引用本文： 段鑫, 陳強, 李浪, 許釗, 范兆心, 趙雪, 張林昊, 項舟. 兩種軟骨缺損模型制備效果比較. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(10): 1220-1224. doi: 10.7507/1002-1892.20160250 復制
關節軟骨是構成滑膜關節的重要組成部分，其修復潛能非常有限，損傷后很難愈合，而關節軟骨損傷會導致退行性關節炎發生。退行性關節炎的主要臨床表現為疼痛、僵硬等，嚴重者甚至出現關節變形、肌肉萎縮，影響正常生活[1]。因此建立合適的軟骨缺損模型，可為軟骨缺損的防治提供良好的實驗平臺。文獻報道犬膝關節股骨內側髁軟骨厚度為0.95～1.30mm[2]，這一厚度在制備軟骨缺損的同時可不損傷軟骨下骨；同時，犬的后膝關節解剖及承重特點均與人較相似，因此犬作為骨關節炎及軟骨缺損研究的實驗動物是較好選擇。本研究以比格犬作為實驗動物，比較內側副韌帶切斷加半月板切除以及軟骨刮除兩種不同軟骨缺損造模方法，為進一步實驗及臨床應用提供參考。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
成年健康比格犬10只，雌雄不限，體質量5.0～10.0 kg，由四川大學華西醫院動物實驗中心提供。隨機分為3組，A組（n=4）為內側副韌帶切斷加半月板切除組，B組（n=4）為軟骨刮除組，C組（n=2）為正常對照組。
番紅O軟骨染色液（Leagene公司，德國）；4%多聚甲醛、EDTA脫鈣液、石蠟、蘇木素染液、伊紅染液、甲苯胺藍染液等由四川大學華西醫院生物治療國家重點實驗室?干細胞與組織工程研究室自備。角膜環鉆（直徑4 mm）、耳鼻喉乳突刮匙（成都溶海華康生物科技有限公司）；倒置相差顯微鏡（Leica公司，德國）；手術用針線、10號手術刀片、刀柄、電刀、紗布、剪刀由四川大學華西醫院動物實驗中心提供。
1.2 造模方法
1.2.1 A組
取比格犬4只，術前6 h禁飲、禁食。以3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）腹腔注射麻醉后，雙膝關節備皮，術前肌肉注射青霉素80萬U。采用膝關節前內側入路，逐層切開皮膚和皮下組織；切開關節囊，將髕骨向外側脫位，暴露半月板；切除半月板并切斷內側副韌帶；沖洗關節，縫合關節囊，逐層關閉切口。術后肌肉注射青霉素80萬U，1次/d，共3 d。統一條件下分籠飼料喂養。見圖 1 a。
圖1
A、B組軟骨缺損模型 ? A組 ? B組 ? ?1.2.2 B組
取比格犬4只，術前處理及手術切口同A組。切開關節囊后，將髕骨向外側脫位，暴露股骨髁。使用角膜環鉆（直徑4 mm）于髁間溝及內外髁打孔定位，于髕股關節面摩擦部位及股骨內外髁承重部位共制造4個直徑4 mm的軟骨缺損；使用乳突刮匙刮除軟骨，操作輕柔，注意勿損傷軟骨下骨；刮除干凈后沖洗關節，縫合關節囊，逐層關閉切口。術后處理同A組。見圖 1 b。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
術后觀察實驗動物一般狀況、步態、關節活動度、傷口愈合及有無感染等情況。
1.3.2 MRI檢查
術后16周采用MRI觀察各組膝關節軟骨缺損處情況。
1.3.3 標本大體觀察
術后16周，空氣栓塞法處死所有實驗動物，取股骨髁觀察內髁、外髁、髁間軟骨表面光滑度，是否有骨關節炎表現。
1.3.4 組織學觀察
