引用本文： 張釗, 李曉飛, 王燕燕, 崔召偉, 陳著科, 張海寧. 慢病毒介導的多基因聯合轉染BMSCs注射治療食蟹猴膝關節炎的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(9): 1153-1159. doi: 10.7507/1002-1892.20160235 復制
骨關節炎（osteoarthritis，OA）是機械性和生物性因素共同作用，導致關節軟骨細胞、細胞外基質等合成和降解失平衡，呈進行性加重的關節疾病。隨年齡增長OA發病率逐漸增加，70歲以上人群發病率高達80%[1-2]。目前OA治療包括非藥物治療、藥物治療、手術治療等，藥物治療效果有限，且副作用較多；手術治療雖效果明確，但費用高、創傷大。基因治療是將正常基因或有治療作用的DNA序列導入靶細胞，以糾正基因缺陷或發揮治療作用。研究表明，增強保護性基因與抑制破壞性基因聯合治療有利于OA軟骨的修復[3]。環氧合酶2（cyclooxygenase 2，COX-2）[4]、聚蛋白多糖酶1（Aggrecanase-1）[5]、IGF-1[6]與關節軟骨的損傷修復關系密切，本實驗通過構建攜帶COX-2-siRNA、Aggrecanase-1-siRNA、IGF-1過表達基因的慢病毒載體，將其轉染至BMSCs后，注射至食蟹猴骨關節炎模型膝關節腔內，觀察關節液中炎性因子及關節軟骨的變化，從而為OA基因治療的研究提供參考。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康3歲食蟹猴9只，雌性5只、雄性4只，體質量（6.0±0.3）kg，由濟南林業局提供。FBS、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素（GIBCO公司，美國）；IL-1、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、Aggrecanase-1、IGF-1 ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）；Ⅱ型膠原一抗、二抗（北京博奧森生物技術有限公司）；RT-PCR試劑盒（TaKaRa公司，日本）。3.0T MRI儀（GE公司，美國）。
本實驗攜帶COX-2-siRNA、Aggrecanase-1-siR NA、IGF-1過表達基因的慢病毒載體及慢病毒均由上海吉瑪制藥技術有限公司構建完成，病毒自身攜帶綠色熒光蛋白基因。經預實驗檢測重組慢病毒最佳轉染復數為40。
1.2 慢病毒介導多基因共轉染BMSCs
1.2.1 BMSCs分離培養及傳代
實驗用骨髓組織由2015年2月-3月青島大學附屬醫院收治的10例髖關節OA患者自愿捐贈，其中男5例、女5例；年齡59～71歲，平均65歲。本實驗經青島大學附屬醫院倫理委員會批準。于人工全髖關節置換術中取5 mL骨髓，與含0.01mol/L FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM混勻后，移入25 cm2培養瓶中。置于37℃、5%CO2保溫箱中培養，3 d后半定量換液，去除非貼壁細胞，之后每2～3天全換液1次。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態、貼壁情況，待細胞融合達70%～80%后進行傳代。取第3代細胞進行實驗。
1.2.2 細胞轉染
第3代BMSCs用2.5 g/L胰蛋白酶消化后接種至6孔板，每孔5×105個細胞；分為病毒組及空病毒組。病毒組以最佳轉染復數加入慢病毒（每孔2 μL）轉染細胞，空病毒組以不含目的基因的空慢病毒轉染。轉染24 h后更換含血清培養液進行培養。
1.2.3 轉染后細胞觀測
①細胞生長觀察：倒置相差顯微鏡下觀察兩組細胞每天生長狀態；培養8 d內，每天利用細胞計數板進行細胞計數，并繪制生長曲線。以正常細胞作為對照。②RT-PCR檢測：于轉染培養1周后，取病毒組、空病毒組細胞及正常BMSCs（正常對照組），參照RT-PCR試劑盒說明書，檢測COX-2、Aggrecanase-1及IGF-1 mRNA的表達。以GAPDH作為內參，以目的基因與GAPDH表達量的比值，作為目的基因相對表達量。實驗重復3次。
1.3 實驗分組及方法
9只食蟹猴肌肉注射安定（1 mg/kg）與氯胺酮（1 mg/kg）麻醉后，按照Hulth造模法[7]制備OA模型。于右膝髕骨正中作一縱切口，逐層切開暴露膝關節，切斷前、后交叉韌帶與內側半月板，關閉切口。術后3 d內肌肉注射克林霉素（15～25 mg/kg），預防感染。術后實驗動物不限制活動。
將OA模型隨機分為3組，每組3只，分別為病毒組、空病毒組、空白對照組。模型制備術后6周，病毒組及空病毒組動物右膝關節腔內分別注射1.2.2獲得的對應1 mL BMSCs（約1×107個），空白對照組注射1 mL生理鹽水。實驗動物左膝作為正常對照組。
