引用本文： 彭建強, 易志新, 武明鑫, 黃愛軍, 林昆, 靳松, 李亮平, 黃勝, 羅嘉全, 鄒學農. 氧化應激活化RAW264.7巨噬細胞對MC3T3-E1成骨細胞遷移、增殖及成骨基因表達影響的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(9): 1146-1152. doi: 10.7507/1002-1892.20160234 復制
嚴重創傷、腫瘤切除、骨感染等原因所致的大段骨缺損、骨不愈合等臨床常見，目前主要治療方法包括藥物、內固定、自體或同種異體骨以及組織工程骨移植修復等，但難以達到理想治療效果。骨組織愈合是一個復雜過程，包括早期單核巨噬細胞募集、炎性因子產生、MSCs募集、成骨細胞的成骨分化等。生理條件下，骨組織愈合受多方面影響，其中巨噬細胞發揮關鍵作用。研究表明，巨噬細胞通過調控成骨細胞的成骨分化影響骨形成，如通過分泌BMP-2、抑瘤素M（oncostatin M，OSM）、外泌體等促進成骨分化，通過分泌TNF-α等抑制成骨分化[1-4]。在骨折局部及移植材料植入早期，損傷部位處于缺血、缺氧狀態，周圍浸潤的巨噬細胞發生低氧應激、氧化應激甚至內質網應激。目前，關于氧化應激狀態下巨噬細胞對成骨細胞成骨分化的影響未見報道。因此，本研究利用H2O2刺激巨噬細胞RAW264.7細胞，誘導巨噬細胞發生氧化應激，收集氧化應激狀態下細胞上清，將其與成骨細胞MC3T3-E1細胞共培養，探索其對MC3T3-E1細胞增殖、遷移及成骨分化的影響，為臨床促進骨組織再生提供新的治療思路。
1 材料與方法
1.1 主要試劑與儀器
RAW264.7細胞系、MC3T3-E1細胞系由美國ATCC細胞庫提供。DMEM、α-MEM培養基（HyClone公司，美國）；FBS（杭州四季青生物工程有限公司）；胰蛋白酶（GIBCO公司，美國）；Trizol Riagent試劑（Invitrogen公司，美國）；MTS、RIPA裂解液、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所）；PBS、H2O2（Sigma公司，美國）；氯仿、異丙醇（廣州化學試劑廠）；逆轉錄試劑盒、實時定量PCR試劑盒（TaKaRa公司，日本）。
細胞培養瓶、培養板（Corning公司，美國）；TS100倒置光學/熒光多功能顯微鏡（Nikon公司，日本）；NanoDrop 2000分光光度計、移液器、酶標儀（Thermo公司，美國）；PCR儀（Bio-Rad公司，美國）。引物由華大基因公司合成。
1.2 細胞培養及傳代
取MC3T3-E1細胞系，加入完全培養液（含10%FBS的α-MEM培養基），置于37℃、5% CO2及95%飽和濕度的恒溫培養箱中培養，每2～3天換液1次，待細胞生長至80%～90%匯合度時，棄原培養液，PBS清洗2～3次，37℃、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化1～3 min；加入完全培養液終止反應，用移液器反復吹打若干次。室溫下，以離心半徑10 cm，1 200 r/min離心5 min，棄上清后加入完全培養液重懸細胞，按1:4比例進行傳代培養。
取RAW264.7細胞系，加入完全培養液（含10%FBS的DMEM培養基），置于37℃、5% CO2及95%飽和濕度的恒溫培養箱中培養，每2～3天換液1次，待細胞生長至80%～90%匯合度時，棄1/3培養基，將細胞從培養瓶壁上刮下，用移液器反復吹打若干次，待細胞完全散開后，按1:5比例進行傳代培養。
1.3 RAW264.7細胞檢測
1.3.1 細胞生長檢測
取第7代RAW264.7細胞接種于96孔板，每孔2×104個細胞，完全培養液中孵育12 h。待細胞貼壁后，棄孔內培養基，每孔加入100 μL無血清DMEM培養基。將細胞分為4組，分別加入濃度為0、25、50、100 μmol/L H2O2進行培養，每組設5個復孔。設無細胞孔為調零孔。培養1、3、6 h后，每組取5孔，采用MTS法檢測細胞活力，于酶標檢測儀490 nm波長處測定吸光度（A）值，按照以下公式計算細胞增殖率。細胞增殖率=[（0 μmol/L組A值-H2O2各濃度處理組A值）-調零孔A值]/（0 μmol/L組A值-調零孔A值）×100%。
1.3.2 SOD檢測
取第7代RAW264.7細胞接種于6孔板，每孔2×106個細胞，完全培養液中孵育12 h。細胞同1.3.1方法分組培養，每組設3個復孔。培養1 h后收集細胞，冰面上勻漿，4℃，以離心半徑5 cm，12 000 r/min離心5 min，取上清。采用檢測試劑盒測定上清液中SOD含量。
根據MTS及SOD檢測結果，確定H2O2刺激構建Raw264.7細胞氧化應激模型最佳濃度和作用時間，并進行下一步實驗。