術后16周取各組標本，4%多聚甲醛固定7 d，EDTA脫鈣，乙醇脫水，石蠟包埋，切片，行HE、甲苯胺藍、番紅O染色，倒置相差顯微鏡下觀察。采用國際骨關節炎研究協會（OARSI）骨關節炎組織學評分表[3]對A、B組進行評分。
1.4 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
A、B組實驗動物一般情況均良好，進食、排泄、精神可；切口愈合良好，無紅腫、感染征象；術后膝關節活動度可，無明顯受限。
2.2 MRI檢查
與C組MRI相比，術后16周A組可見關節面平滑，未見明顯軟骨缺損；B組可見關節面不連續，刮除部位有明顯軟骨缺口。見圖 2。
2.3 標本大體觀察
與C組標本相比，術后16周A組可見股骨髁部分軟骨磨損痕跡；B組可見軟骨缺損明顯，缺損部位呈暗紅色，部分缺損有少許白色瘢痕樣纖維組織長入。見圖 3。
2.4 組織學觀察
術后16周HE、甲苯胺藍、番紅O染色結果示，A組軟骨結構排列表現為軟骨表面淺層纖維形成，且不均勻；尚未出現軟骨表面不連續，無軟骨皸裂擴散或侵蝕，無明顯關節軟骨損害、關節軟骨剝脫、關節變形等嚴重骨關節炎表現；軟骨厚度及軟骨基質染色與C組無明顯差別。B組可觀察到軟骨面不連續，全層軟骨缺失，軟骨缺損邊界清晰，軟骨下骨未受累及；軟骨缺損部位底部很少量透明軟骨樣組織生長，較少纖維軟組織長入，軟骨缺損明顯。C組軟骨結構排列整齊，軟骨表面連續，無軟骨缺損骨關節炎表現。見圖 4～6。
圖4
術后16周各組HE染色觀察（倒置相差顯微鏡×40） ? A組 ? B組 ? C組 ? ?A、B組OARSI骨關節炎組織學評分分別為（0.940±0.574）、（4.500±0.516）分，差異有統計學意義（t=18.461，P=0.000）。
3 討論
軟骨損傷是骨科常見疾病，創傷是造成骨軟骨缺損的主要因素。軟骨缺損可能造成關節不穩，從而造成關節退化性骨關節炎。關節軟骨損傷治療困難，目前已成為臨床治療的一大挑戰。退化性骨關節炎是目前最常見的關節軟骨損傷疾病，每年有上百萬患者受該病困擾，造成了醫療健康系統的巨大開支[4-5]。直接研究人的軟骨損傷困難較多，包括疾病發展緩慢、病因復雜、早期缺乏癥狀、軟骨損傷與癥狀無確切關聯等[6]。因此建立軟骨缺損骨關節炎 動物模型，對研究者了解膝關節骨關節炎很有必 要。
可作為軟骨缺損骨關節炎動物模型的動物選擇很多。理想的膝關節軟骨缺損模型需具備與人類膝關節相似的結構，包括大小、結構及軟骨損傷再生機制，而且在相應誘發條件下能產生軟骨缺損，并發展成為骨關節炎。已有研究表明，C57BL小鼠、昆明小鼠、Wistar大鼠、SD大鼠、Halrty豚鼠、B63CFI栗鼠、新西蘭大白兔、日本大耳白兔、家兔、小型豬等均可作為軟骨缺損骨關節炎造模動物[7]，但人與動物的關節在生理及解剖方面不同，尚無一種動物軟骨缺損模型可直接與人類相比。目前運用較多的是鼠和兔模型，其中鼠的關節軟骨退變組織學特性與人類骨關節炎相似，但其關節幾何形狀與人類不同且不含硫酸角質素[8]；兔膝關節與人膝關節在解剖方面相似且價格便宜，但兔為小型動物，不利于手術操作。相比于兔、鼠等小型動物，犬類體型較大，便于手術 操作及進行大體標本和影像學、組織學觀察。目前研究多采用雜種犬，而本研究選擇的比格犬性格溫順、品種單一，減少了動物本身導致的實驗偏 倚。
