖維的長入以及軟骨細胞、成骨細胞分化的調節，且Sema3A受神經損傷調控[1, 3-7]。因此，Sema3A在骨折愈合時骨痂中的表達變化可能與TBI及病理性骨痂生成存在密切關系。本實驗通過創建TBI合并脛骨骨折模型，探索Sema3A在神經損傷后骨折愈合過程中的表達變化及作用機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
8～10周齡SPF級健康成年雌性Wistar大鼠192只，體質量220～250g，購于甘肅中醫藥大學動物實驗中心。
兔抗大鼠Sema3A一抗（Santa Cruz公司，美國）；β-actin一抗、超敏二步法免疫組織化學檢測試劑盒、辣根過氧化酶標記山羊抗兔二抗、小鼠抗β-actin二抗、山羊血清、載玻片（北京中杉金橋生物工程有限公司）。光學顯微鏡、體視顯微鏡（Olympus公司，日本）；AI600超敏多功能成像儀（GE公司，美國）。
1.2 實驗方法
1.2.1 實驗分組
將192只大鼠隨機分為4組，每組48只，分別為脛骨骨折組（A組）、TBI組（B組）、TBI合并脛骨骨折組（C組）和對照組（D組）。
1.2.2 模型建立
① 右側脛骨骨折模型：取A、C組大鼠以2%戊巴比妥鈉溶液（0.2 mL/100 g）腹腔注射麻醉，右側脛骨備皮。脛骨上段縱向切口，暴露脛骨，于脛骨粗隆鉆孔，將1.0 mm克氏針插入脛骨髓腔；于脛骨中上1/3處橫斷脛骨，克氏針自鉆孔順行插入骨折遠端。確認對位對線良好、固定牢靠后，剪斷多余克氏針，逐層縫合。
② TBI模型：將Feeney法自由落體顱腦損傷裝置適當改進后制備TBI模型[8]。取B、C組大鼠，同上法麻醉，沿大鼠顱腦正中線頭皮切口，暴露右側額骨，體視顯微鏡下使用牙科磨鉆于矢狀縫右側、冠狀縫尾側區域內開窗，直徑約6 mm，保持硬腦膜完整。安裝打擊裝置，打擊棒下端正對骨窗，打擊棒35 g，打擊高度40 cm，垂直落下造成腦損傷，明膠海綿局部止血，縫合頭皮[9]。術后1 d待麻醉完全蘇醒后，按照改良神經功能損傷（NSS）評分[10]，評估TBI模型，均需達到中重度顱腦損傷。
1.3 觀測指標
1.3.1 HE染色觀察
各組分別于術后3、5、7、14、21、28 d頸椎脫臼處死8只大鼠，A、C組自大鼠骨折斷端上下各0.5 cm處剪斷，B、D組取相應部位脛骨，4%多聚甲醛固定，15%EDTA-2Na脫鈣，常規石蠟切片，行HE染色觀察A、C組骨痂形態結構與細胞種類，以及B、D組右側脛骨相同部位骨膜、皮質、骨小梁及骨髓腔變化。
1.3.2 免疫組織化學染色觀察
各組于各時間點取部分切片，按照免疫組織化學染色試劑盒說明書，行Sema3A免疫組織化學染色。于200倍鏡下每張切片每個目標區域選取5個不同且不重疊的視野計數陽性細胞，Sema3A陽性染色表現為細胞膜或細胞質呈棕黃色或棕褐色染色，軟骨細胞體積大，較易觀察；成骨細胞體積較小，不易觀察，為骨小梁周圍棕黃色或棕褐色條帶，條帶內成骨細胞核計數即為成骨細胞陽性細胞數。
1.3.3 Western
blot檢測Sema3A蛋白表達 各時間點A、C組自大鼠骨折斷端上下各0.5 cm處剪斷，B、D組取相應部位脛骨，沖洗骨髓腔，低溫液氮下研磨骨組織至粉末狀；加入1%Triton X-100裂解液[11]冰上裂解2 h，4℃以離心半徑6 cm、12 000 r/min離心30 min，吸取上清行BCA蛋白定量；加蛋白上樣緩沖液煮沸，用于免疫蛋白印跡。經配膠、電泳、轉膜、封閉、孵育抗體后，添加化學發光液，超敏多功能成像儀采集圖像，Image J圖像分析軟件分析圖像，以Sema3A/β-actin比值作為Sema3A蛋白相對表達 量。
1.4 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 HE染色觀察