1.4 RAW264.7細胞上清液收集
取第7代RAW264.7細胞接種于6孔板，每孔2×106個。待細胞融合達80%時，于培養板中加含最佳濃度H2O2的無血清培養基，對RAW264.7細胞進行氧化應激處理，每孔2 mL。以最佳作用時間處理后棄培養基，PBS沖洗3次，更換為含10%FBS的完全培養基。37℃、5% CO2及95%飽和濕度的恒溫培養箱中孵育24 h后收集上清液，以離心半徑10 cm，1 200 r/min離心5 min，去除細胞碎片。同法收集未氧化應激RAW264.7細胞上清液。各上清液均于細胞誘導實驗前準備。
1.5 MC3T3-E1細胞檢測
1.5.1 細胞生長檢測
取第7代MC3T3-E1細胞接種于96孔板，每孔1×104個細胞。24 h待細胞貼壁后，棄培養基，加入新鮮培養基。根據培養條件不同，實驗分為3組。空白對照組（A組），加入100 μL無血清DMEM培養基；陰性對照組（B組），加入100 μL 1.4中制備的未氧化應激RAW264.7細胞上清液；實驗組（C組），加入100 μL 1.4中制備的氧化應激RAW264.7細胞上清液。培養1、2、3 d后，各組取5孔細胞，同1.3.1方法檢測細胞增殖率，取均值。
1.5.2 細胞遷移能力檢測
取第7代MC3T3-E1細胞接種于24孔板，每孔1×105個細胞。于含10%FBS的α-MEM培養基中孵育24 h，待細胞貼壁后，于培養板底部用黑色標記筆標記，然后用200 μL槍頭垂直于標記線劃痕。棄培養基，PBS沖洗3次，棄劃下的細胞。同1.5.1方法分組后，分別加入對應培養基繼續孵育。利用Image J軟件測量12、24 h時細胞遷移距離。
1.6 RAW264.7細胞上清液對MC3T3-E1細胞成骨影響
1.6.1 實驗分組及方法
取第7代MC3T3-E1細胞接種于6孔板，每孔2×105個。根據培養條件不同，實驗分為4組。空白對照組，以完全培養基培養；陽性對照組，以含50 μg/mL維生素C及10 nmol/L β甘油磷酸鈉的完全培養基進行成骨誘導培養；正常對照組，以含50 μg/mL維生素C及10 nmol/L的β甘油磷酸鈉的完全培養基及未氧化應激RAW264.7細胞上清液培養；實驗組，以含50 μg/mL維生素C及10 nmol/L β甘油磷酸鈉的完全培養基及氧化應激RAW264.7細胞上清液培養。
1.6.2 RT-PCR檢測
培養3、7、14 d，檢測細胞內成骨相關基因ALP、Runx2、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、Ⅰ型膠原蛋白（collagen typeⅠ，COL-Ⅰ）、骨鈣素（osteocalcin，OC）、骨唾液酸蛋白（bone sialoprotein，BSP）表達水平。用Trizol法提取樣本內總RNA并進行逆轉錄，cDNA置于—20℃保存。反應總體系10 μL；反應條件：95℃、10 min，95℃、15 s，60℃、30 s，72℃、20 s，40個循環。以GAPDH為內參，基因擴增引物序列見表 1。用2-ΔΔCt計算各目的基因相對表達量，實驗重復3次。
表1
各基因引物序列
Table1.
Primer sequences for target genes
1.7 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 RAW264.7細胞檢測
2.1.1 細胞生長檢測
組內比較：0 μmol/L濃度組培養1、3、6 h間細胞增殖率比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。25、50、100 μmol/L濃度組培養1 h時細胞增殖率明顯高于3、6 h時，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；培養3、6 h，25 μmol/L濃度組細胞增殖率比較差異有統計學意義（P < 0.05）；50、100 μmol/L濃度組細胞增殖率明顯下降，均低于85%，未作統計分析。
組間比較：培養1、3、6 h時，25、50、100 μmol/L濃度組細胞活力明顯低于0 μmol/L濃度組，50、100 μmol/L濃度組低于25 μmol/L濃度組，差異有統計學意義（P < 0.05）。50、100 μmol/L濃度組組間未作統計分析。見圖 1。
圖1
經不同濃度H2O2培養后RAW264.7細胞生長曲線??圖 2 ??經不同上清液培養后MC3T3-E1細胞生長曲線?? 圖 3 ?? MC3T3-E1細胞遷移能力觀察（倒置相差顯微鏡×50）?從左至右分別為0、12、24 h ??? A組??? B組??? C組
Figure1.