目前，軟骨缺損骨關節炎模型造模方法主要包括手術、關節腔內藥物注射、自然發生的骨關節炎及轉基因模型等[9]。相比于自然發生，關節腔內藥物注射造模、手術方法造模能快速造成軟骨缺損并發展成為骨關節炎，且具有可重復性[10]。許多研究采用切斷內側副韌帶、前交叉韌帶或半月板的方法進行軟骨缺損骨關節炎造模。Libicher等[11]對24只比格犬采用前交叉韌帶切斷進行軟骨缺損骨關節炎造模，術后48周MRI顯示膝關節出現骨關節炎早期病變；Boileau等[12]對5只雜種犬行前交叉韌帶切斷術，術后4、8、26周MRI均觀察到軟骨缺損骨關節炎表現。而我們的研究發現，切斷內側副韌帶及切除半月板后16周，MRI、組織學染色顯示關節結構未見明顯改變及未見明顯軟骨缺損，這可能與術后比格犬活動不足，同時動物本身對損傷有一定修復機制有關。軟骨刮除用于軟骨缺損骨關節炎造模目前已有報道。Shortcroff等[13]在1996年就對該模型進行了初步研究，他們在6只雜種犬的股骨內外髁上制造了2mm或3mm直徑的軟骨全層缺損，術后2、4周處死動物后觀察，缺損處均無組織長入。Breinan等[14]在1997年也應用相同模型進行了軟骨缺損修復的相關研究，他們在14只雜種犬的膝關節髁間溝兩側制造了直徑4 mm缺損，組織學結果顯示造模成功，并用于后續實驗。項舟等[15]在2006年的研究中同樣應用該模型并成功造模，大體觀察明顯可見軟骨缺損，顯示了該模型的科研價值。然而該模型仍存在一些弊端，實驗中我們發現該方法某些缺損制造過程不可避免地會對軟骨下骨造成微骨折。目前，對于何種方法能夠快速造成軟骨缺損骨關節炎，尚無大型動物研究直接對比，我們比較兩種造模方法，以期對后續研究提供參考。
采用X線片、micro-CT均可成功進行軟骨缺損骨關節炎造模效果檢測，但其診斷敏感性不高；MRI能更好地顯示骨刺的變化，且能更好地區分關節滲出及滑膜增厚[16-19]。另外，組織學觀察被廣泛應用于動物模型[20]。本研究中，我們從大體觀察、影像學及組織學方面同時進行觀察比較，并對組織學進行量化評分，結果均表明軟骨刮除能在更短時間達到軟骨破壞，從而成功達到軟骨缺損造模效果，是一種構建軟骨缺損模型的良好方法。
關節軟骨是構成滑膜關節的重要組成部分，其修復潛能非常有限，損傷后很難愈合，而關節軟骨損傷會導致退行性關節炎發生。退行性關節炎的主要臨床表現為疼痛、僵硬等，嚴重者甚至出現關節變形、肌肉萎縮，影響正常生活[1]。因此建立合適的軟骨缺損模型，可為軟骨缺損的防治提供良好的實驗平臺。文獻報道犬膝關節股骨內側髁軟骨厚度為0.95～1.30mm[2]，這一厚度在制備軟骨缺損的同時可不損傷軟骨下骨；同時，犬的后膝關節解剖及承重特點均與人較相似，因此犬作為骨關節炎及軟骨缺損研究的實驗動物是較好選擇。本研究以比格犬作為實驗動物，比較內側副韌帶切斷加半月板切除以及軟骨刮除兩種不同軟骨缺損造模方法，為進一步實驗及臨床應用提供參考。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
成年健康比格犬10只，雌雄不限，體質量5.0～10.0 kg，由四川大學華西醫院動物實驗中心提供。隨機分為3組，A組（n=4）為內側副韌帶切斷加半月板切除組，B組（n=4）為軟骨刮除組，C組（n=2）為正常對照組。
番紅O軟骨染色液（Leagene公司，德國）；4%多聚甲醛、EDTA脫鈣液、石蠟、蘇木素染液、伊紅染液、甲苯胺藍染液等由四川大學華西醫院生物治療國家重點實驗室?干細胞與組織工程研究室自備。角膜環鉆（直徑4 mm）、耳鼻喉乳突刮匙（成都溶海華康生物科技有限公司）；倒置相差顯微鏡（Leica公司，德國）；手術用針線、10號手術刀片、刀柄、電刀、紗布、剪刀由四川大學華西醫院動物實驗中心提供。
1.2 造模方法