1.4 觀測指標
1.4.1 一般情況
術后觀察各組動物存活以及切口愈合、飲食等情況。
1.4.2 ELISA檢測
注射后1、4、6周，抽取各組動物雙膝關節液0.5 mL，參照ELISA試劑盒說明書檢測PGE2、IL-1、Aggrecanase-1、IGF-1濃度。
1.4.3 MRI檢查
注射后6周，各組動物同上法麻醉，進行雙膝關節MRI掃描，觀察膝關節軟骨有無異常信號。
1.4.4 大體觀察
MRI檢查后，放血處死各組動物，按照原手術切口入路，觀察關節軟骨缺損及增生情況，并與正常膝關節軟骨進行比較。
1.4.5 組織學及免疫組織化學染色觀察
大體觀察后，取各組缺損區周圍膝關節軟骨以及健側膝關節軟骨，石蠟固定后切片，片厚5 μm。取部分切片行HE染色，鏡下觀察軟骨細胞大小及排列情況。于200倍鏡下，取3個視野，參照改良Pineda評分標準[8]對關節軟骨缺損修復區進行組織學評價，包括以下方面：①細胞形態：透明軟骨0分，以透明軟骨為主1分，以纖維軟骨為主2分，以非軟骨為主3分，全部非軟骨4分。②基質染色：正常染色0分，輕度減弱1分，明顯減弱2分，未著色3分。③表面平整：平整范圍 > 3/4，0分；1/2～3/4，1分；1/4～1/2，2分；未達 < 1/4，3分。④軟骨厚度：達正常厚度的2/3，0分；1/3～2/3，1分；未達1/3，2分。⑤與宿主結合：兩邊結合0分，一邊結合1分，不結合2分。
其余切片行Ⅱ型膠原免疫組織化學染色，鏡下觀察軟骨基質染色情況及分布。
1.4.6 RT-PCR檢測
取各組缺損區周圍膝關節軟骨以及健側膝關節軟骨，同1.2.3方法檢測組織COX-2、Aggrecanase-1及IGF-1 mRNA表達。
1.5 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析，數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 慢病毒轉染后細胞觀察
2.1.1細胞生長觀察倒置相差顯微鏡下觀察，兩組細胞轉染后形態無明顯差異，均呈梭形（圖 1）。通過細胞計數，發現轉染細胞經1～2 d潛伏期后即進入對數生長期，6～8 d達平臺期，各組細胞生長曲線基本平行，提示慢病毒轉染對細胞生長無明顯不良影響（圖 2）。
圖1
病毒轉染后72 h兩組細胞形態觀察（倒置相差顯微鏡×100）???病毒組???空病毒組??圖 2 ??病毒轉染后各組細胞生長曲線
Figure1.
Cell morphology at 72 hours after transfection (Inverted phase contrast microscope×100) ??? Virus group ???Blank-virus group ??Fig.2 ??The growth curve of BMSCs after transfection
2.1.2 RT-PCR檢測
與空病毒組、正常對照組比較，病毒組COX-2、Aggrecanase-1 mRNA表達明顯降低，IGF-1 mRNA表達明顯增加，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。空病毒組與正常對照組比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。見表 1。
表1
RT-PCR檢測各組細胞COX-2、Aggrecanase-1及IGF-1 mRNA相對表達量（n=3, x±s）
Table1.
Relative expressions of COX-2, Aggrecanase-1, and IGF-1 mRNA in each group by RT-PCR(n=3, x±s)
2.2 動物實驗觀察
2.2.1 一般情況
各組動物均存活至實驗完成，切口愈合、飲食情況良好。
2.2.2 ELISA檢測
注射后1、4、6周，病毒組PGE2、Aggrecanase-1、IL-1濃度明顯低于空病毒組、空白對照組，但IGF-1濃度明顯增高，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。空病毒組與空白對照組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。病毒組、空病毒組、空白對照組以上指標均顯著高于正常對照組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見表 2。
表2
ELISA檢測各組膝關節液中PGE2、IL-1、Aggrecanase-1、IGF-1濃度（ng/L，x±s）
Table2.