The growth curve of RAW264.7 cells macrophages after stimulated by H2O2 in different concentrations ??Fig.2 ??The growth curve of MC3T3-E1 cells after stimulated by different supernatants ??Fig.3 ??MC3T3-E1 cells migration at different time points after cell scratch (Inverted phase contrast microscope×50) ?From left to right: 0, 12, and 24 hours ??? Group A ??? Group B ??? Group C
2.1.2 SOD檢測
培養1 h時，25、50、100 μmol/L濃度組細胞SOD含量分別為（1.261±0.058）、（1.321±0.042）、（1.438±0.096）U，顯著高于0 μmol/L濃度組的（0.475±0.023）U，差異有統計學意義（P < 0.05）；且隨著濃度增加，SOD含量呈增加趨勢，但組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。
結合MTS和SOD檢測結果顯示，H2O2刺激構建Raw264.7細胞氧化應激模型最佳濃度為25 μmol/L、作用時間為1 h。
2.2 MC3T3-E1細胞檢測
2.2.1 細胞生長檢測
組內比較：A、B、C組培養2、3 d時細胞增殖率與1 d時比較，差異有統計學意義（P < 0.05）；2、3 d間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。
組間比較：1、2、3 d B、C組細胞增殖率顯著高于A組，差異有統計學意義（P < 0.05）；C組低于B組，且2、3 d時組間比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖 2。
2.2.2 細胞遷移能力檢測
12 h時B、C組MC3T3-E1細胞遷移顯著快于A組，C組顯著快于B組；A、B、C組細胞遷移距離分別為（38.870±0.507）、（62.020±1.540）、（71.690±2.022）mm，組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。24 h時除A組細胞尚存在劃痕外，B、C組劃痕已經被細胞爬滿，故24 h未測量細胞間距離。見圖 3。
2.3 RAW264.7細胞上清液對MC3T3-E1細胞成骨影響
組內比較：各組7、14 d ALP mRNA相對表達量均高于3 d，各時間點間比較差異有統計學意義（P < 0.05）。各組Runx2、OC、BSP、OPN、COL-ⅠmRNA相對表達量均呈逐漸增加趨勢，各時間點間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）
組間比較：3 d時，各組各指標比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。7、14 d時，實驗組和空白對照組ALP、Runx2 mRNA相對表達量明顯低于陽性對照組及正常對照組，實驗組、正常對照組及陽性對照組OPN、COL-I mRNA相對表達量明顯高于空白對照組，實驗組、正常對照組及空白對照組OC、BSP mRNA明顯高于陽性對照組，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。其余各時間點組間比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。見圖 4。
圖4
RT-PCR檢測各時間點MC3T3-E1細胞成骨相關基因表達
ⓐ ALP ⓑ Runx2 ⓒ OPN ⓓ OC ⓔ BSP ⓔ COL-Ⅰ
ⓐ ALP ⓑ Runx2 ⓑ OPN ⓒ OC ⓓ BSP ⓔ COL-Ⅰ
3 討論
骨組織是破骨細胞不斷吸收與成骨細胞不斷生成的動態平衡結果[5]，探索免疫細胞與成骨細胞的相互作用原理，尋找有效方法、排除不利因素來提高局部成骨細胞成骨性能及促進骨組織的修復再生，是臨床解決大段骨缺損、骨不愈合等難題的關鍵。破骨細胞來源于巨噬細胞，目前有關巨噬細胞對成骨細胞成骨性能影響的研究主要集中在巨噬細胞對MSCs成骨分化的影響[6]。前成骨細胞由MSCs分化而來，是骨形成的關鍵細胞。在骨折局部及骨修復材料植入早期，局部低氧誘導巨噬細胞發生氧化應激。明確該狀態下的巨噬細胞對前成骨細胞成骨分化的影響，對促進骨組織修復再生具有重要意義。