1.2.1 A組
取比格犬4只，術前6 h禁飲、禁食。以3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）腹腔注射麻醉后，雙膝關節備皮，術前肌肉注射青霉素80萬U。采用膝關節前內側入路，逐層切開皮膚和皮下組織；切開關節囊，將髕骨向外側脫位，暴露半月板；切除半月板并切斷內側副韌帶；沖洗關節，縫合關節囊，逐層關閉切口。術后肌肉注射青霉素80萬U，1次/d，共3 d。統一條件下分籠飼料喂養。見圖 1 a。
圖1
A、B組軟骨缺損模型 ? A組 ? B組 ? ?1.2.2 B組
取比格犬4只，術前處理及手術切口同A組。切開關節囊后，將髕骨向外側脫位，暴露股骨髁。使用角膜環鉆（直徑4 mm）于髁間溝及內外髁打孔定位，于髕股關節面摩擦部位及股骨內外髁承重部位共制造4個直徑4 mm的軟骨缺損；使用乳突刮匙刮除軟骨，操作輕柔，注意勿損傷軟骨下骨；刮除干凈后沖洗關節，縫合關節囊，逐層關閉切口。術后處理同A組。見圖 1 b。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
術后觀察實驗動物一般狀況、步態、關節活動度、傷口愈合及有無感染等情況。
1.3.2 MRI檢查
術后16周采用MRI觀察各組膝關節軟骨缺損處情況。
1.3.3 標本大體觀察
術后16周，空氣栓塞法處死所有實驗動物，取股骨髁觀察內髁、外髁、髁間軟骨表面光滑度，是否有骨關節炎表現。
1.3.4 組織學觀察
術后16周取各組標本，4%多聚甲醛固定7 d，EDTA脫鈣，乙醇脫水，石蠟包埋，切片，行HE、甲苯胺藍、番紅O染色，倒置相差顯微鏡下觀察。采用國際骨關節炎研究協會（OARSI）骨關節炎組織學評分表[3]對A、B組進行評分。
1.4 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
A、B組實驗動物一般情況均良好，進食、排泄、精神可；切口愈合良好，無紅腫、感染征象；術后膝關節活動度可，無明顯受限。
2.2 MRI檢查
與C組MRI相比，術后16周A組可見關節面平滑，未見明顯軟骨缺損；B組可見關節面不連續，刮除部位有明顯軟骨缺口。見圖 2。
2.3 標本大體觀察
與C組標本相比，術后16周A組可見股骨髁部分軟骨磨損痕跡；B組可見軟骨缺損明顯，缺損部位呈暗紅色，部分缺損有少許白色瘢痕樣纖維組織長入。見圖 3。
2.4 組織學觀察
術后16周HE、甲苯胺藍、番紅O染色結果示，A組軟骨結構排列表現為軟骨表面淺層纖維形成，且不均勻；尚未出現軟骨表面不連續，無軟骨皸裂擴散或侵蝕，無明顯關節軟骨損害、關節軟骨剝脫、關節變形等嚴重骨關節炎表現；軟骨厚度及軟骨基質染色與C組無明顯差別。B組可觀察到軟骨面不連續，全層軟骨缺失，軟骨缺損邊界清晰，軟骨下骨未受累及；軟骨缺損部位底部很少量透明軟骨樣組織生長，較少纖維軟組織長入，軟骨缺損明顯。C組軟骨結構排列整齊，軟骨表面連續，無軟骨缺損骨關節炎表現。見圖 4～6。
圖4
術后16周各組HE染色觀察（倒置相差顯微鏡×40） ? A組 ? B組 ? C組 ? ?A、B組OARSI骨關節炎組織學評分分別為（0.940±0.574）、（4.500±0.516）分，差異有統計學意義（t=18.461，P=0.000）。
3 討論