Concentrations of PGE2, IL-1, Aggrecanase-1, and IGF-1 in each group by ELISAng/L, x±s)
2.2.3 MRI檢查
正常對照組關節面未見明顯異常。病毒組、空病毒組及空白對照組關節面均出現異常高密度影，其中病毒組區域最小，空病毒組可見較大異常信號區，空白對照組高密度影區面積最大。見圖 3。
圖3
注射后6周各組MRI檢查???病毒組???空病毒組???空白對照組???正常對照組??圖 4 ??注射后6周各組關節軟骨大體觀察???病毒組???空病毒組???空白對照組???正常對照組?? 圖 5 ??注射后6周各組關節軟骨組織學觀察（HE×200）???病毒組???空病毒組???空白對照組???正常對照組??圖 6 ??注射后6周各組關節軟骨Ⅱ型膠原免疫組織化學染色觀察（×200）???病毒組???空病毒組???空白對照組???正常對照組
Figure3.
MRI examination at 6 weeks after injection ??? Virus group???Blank-virus group??? Blank control group ??? Normal control group ??Fig.4 ??General observation of cartilage at 6 weeks after injection ??? Virus group ??? Blank-virus group ??? Blank control group ??? Normal control group ??Fig.5?? Histological observation of cartilage at 6 weeks after injection (HE×200) ??? Virus group???Blank-virus group ??? Blank control group ??? Normal control group ??Fig.6 ??Immunohistochemical observation of collagen type Ⅱ of cartilage at 6 weeks after injection (×200) ??? Virus group ??? Blank-virus group ??? Blank control group ??? Normal control group
2.2.4 大體觀察
正常對照組膝關節面光滑，無明顯缺損。病毒組、空病毒組及空白對照組膝關節內、外髁軟骨均出現磨損，周圍骨質增生，呈早期OA表現；其中病毒組軟骨修復情況優于空病毒組及空白對照組，僅內髁可見一軟骨缺損區，外髁基本正常；空病毒組內髁軟骨缺損較大，外髁無明顯缺損增生；空白對照組內髁可見較大面積軟骨缺損，外髁可見骨質增生。見圖 4。
2.2.5 組織學觀察
鏡下見，正常對照組軟骨細胞分布均勻，排列整齊，層次清楚，無簇集軟骨細胞，潮線完整。空白對照組和空病毒組軟骨細胞排列紊亂，出現細胞分離和簇集現象；病毒組軟骨細胞增生明顯，與空病毒組及空白對照組相比密度較大，細胞核大，染色深。病毒組、空病毒組及空白對照組參照Mankin關節軟骨病理評分標準[9]均符合早期OA表現。見圖 5。
參照改良Pineda評分標準，正常對照組、病毒組、空病毒組及空白對照組評分分別為0、（3.256±0.658）、（7.435±0.875）、（12.754±0.986）分，組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。
2.2.6 免疫組織化學染色
正常對照組細胞質呈棕黃色染色，較均勻，細胞核呈藍色；病毒組細胞質染色較空病毒組及空白對照組深，偶爾可見棕黃色顆粒，軟骨細胞較多；空病毒組及空白對照組染色淺，軟骨細胞較少。見圖 6。
2.2.7 RT-PCR檢測
與空病毒組和空白對照組相比，病毒組COX-2、Aggrecanase-1 mRNA表達明顯降低，IGF-1 mRNA表達明顯增高，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；空病毒組與空白對照組間比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。病毒組、空病毒組、空白對照組以上指標均顯著高于正常對照組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見表 3。
表3
RT-PCR檢測各組軟骨組織COX-2、Aggrecanase-1及IGF-1 mRNA相對表達量（x±s）
Table3.