活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）包括超氧陰離子（O2-）、H2O2、羥自由基（OH-）和有機過氧化物等[7]，來源于正常需氧細胞代謝過程[8]，在刺激動植物細胞信號通路過程中發揮重要作用，以利于細胞應對內外環境的變化[9]。細胞內ROS的產生與清除失平衡，導致過多ROS在細胞內堆積時，將引起細胞發生氧化應激[10]。抗氧化應激系統隨之激活，即氧化應激還原酶的表達，包括SOD、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等，以保護機體處于平衡狀態[10-11]。本實驗以SOD為氧化應激指標，發現25、50、100 μmol/L H2O2處理RAW264.7細胞1 h，明顯提高細胞內SOD表達，表明RAW264.7細胞發生氧化應激。同時，細胞生長檢測結果顯示：H2O2濃度為25、50、100 μmol/L時，培養1 h后細胞增殖率明顯高于3、6 h；且1 h時隨著H2O2濃度的增加，RAW264.7細胞增殖率不斷下降。因此，為了保證細胞活力，篩選出25 μmol/L、1 h為H2O2構建RAW264.7細胞氧化應激模型的最佳濃度和作用時間。
巨噬細胞是多功能細胞，在不同的外部環境中表現出不同的功能與表型[12]。大量文獻[13-16]證實H2O2可活化RAW264.7細胞，促進炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-18及趨化因子單核細胞趨化蛋白（monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1）、巨噬細胞炎性蛋白2（macrophage inflammatory protein 2，MIP-2）及CCL8～11、13、15、20等的釋放。氧化應激通過改變RAW264.7細胞炎性因子的分泌，影響骨形成，在骨組織修復再生過程中起重要作用。成骨細胞向損傷部位的遷移及增殖是骨組織修復再生的首要步驟，促進成骨細胞向病損部位趨化及局部增殖，對于骨組織修復再生有著重要意義。MC3T3-E1細胞遷移和增殖受多種因素的影響。Ota等[17]和Takeyama等[18]發現，TGF-β可促進細胞的遷移和增殖；Zhou等[19]發現在骨組織修復重建過程中，TNF-α可活化p38 MAPK信號通路以促進成骨細胞的遷移和增殖，但是大劑量TNF-α抑制其增殖；同時BMP-2、OSM等也會影響MC3T3-E1細胞遷移和增殖。已有文獻表明，巨噬細胞在氧化應激活化狀態下，TNF-α分泌增多，TGF-β減少[16]。本實驗發現共培養條件下，氧化應激活化RAW264.7細胞上清明顯促進MC3T3-E1細胞的遷移而抑制其增殖，分析可能是上清液中含有大量TNF-α所致。
成骨分化包括成骨細胞增殖、基質成熟和基質礦化3個關鍵步驟[20]。TNF-α、IL-1β是影響成骨分化的重要炎性因子。Lu等[21]認為TNF-α可通過同源異型盒蛋白Prx1抑制下游Runx2表達，從而抑制MSCs的成骨分化。Osta等[22]也認為TNF-α既可以抑制成骨分化，又可以促進成骨分化，主要取決于TNF-α的劑量、作用時間及細胞系類型。目前認為IL-1β主要作用是促進成骨細胞成骨分化[23-24]。氧化應激狀態下巨噬細胞可分泌大量TNF-α和IL-1β。過量的TNF-α對成骨細胞成骨分化起抑制作用。本研究也發現氧化應激活化RAW264.7細胞上清從基因水平抑制MC3T3-E1細胞成骨分化。提示TNF-α是氧化應激活化RAW264.7細胞抑制MC3T3-E1細胞成骨分化的重要因素。
綜上述，25 μmol/L、1 h為H2O2構建RAW264.7細胞氧化應激模型的最佳濃度和作用時間。氧化應激活化RAW264.7細胞上清促進MC3T3-E1細胞遷移，而抑制其增殖及成骨相關基因的表達，提示TNF-α可能是關鍵因子。本實驗發現，氧化應激活化RAW264.7細胞通過分泌不同的炎性因子從細胞遷移、增殖、成骨分化3個方面來影響MC3T3-E1細胞的成骨性能，進而影響骨組織的修復再生。因此，可通過改變骨折局部早期巨噬細胞的表型，以改變局部炎癥微環境，為臨床大段骨缺損及骨不愈合的治療提供新的突破口。同時，綜合結果顯示氧化應激活化巨噬細胞對成骨細胞的成骨分化表現出抑制作用。因此，在本研究基礎上，需進一步探索氧化應激活化巨噬細胞影響成骨細胞成骨分化的具體作用方式及相關機制，找到促進成骨的有利因素和不利因素及其作用的關鍵靶點。探索對不同影響因素及其靶點的干預，以達到促進骨修復與再生、解決臨床大段骨缺損及骨不愈合等難題的目的，同時為臨床促進骨組織再生提供進一步理論依據和策略。