D組各時間點骨小梁未見明顯異常，無紊亂及斷裂，骨膜完整，骨皮質中骨細胞分布、大小均勻（圖 1 a）。術后3、5 d，B組與D組相比無明顯差異；A、C組骨折線清晰可見，骨折斷端無明顯骨痂生長，可見炎性細胞及纖維組織填充。7 d，A組骨折斷端可見纖維組織自骨膜下向斷端間隙生長，骨外膜軟骨細胞增生，新生軟骨細胞體積較小、排列緊密（圖 1 b）；B組骨膜稍紊亂，骨膜下骨皮質輕度增生，骨小梁未見明顯異常（圖 1 c）；C組骨折斷端被纖維組織填充，骨折斷端骨外膜下軟骨細胞增生，新生軟骨細胞體積較大，排列較疏松（圖 1 d）。14 d，A組可見骨外膜軟骨細胞增生填充骨折斷端，生成軟骨痂，骨痂中軟骨細胞排列規則，軟骨痂致密、類骨質較少（圖 1 e），軟骨痂向骨折斷端中心長入，出現新生骨小梁，排列緊密，周圍可見較多成骨細胞生成；B組骨膜平整，骨膜下可見輕度增生新生骨小梁及類骨質（圖 1 f）；C組骨折斷端骨外膜下軟骨痂增生，軟骨細胞排列疏松，類骨質較多（圖 1 g），軟骨痂向骨折斷端長入，新生骨小梁出現，周圍可見少量成骨細胞。21d，A組可見軟骨痂逐漸消失被成熟骨小梁代替，新生骨小梁排列緊密、密度高（圖 1 h）；B組骨膜平整、連續，骨膜下新生骨小梁及類骨質消失，骨皮質中骨細胞分布正常（圖 1 i）；C組軟骨痂被新生骨小梁代替，骨小梁排列較疏松、密度低，殘存少量軟骨細胞及類骨質（圖 1 j）。28 d，A、C組骨折線均模糊，A組骨折處愈合良好，骨痂范圍縮小，骨小梁排列緊密規則；C組可見大量肥厚性骨痂向外膨脹性生長，骨痂面積明顯大于A組，骨小梁結構疏松，排列紊亂；B組無明顯異常。
圖1
術后各時間點各組HE染色觀察（×200） ? D組7 d ? A組7 d ? B組7d ? C組7 d ? A組14 d ? B組14 d ? C組14 d ? A組21 d ? B組21 d ? C組21 d
Figure1.
HE staining observation in 4 groups at different time points after operation (HE×200) ? Group D at 7 days ? Group A at 7 days ? Group B at 7 days
? Group C at 7 days ? Group A at 14 days ? Group B at 14 days ? Group C at 14 days
? Group A at 21 days ? Group B at 21 days ?Group C at 21 days
2.2 免疫組織化學染色觀察
D組各時間點Sema3A陽性染色無明顯差異，主要表達于骨膜、骨小梁周圍成骨細胞及骨髓細胞（圖 2 a）。術后3、5 d，A、C組Sema3A陽性染色主要表達于骨折斷端少量纖維組織及骨髓細胞，B組主要表達于骨膜、骨小梁及骨髓細胞。7 d，A組Sema3A陽性染色在骨折斷端骨外膜下增生的軟骨細胞無明顯表達（圖 2 b）；B組主要表達于骨膜、骨小梁周圍成骨細胞及骨髓細胞（圖 2 c）；C組主要表達于骨折斷端骨外膜下增生的軟骨細胞（圖 2 d）。14d，A組Sema3A陽性染色在骨外膜軟骨細胞少量表達（圖 2 e），而在骨折斷端新生骨小梁周圍成骨細胞表達明顯增多（圖 2 f）；B組主要表達于骨膜、骨膜下新生骨小梁周圍的成骨細胞（圖 2 g）；C組在骨外膜軟骨細胞表達明顯增多（圖 2 h），而在骨折斷端新生骨小梁周圍成骨細胞表達較少（圖 2 i）。21 d，A組Sema3A陽性染色在骨小梁周圍成骨細胞表達較多（圖 2 j）；B組主要表達于骨膜、骨小梁周圍的成骨細胞及骨髓（圖 2 k）；C組在骨小梁周圍成骨細胞表達較少，在殘存骨痂中軟骨細胞繼續表達（圖 2 l）。28d，A組Sema3A陽性染色表達于骨小梁周圍成骨細胞；B組主要表達于骨膜及骨髓；C組表達于骨小梁周圍成骨細胞。
圖2
術后各時間點各組免疫組織化學染色觀察（×200） ? D組7 d ? A組7 d ? B組7 d ? C組7 d ? A組14 d軟骨痂中軟骨細胞 ? A組14 d新生骨小梁周圍成骨細胞 ? B組14 d ? C組14 d軟骨痂中軟骨細胞 ? C組14 d新生骨小梁周圍成骨細胞 ? A組21 d ? B組21 d ? C組21 d
Figure2.