軟骨損傷是骨科常見疾病，創傷是造成骨軟骨缺損的主要因素。軟骨缺損可能造成關節不穩，從而造成關節退化性骨關節炎。關節軟骨損傷治療困難，目前已成為臨床治療的一大挑戰。退化性骨關節炎是目前最常見的關節軟骨損傷疾病，每年有上百萬患者受該病困擾，造成了醫療健康系統的巨大開支[4-5]。直接研究人的軟骨損傷困難較多，包括疾病發展緩慢、病因復雜、早期缺乏癥狀、軟骨損傷與癥狀無確切關聯等[6]。因此建立軟骨缺損骨關節炎 動物模型，對研究者了解膝關節骨關節炎很有必 要。
可作為軟骨缺損骨關節炎動物模型的動物選擇很多。理想的膝關節軟骨缺損模型需具備與人類膝關節相似的結構，包括大小、結構及軟骨損傷再生機制，而且在相應誘發條件下能產生軟骨缺損，并發展成為骨關節炎。已有研究表明，C57BL小鼠、昆明小鼠、Wistar大鼠、SD大鼠、Halrty豚鼠、B63CFI栗鼠、新西蘭大白兔、日本大耳白兔、家兔、小型豬等均可作為軟骨缺損骨關節炎造模動物[7]，但人與動物的關節在生理及解剖方面不同，尚無一種動物軟骨缺損模型可直接與人類相比。目前運用較多的是鼠和兔模型，其中鼠的關節軟骨退變組織學特性與人類骨關節炎相似，但其關節幾何形狀與人類不同且不含硫酸角質素[8]；兔膝關節與人膝關節在解剖方面相似且價格便宜，但兔為小型動物，不利于手術操作。相比于兔、鼠等小型動物，犬類體型較大，便于手術 操作及進行大體標本和影像學、組織學觀察。目前研究多采用雜種犬，而本研究選擇的比格犬性格溫順、品種單一，減少了動物本身導致的實驗偏 倚。
目前，軟骨缺損骨關節炎模型造模方法主要包括手術、關節腔內藥物注射、自然發生的骨關節炎及轉基因模型等[9]。相比于自然發生，關節腔內藥物注射造模、手術方法造模能快速造成軟骨缺損并發展成為骨關節炎，且具有可重復性[10]。許多研究采用切斷內側副韌帶、前交叉韌帶或半月板的方法進行軟骨缺損骨關節炎造模。Libicher等[11]對24只比格犬采用前交叉韌帶切斷進行軟骨缺損骨關節炎造模，術后48周MRI顯示膝關節出現骨關節炎早期病變；Boileau等[12]對5只雜種犬行前交叉韌帶切斷術，術后4、8、26周MRI均觀察到軟骨缺損骨關節炎表現。而我們的研究發現，切斷內側副韌帶及切除半月板后16周，MRI、組織學染色顯示關節結構未見明顯改變及未見明顯軟骨缺損，這可能與術后比格犬活動不足，同時動物本身對損傷有一定修復機制有關。軟骨刮除用于軟骨缺損骨關節炎造模目前已有報道。Shortcroff等[13]在1996年就對該模型進行了初步研究，他們在6只雜種犬的股骨內外髁上制造了2mm或3mm直徑的軟骨全層缺損，術后2、4周處死動物后觀察，缺損處均無組織長入。Breinan等[14]在1997年也應用相同模型進行了軟骨缺損修復的相關研究，他們在14只雜種犬的膝關節髁間溝兩側制造了直徑4 mm缺損，組織學結果顯示造模成功，并用于后續實驗。項舟等[15]在2006年的研究中同樣應用該模型并成功造模，大體觀察明顯可見軟骨缺損，顯示了該模型的科研價值。然而該模型仍存在一些弊端，實驗中我們發現該方法某些缺損制造過程不可避免地會對軟骨下骨造成微骨折。目前，對于何種方法能夠快速造成軟骨缺損骨關節炎，尚無大型動物研究直接對比，我們比較兩種造模方法，以期對后續研究提供參考。
采用X線片、micro-CT均可成功進行軟骨缺損骨關節炎造模效果檢測，但其診斷敏感性不高；MRI能更好地顯示骨刺的變化，且能更好地區分關節滲出及滑膜增厚[16-19]。另外，組織學觀察被廣泛應用于動物模型[20]。本研究中，我們從大體觀察、影像學及組織學方面同時進行觀察比較，并對組織學進行量化評分，結果均表明軟骨刮除能在更短時間達到軟骨破壞，從而成功達到軟骨缺損造模效果，是一種構建軟骨缺損模型的良好方法。