Relative expressions of COX-2, Aggrecanase-1, and IGF-1 mRNA in each group by RT-PCR(x±s)
3 討論
BMSCs作為組織工程與轉基因技術種子細胞，具有多向分化能力，能在體外誘導分化為不同細胞，如成骨、軟骨、脂肪、肌樣細胞等[10-11]，通過組織工程技術能修復關節炎軟骨損傷，在兔OA模型中干細胞分化成骨也取得成功[12]。在OA的發生發展過程中，COX-2、Aggrecanase-1、IGF-1是關鍵基因，目前研究較多。COX-2表達增多使PGE2的合成上升，會促進炎癥發展，進一步導致關節損害[13]。Ag gre ca nase-1活性增強后會導致更多的蛋白多糖被降解，軟骨進一步缺損，加重關節的器質性損害及功能障礙[13-14]。IGF-1是調節軟骨細胞基質合成最重要的細胞因子，可以有效促進軟骨基質合成，抑制軟骨基質降解，從而維持關節軟骨的正常功能[15-16]。
在基因治療領域中，單基因或者雙基因研究相對較多，但多基因研究較少，本實驗同時轉入3個基因，以期抑制破壞性基因的表達，增強有益性基因的表達，減少有害炎性因子的產生，增加有益細胞因子的表達，共同保護關節軟骨，充分發揮基因治療的優勢。通過構建攜帶COX-2-siRNA、Aggrecanase-1-siRNA和IGF-1過表達基因的慢病毒載體，然后轉染BMSCs，成功地在細胞水平抑制了COX-2和Aggre canase-1基因表達，增強了IGF-1基因的表達；把基因轉染后的干細胞注入食蟹猴OA模型膝關節腔后，測得關節軟骨的基因表達發生了與細胞水平一致的變化，其關節液中炎性因子PGE2、IL-1含量顯著降低，Aggrecanase-1含量也進一步下降，而IGF-1含量升高，與Yuan等[17]的體外研究結果相符，并且該作用可持續6周。組織學觀察顯示，該方法能較好地保護軟骨基質，促進軟骨基質和軟骨細胞的生成，提示基因治療早期OA的有效性。
基因治療往往針對OA發病過程中的某一個環節，但病情發展是動態的，涉及的關節也多樣，不同的病損區域處于不同的病理階段，所以合理的基因治療要以OA病理機制為前提，對病情進展中的多個環節進行多點干預，阻斷或者延緩病情的發展[18-20]。本實驗研究對象為靈長類動物食蟹猴，膝關節受力特點與人類相近，因此提高了實驗結論的參考價值。但由于實驗動物昂貴，本實驗樣本量相對較少，且觀察時間相對較短，同時實驗動物基本為早期OA表現，有關基因治療中晚期OA的可行性及療效有待進一步觀察。
骨關節炎（osteoarthritis，OA）是機械性和生物性因素共同作用，導致關節軟骨細胞、細胞外基質等合成和降解失平衡，呈進行性加重的關節疾病。隨年齡增長OA發病率逐漸增加，70歲以上人群發病率高達80%[1-2]。目前OA治療包括非藥物治療、藥物治療、手術治療等，藥物治療效果有限，且副作用較多；手術治療雖效果明確，但費用高、創傷大。基因治療是將正常基因或有治療作用的DNA序列導入靶細胞，以糾正基因缺陷或發揮治療作用。研究表明，增強保護性基因與抑制破壞性基因聯合治療有利于OA軟骨的修復[3]。環氧合酶2（cyclooxygenase 2，COX-2）[4]、聚蛋白多糖酶1（Aggrecanase-1）[5]、IGF-1[6]與關節軟骨的損傷修復關系密切，本實驗通過構建攜帶COX-2-siRNA、Aggrecanase-1-siRNA、IGF-1過表達基因的慢病毒載體，將其轉染至BMSCs后，注射至食蟹猴骨關節炎模型膝關節腔內，觀察關節液中炎性因子及關節軟骨的變化，從而為OA基因治療的研究提供參考。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康3歲食蟹猴9只，雌性5只、雄性4只，體質量（6.0±0.3）kg，由濟南林業局提供。FBS、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素（GIBCO公司，美國）；IL-1、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、Aggrecanase-1、IGF-1 ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）；Ⅱ型膠原一抗、二抗（北京博奧森生物技術有限公司）；RT-PCR試劑盒（TaKaRa公司，日本）。3.0T MRI儀（GE公司，美國）。
本實驗攜帶COX-2-siRNA、Aggrecanase-1-siR NA、IGF-1過表達基因的慢病毒載體及慢病毒均由上海吉瑪制藥技術有限公司構建完成，病毒自身攜帶綠色熒光蛋白基因。經預實驗檢測重組慢病毒最佳轉染復數為40。
1.2 慢病毒介導多基因共轉染BMSCs