嚴重創傷、腫瘤切除、骨感染等原因所致的大段骨缺損、骨不愈合等臨床常見，目前主要治療方法包括藥物、內固定、自體或同種異體骨以及組織工程骨移植修復等，但難以達到理想治療效果。骨組織愈合是一個復雜過程，包括早期單核巨噬細胞募集、炎性因子產生、MSCs募集、成骨細胞的成骨分化等。生理條件下，骨組織愈合受多方面影響，其中巨噬細胞發揮關鍵作用。研究表明，巨噬細胞通過調控成骨細胞的成骨分化影響骨形成，如通過分泌BMP-2、抑瘤素M（oncostatin M，OSM）、外泌體等促進成骨分化，通過分泌TNF-α等抑制成骨分化[1-4]。在骨折局部及移植材料植入早期，損傷部位處于缺血、缺氧狀態，周圍浸潤的巨噬細胞發生低氧應激、氧化應激甚至內質網應激。目前，關于氧化應激狀態下巨噬細胞對成骨細胞成骨分化的影響未見報道。因此，本研究利用H2O2刺激巨噬細胞RAW264.7細胞，誘導巨噬細胞發生氧化應激，收集氧化應激狀態下細胞上清，將其與成骨細胞MC3T3-E1細胞共培養，探索其對MC3T3-E1細胞增殖、遷移及成骨分化的影響，為臨床促進骨組織再生提供新的治療思路。
1 材料與方法
1.1 主要試劑與儀器
RAW264.7細胞系、MC3T3-E1細胞系由美國ATCC細胞庫提供。DMEM、α-MEM培養基（HyClone公司，美國）；FBS（杭州四季青生物工程有限公司）；胰蛋白酶（GIBCO公司，美國）；Trizol Riagent試劑（Invitrogen公司，美國）；MTS、RIPA裂解液、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所）；PBS、H2O2（Sigma公司，美國）；氯仿、異丙醇（廣州化學試劑廠）；逆轉錄試劑盒、實時定量PCR試劑盒（TaKaRa公司，日本）。
細胞培養瓶、培養板（Corning公司，美國）；TS100倒置光學/熒光多功能顯微鏡（Nikon公司，日本）；NanoDrop 2000分光光度計、移液器、酶標儀（Thermo公司，美國）；PCR儀（Bio-Rad公司，美國）。引物由華大基因公司合成。
1.2 細胞培養及傳代
取MC3T3-E1細胞系，加入完全培養液（含10%FBS的α-MEM培養基），置于37℃、5% CO2及95%飽和濕度的恒溫培養箱中培養，每2～3天換液1次，待細胞生長至80%～90%匯合度時，棄原培養液，PBS清洗2～3次，37℃、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化1～3 min；加入完全培養液終止反應，用移液器反復吹打若干次。室溫下，以離心半徑10 cm，1 200 r/min離心5 min，棄上清后加入完全培養液重懸細胞，按1:4比例進行傳代培養。
取RAW264.7細胞系，加入完全培養液（含10%FBS的DMEM培養基），置于37℃、5% CO2及95%飽和濕度的恒溫培養箱中培養，每2～3天換液1次，待細胞生長至80%～90%匯合度時，棄1/3培養基，將細胞從培養瓶壁上刮下，用移液器反復吹打若干次，待細胞完全散開后，按1:5比例進行傳代培養。
1.3 RAW264.7細胞檢測
1.3.1 細胞生長檢測
取第7代RAW264.7細胞接種于96孔板，每孔2×104個細胞，完全培養液中孵育12 h。待細胞貼壁后，棄孔內培養基，每孔加入100 μL無血清DMEM培養基。將細胞分為4組，分別加入濃度為0、25、50、100 μmol/L H2O2進行培養，每組設5個復孔。設無細胞孔為調零孔。培養1、3、6 h后，每組取5孔，采用MTS法檢測細胞活力，于酶標檢測儀490 nm波長處測定吸光度（A）值，按照以下公式計算細胞增殖率。細胞增殖率=[（0 μmol/L組A值-H2O2各濃度處理組A值）-調零孔A值]/（0 μmol/L組A值-調零孔A值）×100%。
1.3.2 SOD檢測
取第7代RAW264.7細胞接種于6孔板，每孔2×106個細胞，完全培養液中孵育12 h。細胞同1.3.1方法分組培養，每組設3個復孔。培養1 h后收集細胞，冰面上勻漿，4℃，以離心半徑5 cm，12 000 r/min離心5 min，取上清。采用檢測試劑盒測定上清液中SOD含量。
根據MTS及SOD檢測結果，確定H2O2刺激構建Raw264.7細胞氧化應激模型最佳濃度和作用時間，并進行下一步實驗。
1.4 RAW264.7細胞上清液收集