Immunohistochemistry staining in 4 groups different time points after operation ? Group D at 7 days ? Group A at 7days ? Group B at 7 days ? Group C at 7 days ? Group A at 14 days,showing chondrocyte in osteoid callus ? Group A at 14 days,showing osteoblasts in new bone trabecula ? Group B at 14 days ? Group C at 14 days,showing chondrocyte in osteoid callus ? Group C at 14 days showing osteoblasts in new bone trabecula ? Group A at 21 days ? Group B at 21 days ? Group C at 21 days
由于B、D組無骨折，無骨痂生成，B、D組Sema3A陽性染色僅在7、14 d時在骨膜、骨膜下新生骨小梁周圍的成骨細胞觀察到輕微變化，故只比較了A、C組的統計學結果。而3、5 d骨折斷端為血腫、炎性細胞及少許纖維組織，無骨痂或軟骨細胞生成，故未納入統計比較。7 d時A、C組骨折斷端骨膜下軟骨細胞增生較多，未見成骨細胞生成；28 d時A、C組骨折線均模糊，軟骨痂被骨小梁代替，無殘存軟骨細胞。故最終只統計了A、C組14、21 d的軟骨細胞和成骨細胞陽性表達數以及7 d的軟骨細胞陽性表達數和28 d的成骨細胞陽性表達數。結果顯示，7、14、21 d C組軟骨細胞陽性表達數均顯著高于A組，14、21d成骨細胞陽性表達數均顯著低于A組，差異均有統計學意義（P＜0.01）；28 d時A、C組間比較軟骨細胞及成骨細胞陽性表達數，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。
表1
術后各時間點A、C組Sema3A免疫組織化學染色陽性細胞計數（n=8，x±s）
Table1.
Positive cells of Sema3A of groups A and C at different time points after operation by immunohistochemistry staining（n=8，x±s）
2.3 Western blot檢測Sema3A蛋白表達
D組各時間點Sema3A蛋白表達無明顯變化；A組Sema3A蛋白表達于術后5 d逐漸升高，14 d達高峰后逐漸下降，28 d恢復正常；B組Sema3A蛋白表達于術后7 d逐漸升高，14 d達高峰，21 d逐漸下降，28 d恢復正常；C組Sema3A蛋白表達于術后5 d逐漸升高，14 d達高峰后緩慢下降，28 d仍在較高水平。見圖 3。
圖3
Western blot檢測術后各時間點各組Sema3A蛋白表達 1：3d 2：5 d 3：7 d 4：14 d 5：21 d 6：28 d
Figure3.
Expression of Sema 3A protein in 4 groups at different time points by Western blot 1: At 3 days 2: At 5 days 3: At 7 days 4: At 14 days 5: At 21 days 6: At 28 days
術后3、5 d各組Sema3A蛋白相對表達量比較差異無統計學意義（P＞0.05）。7 d，A、B、C組Sema3A蛋白相對表達量明顯高于D組，C組高于A、B組，A組高于B組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。14 d，A、B、C組Sema3A蛋白相對表達量較D組進一步升高，A、C組高于B組，C組高于A組，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。21 d，A組Sema3A蛋白相對表達量迅速下降，顯著低于B、C組，接近D組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；B、C組顯著高于D組，C組高于B組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。28d，C組Sema3A蛋白相對表達量仍顯著高于其余3組，B組高于A、D組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；A、D組間差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 2。
表2
Western blot檢測術后各時間點各組Sema3A蛋白相對表達量（n=8，x±s）
Table2.