1.2.1 BMSCs分離培養及傳代
實驗用骨髓組織由2015年2月-3月青島大學附屬醫院收治的10例髖關節OA患者自愿捐贈，其中男5例、女5例；年齡59～71歲，平均65歲。本實驗經青島大學附屬醫院倫理委員會批準。于人工全髖關節置換術中取5 mL骨髓，與含0.01mol/L FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM混勻后，移入25 cm2培養瓶中。置于37℃、5%CO2保溫箱中培養，3 d后半定量換液，去除非貼壁細胞，之后每2～3天全換液1次。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態、貼壁情況，待細胞融合達70%～80%后進行傳代。取第3代細胞進行實驗。
1.2.2 細胞轉染
第3代BMSCs用2.5 g/L胰蛋白酶消化后接種至6孔板，每孔5×105個細胞；分為病毒組及空病毒組。病毒組以最佳轉染復數加入慢病毒（每孔2 μL）轉染細胞，空病毒組以不含目的基因的空慢病毒轉染。轉染24 h后更換含血清培養液進行培養。
1.2.3 轉染后細胞觀測
①細胞生長觀察：倒置相差顯微鏡下觀察兩組細胞每天生長狀態；培養8 d內，每天利用細胞計數板進行細胞計數，并繪制生長曲線。以正常細胞作為對照。②RT-PCR檢測：于轉染培養1周后，取病毒組、空病毒組細胞及正常BMSCs（正常對照組），參照RT-PCR試劑盒說明書，檢測COX-2、Aggrecanase-1及IGF-1 mRNA的表達。以GAPDH作為內參，以目的基因與GAPDH表達量的比值，作為目的基因相對表達量。實驗重復3次。
1.3 實驗分組及方法
9只食蟹猴肌肉注射安定（1 mg/kg）與氯胺酮（1 mg/kg）麻醉后，按照Hulth造模法[7]制備OA模型。于右膝髕骨正中作一縱切口，逐層切開暴露膝關節，切斷前、后交叉韌帶與內側半月板，關閉切口。術后3 d內肌肉注射克林霉素（15～25 mg/kg），預防感染。術后實驗動物不限制活動。
將OA模型隨機分為3組，每組3只，分別為病毒組、空病毒組、空白對照組。模型制備術后6周，病毒組及空病毒組動物右膝關節腔內分別注射1.2.2獲得的對應1 mL BMSCs（約1×107個），空白對照組注射1 mL生理鹽水。實驗動物左膝作為正常對照組。
1.4 觀測指標
1.4.1 一般情況
術后觀察各組動物存活以及切口愈合、飲食等情況。
1.4.2 ELISA檢測
注射后1、4、6周，抽取各組動物雙膝關節液0.5 mL，參照ELISA試劑盒說明書檢測PGE2、IL-1、Aggrecanase-1、IGF-1濃度。
1.4.3 MRI檢查
注射后6周，各組動物同上法麻醉，進行雙膝關節MRI掃描，觀察膝關節軟骨有無異常信號。
1.4.4 大體觀察
MRI檢查后，放血處死各組動物，按照原手術切口入路，觀察關節軟骨缺損及增生情況，并與正常膝關節軟骨進行比較。
1.4.5 組織學及免疫組織化學染色觀察
大體觀察后，取各組缺損區周圍膝關節軟骨以及健側膝關節軟骨，石蠟固定后切片，片厚5 μm。取部分切片行HE染色，鏡下觀察軟骨細胞大小及排列情況。于200倍鏡下，取3個視野，參照改良Pineda評分標準[8]對關節軟骨缺損修復區進行組織學評價，包括以下方面：①細胞形態：透明軟骨0分，以透明軟骨為主1分，以纖維軟骨為主2分，以非軟骨為主3分，全部非軟骨4分。②基質染色：正常染色0分，輕度減弱1分，明顯減弱2分，未著色3分。③表面平整：平整范圍 > 3/4，0分；1/2～3/4，1分；1/4～1/2，2分；未達 < 1/4，3分。④軟骨厚度：達正常厚度的2/3，0分；1/3～2/3，1分；未達1/3，2分。⑤與宿主結合：兩邊結合0分，一邊結合1分，不結合2分。
其余切片行Ⅱ型膠原免疫組織化學染色，鏡下觀察軟骨基質染色情況及分布。
1.4.6 RT-PCR檢測
取各組缺損區周圍膝關節軟骨以及健側膝關節軟骨，同1.2.3方法檢測組織COX-2、Aggrecanase-1及IGF-1 mRNA表達。
1.5 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析，數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 慢病毒轉染后細胞觀察
2.1.1細胞生長觀察倒置相差顯微鏡下觀察，兩組細胞轉染后形態無明顯差異，均呈梭形（圖 1）。通過細胞計數，發現轉染細胞經1～2 d潛伏期后即進入對數生長期，6～8 d達平臺期，各組細胞生長曲線基本平行，提示慢病毒轉染對細胞生長無明顯不良影響（圖 2）。
圖1
病毒轉染后72 h兩組細胞形態觀察（倒置相差顯微鏡×100）???病毒組???空病毒組??圖 2 ??病毒轉染后各組細胞生長曲線
Figure1.