取第7代RAW264.7細胞接種于6孔板，每孔2×106個。待細胞融合達80%時，于培養板中加含最佳濃度H2O2的無血清培養基，對RAW264.7細胞進行氧化應激處理，每孔2 mL。以最佳作用時間處理后棄培養基，PBS沖洗3次，更換為含10%FBS的完全培養基。37℃、5% CO2及95%飽和濕度的恒溫培養箱中孵育24 h后收集上清液，以離心半徑10 cm，1 200 r/min離心5 min，去除細胞碎片。同法收集未氧化應激RAW264.7細胞上清液。各上清液均于細胞誘導實驗前準備。
1.5 MC3T3-E1細胞檢測
1.5.1 細胞生長檢測
取第7代MC3T3-E1細胞接種于96孔板，每孔1×104個細胞。24 h待細胞貼壁后，棄培養基，加入新鮮培養基。根據培養條件不同，實驗分為3組。空白對照組（A組），加入100 μL無血清DMEM培養基；陰性對照組（B組），加入100 μL 1.4中制備的未氧化應激RAW264.7細胞上清液；實驗組（C組），加入100 μL 1.4中制備的氧化應激RAW264.7細胞上清液。培養1、2、3 d后，各組取5孔細胞，同1.3.1方法檢測細胞增殖率，取均值。
1.5.2 細胞遷移能力檢測
取第7代MC3T3-E1細胞接種于24孔板，每孔1×105個細胞。于含10%FBS的α-MEM培養基中孵育24 h，待細胞貼壁后，于培養板底部用黑色標記筆標記，然后用200 μL槍頭垂直于標記線劃痕。棄培養基，PBS沖洗3次，棄劃下的細胞。同1.5.1方法分組后，分別加入對應培養基繼續孵育。利用Image J軟件測量12、24 h時細胞遷移距離。
1.6 RAW264.7細胞上清液對MC3T3-E1細胞成骨影響
1.6.1 實驗分組及方法
取第7代MC3T3-E1細胞接種于6孔板，每孔2×105個。根據培養條件不同，實驗分為4組。空白對照組，以完全培養基培養；陽性對照組，以含50 μg/mL維生素C及10 nmol/L β甘油磷酸鈉的完全培養基進行成骨誘導培養；正常對照組，以含50 μg/mL維生素C及10 nmol/L的β甘油磷酸鈉的完全培養基及未氧化應激RAW264.7細胞上清液培養；實驗組，以含50 μg/mL維生素C及10 nmol/L β甘油磷酸鈉的完全培養基及氧化應激RAW264.7細胞上清液培養。
1.6.2 RT-PCR檢測
培養3、7、14 d，檢測細胞內成骨相關基因ALP、Runx2、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、Ⅰ型膠原蛋白（collagen typeⅠ，COL-Ⅰ）、骨鈣素（osteocalcin，OC）、骨唾液酸蛋白（bone sialoprotein，BSP）表達水平。用Trizol法提取樣本內總RNA并進行逆轉錄，cDNA置于—20℃保存。反應總體系10 μL；反應條件：95℃、10 min，95℃、15 s，60℃、30 s，72℃、20 s，40個循環。以GAPDH為內參，基因擴增引物序列見表 1。用2-ΔΔCt計算各目的基因相對表達量，實驗重復3次。
表1
各基因引物序列
Table1.
Primer sequences for target genes
1.7 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 RAW264.7細胞檢測
2.1.1 細胞生長檢測
組內比較：0 μmol/L濃度組培養1、3、6 h間細胞增殖率比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。25、50、100 μmol/L濃度組培養1 h時細胞增殖率明顯高于3、6 h時，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；培養3、6 h，25 μmol/L濃度組細胞增殖率比較差異有統計學意義（P < 0.05）；50、100 μmol/L濃度組細胞增殖率明顯下降，均低于85%，未作統計分析。
組間比較：培養1、3、6 h時，25、50、100 μmol/L濃度組細胞活力明顯低于0 μmol/L濃度組，50、100 μmol/L濃度組低于25 μmol/L濃度組，差異有統計學意義（P < 0.05）。50、100 μmol/L濃度組組間未作統計分析。見圖 1。
圖1
經不同濃度H2O2培養后RAW264.7細胞生長曲線??圖 2 ??經不同上清液培養后MC3T3-E1細胞生長曲線?? 圖 3 ?? MC3T3-E1細胞遷移能力觀察（倒置相差顯微鏡×50）?從左至右分別為0、12、24 h ??? A組??? B組??? C組
Figure1.