Protein expression of Sema3A at different time points in each group by Western blot（n=8，x±s）
3 討論
Sema最早于1993年在研究神經生長錐的導向因子時被發現，Sema3A作為Sema家族最典型且最早被確定的神經導向因子，除了在神經損傷后少突膠質細胞的定向遷移及軸突再生中發揮重要作用，在免疫應答、心血管系統的形成以及腫瘤的發生等方面也發揮著重要作用[12, 13, 14, 15, 16]；同時，越來越多研究也發現Sema3A參與骨重建與骨重塑[1, 2]。
Okubo等[7]發現在人骨性關節炎中，Sema3A在軟骨細胞表達較正常軟骨顯著升高，并且其表達與軟骨細胞克隆密切相關，通過抑制VEGF165介導的軟骨細胞遷移而促進軟骨細胞克隆。軟骨細胞克隆是軟骨細胞在受損部位增殖以完成局部修復，但細胞不能自由移動到其他地方，最終發育成軟骨細胞群。本研究中，骨折愈合原始骨痂形成期，Sema3A在C組骨外膜軟骨痂軟骨細胞中表達顯著高于A組，可能同樣引起軟骨細胞在局部的過度增殖，具體機制尚不清楚。Gomez等[6]研究發現，體外培養成骨細胞和軟骨細胞分化時表達Sema3A信號系統的許多分子，Sema3A亦可能參與了軟骨細胞的分化。因此Sema3A在軟骨細胞過表達，促進軟骨細胞過度增生、分化，可能是TBI后骨折愈合中軟骨痂異常增多的原因之一。
Gomez等[6]發現在體內神經、血管侵入軟骨內骨化中心前，Sema3A表達于骨化中心的前肥大和肥大軟骨細胞，Sema3A在時間和空間模式上的表達平行于骨組織的神經支配、甚至更早，表明軟骨細胞表達Sema3A信號系統，是骨化中心的神經和血管能夠有序長入所必需的。健康椎間盤內無血管和神經纖維，椎間盤變性過程中有傷害性神經纖維和血管由變性椎間盤外向內生長，這可能與疼痛有關[17]。Tolofari等[18]在研究椎間盤變性中發現Sema3A在健康椎間盤內充當神經長入的屏障，主要高度表達在外纖維環，而變性椎間盤在這一區域顯著下降。Tanelian等[19]在成年兔角膜上皮細胞轉染Sema3A，可排斥三叉神經感覺神經的傳入。以上研究均提示，Sema3A在局部的高表達可能影響神經纖維在組織局部的長入。Behar等[20]研究發現，Sema3A基因敲除小鼠出現軟骨結構異常、椎體融合、部分肋骨重合等骨發育異常。Fukuda等[2]發現神經元分泌的Sema3A與觀察到的骨量異常有關，獨立于骨局部的Sema3A作用，進一步研究表明神經元通過自分泌Sema3A調節感覺神經纖維在骨小梁的分布。提示感覺神經元分泌的Sema3A調節骨發育通過調節感覺神經纖維在骨小梁的分布間接調節骨重塑，而不是直接作用于成骨細胞。因此，TBI后骨折愈合過程中，軟骨細胞過表達Sema3A，局部異常表達的Sema3A可能排斥感覺神經纖維在骨痂部位的長入，感覺神經支配減少后，由感覺神經纖維自分泌的Sema3A介導的新生感覺神經纖維進一步減少，引起參與骨調節的相關神經肽的分泌異常，可能是TBI后骨折愈合過程中軟骨痂異常增多的原因之一。屈墨羱等[21]在骨質疏松大鼠骨折模型的骨折局部給予注射Sema3A，發現能促進骨折愈合中期骨痂形成，縮短骨痂形成周期，進一步印證了Sema3A可介導軟骨痂異常增多。
Hayashi等[1]研究發現Sema3A 在成骨細胞中表達，雙重調節破骨細胞和成骨細胞，進一步研究發現Sema3A主要通過與其受體Nrp-1結合，阻斷下游的ITAM和Rho A信號通路，抑制RANKL誘導的破骨細胞分化，通過經典的Wnt 3a-β-catenin-Runx2蛋白信號通路促進成骨細胞分化。邱雨等[22]在Sema3A對成牙骨質細胞系增殖和礦化功能研究中發現，Sema3A通過抑制骨鈣素和Runx2基因表達，從而抑制細胞的礦化能力，成牙骨質細胞與成骨細胞有相似之處，兩者均與礦化有關。本研究中，C組Sema3A在軟骨痂新生骨小梁周圍的成骨細胞表達明顯低于A組，Sema3A成骨細胞分化降低，這可能是TBI后骨折愈合時骨小梁排列疏松、骨痂生物力學強度差、軟骨痂向硬骨痂轉換障礙的原因之一。
綜上述，Sema3A在TBI后骨折愈合過程中，在軟骨痂中軟骨細胞高表達、新生骨小梁周圍成骨細胞低表達，可能通過影響軟骨細胞分化、增生，排斥軟骨痂骨化中心內感覺神經纖維長入，未能及時調控成骨細胞分化促進新生骨小梁成熟，是導致TBI后骨折愈合時軟骨痂生成較多、新生骨小梁排列疏松、骨痂生物強度降低的原因之一。通過對TBI后骨折愈合過程中Sema3A在空間和時間表達模式上的研究發現，Sema3A可能在TBI后的骨折愈合中發揮了重要作用。Nrp-1是Sema3A的功能性受體[23]，目前對于Sema3A及Nrp-1的相關研究中報道的阻滯劑，如SICHI[24]、decorin[25]、Nrp-1抑制肽[26]等均不理想，進行相關干預后未進一步觀察軟骨細胞、成骨細胞、感覺神經纖維分布等的變化，為本研究不足之處，但為后續相關干預提供了初步的理論基礎。隨著對Sema3A及其阻滯劑的進一步研究，將為TBI后骨折愈合的治療提供更多理論依據。