Cell morphology at 72 hours after transfection (Inverted phase contrast microscope×100) ??? Virus group ???Blank-virus group ??Fig.2 ??The growth curve of BMSCs after transfection
2.1.2 RT-PCR檢測
與空病毒組、正常對照組比較，病毒組COX-2、Aggrecanase-1 mRNA表達明顯降低，IGF-1 mRNA表達明顯增加，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。空病毒組與正常對照組比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。見表 1。
表1
RT-PCR檢測各組細胞COX-2、Aggrecanase-1及IGF-1 mRNA相對表達量（n=3, x±s）
Table1.
Relative expressions of COX-2, Aggrecanase-1, and IGF-1 mRNA in each group by RT-PCR(n=3, x±s)
2.2 動物實驗觀察
2.2.1 一般情況
各組動物均存活至實驗完成，切口愈合、飲食情況良好。
2.2.2 ELISA檢測
注射后1、4、6周，病毒組PGE2、Aggrecanase-1、IL-1濃度明顯低于空病毒組、空白對照組，但IGF-1濃度明顯增高，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。空病毒組與空白對照組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。病毒組、空病毒組、空白對照組以上指標均顯著高于正常對照組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見表 2。
表2
ELISA檢測各組膝關節液中PGE2、IL-1、Aggrecanase-1、IGF-1濃度（ng/L，x±s）
Table2.
Concentrations of PGE2, IL-1, Aggrecanase-1, and IGF-1 in each group by ELISAng/L, x±s)
2.2.3 MRI檢查
正常對照組關節面未見明顯異常。病毒組、空病毒組及空白對照組關節面均出現異常高密度影，其中病毒組區域最小，空病毒組可見較大異常信號區，空白對照組高密度影區面積最大。見圖 3。
圖3
注射后6周各組MRI檢查???病毒組???空病毒組???空白對照組???正常對照組??圖 4 ??注射后6周各組關節軟骨大體觀察???病毒組???空病毒組???空白對照組???正常對照組?? 圖 5 ??注射后6周各組關節軟骨組織學觀察（HE×200）???病毒組???空病毒組???空白對照組???正常對照組??圖 6 ??注射后6周各組關節軟骨Ⅱ型膠原免疫組織化學染色觀察（×200）???病毒組???空病毒組???空白對照組???正常對照組
Figure3.