The growth curve of RAW264.7 cells macrophages after stimulated by H2O2 in different concentrations ??Fig.2 ??The growth curve of MC3T3-E1 cells after stimulated by different supernatants ??Fig.3 ??MC3T3-E1 cells migration at different time points after cell scratch (Inverted phase contrast microscope×50) ?From left to right: 0, 12, and 24 hours ??? Group A ??? Group B ??? Group C
2.1.2 SOD檢測
培養1 h時，25、50、100 μmol/L濃度組細胞SOD含量分別為（1.261±0.058）、（1.321±0.042）、（1.438±0.096）U，顯著高于0 μmol/L濃度組的（0.475±0.023）U，差異有統計學意義（P < 0.05）；且隨著濃度增加，SOD含量呈增加趨勢，但組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。
結合MTS和SOD檢測結果顯示，H2O2刺激構建Raw264.7細胞氧化應激模型最佳濃度為25 μmol/L、作用時間為1 h。
2.2 MC3T3-E1細胞檢測
2.2.1 細胞生長檢測
組內比較：A、B、C組培養2、3 d時細胞增殖率與1 d時比較，差異有統計學意義（P < 0.05）；2、3 d間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。
組間比較：1、2、3 d B、C組細胞增殖率顯著高于A組，差異有統計學意義（P < 0.05）；C組低于B組，且2、3 d時組間比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖 2。
2.2.2 細胞遷移能力檢測
12 h時B、C組MC3T3-E1細胞遷移顯著快于A組，C組顯著快于B組；A、B、C組細胞遷移距離分別為（38.870±0.507）、（62.020±1.540）、（71.690±2.022）mm，組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。24 h時除A組細胞尚存在劃痕外，B、C組劃痕已經被細胞爬滿，故24 h未測量細胞間距離。見圖 3。
2.3 RAW264.7細胞上清液對MC3T3-E1細胞成骨影響
組內比較：各組7、14 d ALP mRNA相對表達量均高于3 d，各時間點間比較差異有統計學意義（P < 0.05）。各組Runx2、OC、BSP、OPN、COL-ⅠmRNA相對表達量均呈逐漸增加趨勢，各時間點間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）
組間比較：3 d時，各組各指標比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。7、14 d時，實驗組和空白對照組ALP、Runx2 mRNA相對表達量明顯低于陽性對照組及正常對照組，實驗組、正常對照組及陽性對照組OPN、COL-I mRNA相對表達量明顯高于空白對照組，實驗組、正常對照組及空白對照組OC、BSP mRNA明顯高于陽性對照組，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。其余各時間點組間比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。見圖 4。
圖4
RT-PCR檢測各時間點MC3T3-E1細胞成骨相關基因表達
ⓐ ALP ⓑ Runx2 ⓒ OPN ⓓ OC ⓔ BSP ⓔ COL-Ⅰ
ⓐ ALP ⓑ Runx2 ⓑ OPN ⓒ OC ⓓ BSP ⓔ COL-Ⅰ
3 討論
骨組織是破骨細胞不斷吸收與成骨細胞不斷生成的動態平衡結果[5]，探索免疫細胞與成骨細胞的相互作用原理，尋找有效方法、排除不利因素來提高局部成骨細胞成骨性能及促進骨組織的修復再生，是臨床解決大段骨缺損、骨不愈合等難題的關鍵。破骨細胞來源于巨噬細胞，目前有關巨噬細胞對成骨細胞成骨性能影響的研究主要集中在巨噬細胞對MSCs成骨分化的影響[6]。前成骨細胞由MSCs分化而來，是骨形成的關鍵細胞。在骨折局部及骨修復材料植入早期，局部低氧誘導巨噬細胞發生氧化應激。明確該狀態下的巨噬細胞對前成骨細胞成骨分化的影響，對促進骨組織修復再生具有重要意義。