MRI examination at 6 weeks after injection ??? Virus group???Blank-virus group??? Blank control group ??? Normal control group ??Fig.4 ??General observation of cartilage at 6 weeks after injection ??? Virus group ??? Blank-virus group ??? Blank control group ??? Normal control group ??Fig.5?? Histological observation of cartilage at 6 weeks after injection (HE×200) ??? Virus group???Blank-virus group ??? Blank control group ??? Normal control group ??Fig.6 ??Immunohistochemical observation of collagen type Ⅱ of cartilage at 6 weeks after injection (×200) ??? Virus group ??? Blank-virus group ??? Blank control group ??? Normal control group
2.2.4 大體觀察
正常對照組膝關節面光滑，無明顯缺損。病毒組、空病毒組及空白對照組膝關節內、外髁軟骨均出現磨損，周圍骨質增生，呈早期OA表現；其中病毒組軟骨修復情況優于空病毒組及空白對照組，僅內髁可見一軟骨缺損區，外髁基本正常；空病毒組內髁軟骨缺損較大，外髁無明顯缺損增生；空白對照組內髁可見較大面積軟骨缺損，外髁可見骨質增生。見圖 4。
2.2.5 組織學觀察
鏡下見，正常對照組軟骨細胞分布均勻，排列整齊，層次清楚，無簇集軟骨細胞，潮線完整。空白對照組和空病毒組軟骨細胞排列紊亂，出現細胞分離和簇集現象；病毒組軟骨細胞增生明顯，與空病毒組及空白對照組相比密度較大，細胞核大，染色深。病毒組、空病毒組及空白對照組參照Mankin關節軟骨病理評分標準[9]均符合早期OA表現。見圖 5。
參照改良Pineda評分標準，正常對照組、病毒組、空病毒組及空白對照組評分分別為0、（3.256±0.658）、（7.435±0.875）、（12.754±0.986）分，組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。
2.2.6 免疫組織化學染色
正常對照組細胞質呈棕黃色染色，較均勻，細胞核呈藍色；病毒組細胞質染色較空病毒組及空白對照組深，偶爾可見棕黃色顆粒，軟骨細胞較多；空病毒組及空白對照組染色淺，軟骨細胞較少。見圖 6。
2.2.7 RT-PCR檢測
與空病毒組和空白對照組相比，病毒組COX-2、Aggrecanase-1 mRNA表達明顯降低，IGF-1 mRNA表達明顯增高，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；空病毒組與空白對照組間比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。病毒組、空病毒組、空白對照組以上指標均顯著高于正常對照組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見表 3。
表3
RT-PCR檢測各組軟骨組織COX-2、Aggrecanase-1及IGF-1 mRNA相對表達量（x±s）
Table3.
Relative expressions of COX-2, Aggrecanase-1, and IGF-1 mRNA in each group by RT-PCR(x±s)
3 討論
BMSCs作為組織工程與轉基因技術種子細胞，具有多向分化能力，能在體外誘導分化為不同細胞，如成骨、軟骨、脂肪、肌樣細胞等[10-11]，通過組織工程技術能修復關節炎軟骨損傷，在兔OA模型中干細胞分化成骨也取得成功[12]。在OA的發生發展過程中，COX-2、Aggrecanase-1、IGF-1是關鍵基因，目前研究較多。COX-2表達增多使PGE2的合成上升，會促進炎癥發展，進一步導致關節損害[13]。Ag gre ca nase-1活性增強后會導致更多的蛋白多糖被降解，軟骨進一步缺損，加重關節的器質性損害及功能障礙[13-14]。IGF-1是調節軟骨細胞基質合成最重要的細胞因子，可以有效促進軟骨基質合成，抑制軟骨基質降解，從而維持關節軟骨的正常功能[15-16]。
在基因治療領域中，單基因或者雙基因研究相對較多，但多基因研究較少，本實驗同時轉入3個基因，以期抑制破壞性基因的表達，增強有益性基因的表達，減少有害炎性因子的產生，增加有益細胞因子的表達，共同保護關節軟骨，充分發揮基因治療的優勢。通過構建攜帶COX-2-siRNA、Aggrecanase-1-siRNA和IGF-1過表達基因的慢病毒載體，然后轉染BMSCs，成功地在細胞水平抑制了COX-2和Aggre canase-1基因表達，增強了IGF-1基因的表達；把基因轉染后的干細胞注入食蟹猴OA模型膝關節腔后，測得關節軟骨的基因表達發生了與細胞水平一致的變化，其關節液中炎性因子PGE2、IL-1含量顯著降低，Aggrecanase-1含量也進一步下降，而IGF-1含量升高，與Yuan等[17]的體外研究結果相符，并且該作用可持續6周。組織學觀察顯示，該方法能較好地保護軟骨基質，促進軟骨基質和軟骨細胞的生成，提示基因治療早期OA的有效性。
基因治療往往針對OA發病過程中的某一個環節，但病情發展是動態的，涉及的關節也多樣，不同的病損區域處于不同的病理階段，所以合理的基因治療要以OA病理機制為前提，對病情進展中的多個環節進行多點干預，阻斷或者延緩病情的發展[18-20]。本實驗研究對象為靈長類動物食蟹猴，膝關節受力特點與人類相近，因此提高了實驗結論的參考價值。但由于實驗動物昂貴，本實驗樣本量相對較少，且觀察時間相對較短，同時實驗動物基本為早期OA表現，有關基因治療中晚期OA的可行性及療效有待進一步觀察。