活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）包括超氧陰離子（O2-）、H2O2、羥自由基（OH-）和有機過氧化物等[7]，來源于正常需氧細胞代謝過程[8]，在刺激動植物細胞信號通路過程中發揮重要作用，以利于細胞應對內外環境的變化[9]。細胞內ROS的產生與清除失平衡，導致過多ROS在細胞內堆積時，將引起細胞發生氧化應激[10]。抗氧化應激系統隨之激活，即氧化應激還原酶的表達，包括SOD、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等，以保護機體處于平衡狀態[10-11]。本實驗以SOD為氧化應激指標，發現25、50、100 μmol/L H2O2處理RAW264.7細胞1 h，明顯提高細胞內SOD表達，表明RAW264.7細胞發生氧化應激。同時，細胞生長檢測結果顯示：H2O2濃度為25、50、100 μmol/L時，培養1 h后細胞增殖率明顯高于3、6 h；且1 h時隨著H2O2濃度的增加，RAW264.7細胞增殖率不斷下降。因此，為了保證細胞活力，篩選出25 μmol/L、1 h為H2O2構建RAW264.7細胞氧化應激模型的最佳濃度和作用時間。
巨噬細胞是多功能細胞，在不同的外部環境中表現出不同的功能與表型[12]。大量文獻[13-16]證實H2O2可活化RAW264.7細胞，促進炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-18及趨化因子單核細胞趨化蛋白（monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1）、巨噬細胞炎性蛋白2（macrophage inflammatory protein 2，MIP-2）及CCL8～11、13、15、20等的釋放。氧化應激通過改變RAW264.7細胞炎性因子的分泌，影響骨形成，在骨組織修復再生過程中起重要作用。成骨細胞向損傷部位的遷移及增殖是骨組織修復再生的首要步驟，促進成骨細胞向病損部位趨化及局部增殖，對于骨組織修復再生有著重要意義。MC3T3-E1細胞遷移和增殖受多種因素的影響。Ota等[17]和Takeyama等[18]發現，TGF-β可促進細胞的遷移和增殖；Zhou等[19]發現在骨組織修復重建過程中，TNF-α可活化p38 MAPK信號通路以促進成骨細胞的遷移和增殖，但是大劑量TNF-α抑制其增殖；同時BMP-2、OSM等也會影響MC3T3-E1細胞遷移和增殖。已有文獻表明，巨噬細胞在氧化應激活化狀態下，TNF-α分泌增多，TGF-β減少[16]。本實驗發現共培養條件下，氧化應激活化RAW264.7細胞上清明顯促進MC3T3-E1細胞的遷移而抑制其增殖，分析可能是上清液中含有大量TNF-α所致。
成骨分化包括成骨細胞增殖、基質成熟和基質礦化3個關鍵步驟[20]。TNF-α、IL-1β是影響成骨分化的重要炎性因子。Lu等[21]認為TNF-α可通過同源異型盒蛋白Prx1抑制下游Runx2表達，從而抑制MSCs的成骨分化。Osta等[22]也認為TNF-α既可以抑制成骨分化，又可以促進成骨分化，主要取決于TNF-α的劑量、作用時間及細胞系類型。目前認為IL-1β主要作用是促進成骨細胞成骨分化[23-24]。氧化應激狀態下巨噬細胞可分泌大量TNF-α和IL-1β。過量的TNF-α對成骨細胞成骨分化起抑制作用。本研究也發現氧化應激活化RAW264.7細胞上清從基因水平抑制MC3T3-E1細胞成骨分化。提示TNF-α是氧化應激活化RAW264.7細胞抑制MC3T3-E1細胞成骨分化的重要因素。
綜上述，25 μmol/L、1 h為H2O2構建RAW264.7細胞氧化應激模型的最佳濃度和作用時間。氧化應激活化RAW264.7細胞上清促進MC3T3-E1細胞遷移，而抑制其增殖及成骨相關基因的表達，提示TNF-α可能是關鍵因子。本實驗發現，氧化應激活化RAW264.7細胞通過分泌不同的炎性因子從細胞遷移、增殖、成骨分化3個方面來影響MC3T3-E1細胞的成骨性能，進而影響骨組織的修復再生。因此，可通過改變骨折局部早期巨噬細胞的表型，以改變局部炎癥微環境，為臨床大段骨缺損及骨不愈合的治療提供新的突破口。同時，綜合結果顯示氧化應激活化巨噬細胞對成骨細胞的成骨分化表現出抑制作用。因此，在本研究基礎上，需進一步探索氧化應激活化巨噬細胞影響成骨細胞成骨分化的具體作用方式及相關機制，找到促進成骨的有利因素和不利因素及其作用的關鍵靶點。探索對不同影響因素及其靶點的干預，以達到促進骨修復與再生、解決臨床大段骨缺損及骨不愈合等難題的目的，同時為臨床促進骨組織再生提供進一步理論依據和策略。