引用本文： 雷蕾, 鄧伊玲, 陳俊杰, 岑瑛. 過氧化物酶體增殖物激活受體γ在瘢痕疙瘩組?織?中的表達及意義. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(9): 1143-1145. doi: 10.7507/1002-1892.20160233 復制
瘢痕疙瘩是皮膚損傷愈合過程中，膠原合成代謝機能失去正常約束控制，持續處于亢進狀態，導致膠原纖維過度增生的結果。其主要表現為隆出正常皮膚、形狀不一、色紅質硬的良性腫塊。與增生性瘢痕不同的是，瘢痕疙瘩常超過原始損傷界限，治療后復發率較高。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPAR-γ）是一種由配體激活的核轉錄因子，其在多種器官的細胞中表達[1]，是核受體超家族成員之一[2]。目前，有關PPAR-γ與瘢痕疙瘩關系的研究報道較少。本實驗旨在通過觀察PPAR-γ在瘢痕疙瘩和正常皮膚組織中的表達差異，探討其與瘢痕疙瘩形成之間的關系。
1 材料與方法
1.1 實驗標本
實驗標本由2012年12月-2014年8月四川大學華西醫院燒傷整形科收治的23例瘢痕疙瘩患者自愿捐贈。男11例，女12例；年齡22～61歲，中位年齡48歲。瘢痕疙瘩形成時間2～30年，平均13.8年。瘢痕疙瘩部位：肩部5例，胸部13例，腹部2例，臍部1例，會陰2例。患者均未進行抗瘢痕性藥物治療，無傳染、免疫、遺傳和皮膚等疾病。所有瘢痕疙瘩標本均經四川大學華西醫院病理科確診。同時以取皮修剪后的剩余正常皮片作為正常對照。取材部位均無感染和潰瘍。標本采集后均經10%甲醛固定，常規石蠟包埋待用。
1.2 主要試劑
兔抗人PPAR-γ多克隆抗體（Abcam公司，英國）；SP試劑盒、DAB試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。
1.3 免疫組織化學檢測PPAR-γ的表達
取標本石蠟塊，切片，片厚4 μm，參照SP試劑盒說明書進行免疫組織化學染色，PPAR-γ抗體稀釋度為1:100，DAB顯色，待顯色后自來水沖洗3 min，蘇木素復染，中性樹膠封片。參照Shimizu免疫組織化學評分標準[3]進行半定量分析：在高倍鏡（×400）下，無著色為0分，染色面積 < 1/3 1分，1/3～2/3為2分， > 2/3為3分；染色強度：淺著色（黃色或淡棕色）為1分，中度著色（棕黃色或褐色）為2分，深度著色（棕褐色）為3分；兩者相加得分為綜合評分。由3名研究員分別閱片評分，取均值作為最終評分。總分0～2分判為PPAR-γ染色陰性，3～6分判為陽性，并計算標本陽性率，公式為：陽性標本數/總標本數×100%。于高倍鏡（×400）下隨機選取5個視野，觀察視野里所有細胞，以細胞質或細胞核出現棕黃色顆粒者記為陽性細胞，記錄陽性細胞數，并計算陽性細胞率，公式為：陽性細胞數/總細胞數×100%。
1.4 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
鏡下見，PPAR-γ蛋白主要位于細胞質內，呈棕黃色顆粒，在瘢痕疙瘩和正常皮膚中均有表達。在瘢痕疙瘩中，其位于表皮的棘細胞層、顆粒層以及真皮血管，染色較淺；在正常皮膚中，位于表皮的基底層以及真皮血管壁、汗腺、皮脂腺，染色較深。見圖 1。
圖1
兩組標本PPAR-γ免疫組織化學染色觀察（×100）
ⓐ 瘢痕疙瘩組 ⓑ 正常對照組
Figure1. Immunohistochemistry staining of PPAR-γ in 2 groups (×100)ⓐ Keloid group ⓑ Control group
瘢痕疙瘩組免疫組織化學染色評分為（2.65±0.78）分，低于正常對照組的（3.65±1.19）分，比較差異有統計學意義（t=5.030，P=0.000）；標本陽性率為52.17%（12/23），顯著低于正常對照組的82.61%（19/23），差異有統計學意義（χ2=4.847，P=0.028）；陽性細胞率為46.04%±8.61%，顯著低于正常對照組的59.39%±11.26%，差異有統計學意義（t=5.974，P=0.000）。
3 討論
目前，學者們對于PPAR-γ抗纖維化作用機制進行了大量研究。研究發現，PPAR-γ參與了多種組織器官纖維化的病理生理過程，通過拮抗TGF-β1的促纖維化、調控TGF/Smad通路等效應發揮抗纖維化作用[4-6]。PPAR-γ配體通過與Smad3競爭性結合P300，抑制TGF-β1誘導的肺成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，發揮抗肺纖維化作用[7]。PPAR-γ活化可以抑制細胞外基質mRNA表達，使細胞外基質合成減少，從而發揮抗肝纖維化作用[8]。纖維化細胞因子α-平滑肌肌動蛋白、Ⅰ型膠原蛋白和羥脯氨酸水平可被肝星狀細胞中過量表達的PPAR-γ降低，達到抑制肝纖維化的目的[9]。肝纖維化程度越嚴重，PPAR-γ mRNA表達越少，而α-平滑肌肌動蛋白表達越高，從而表明PPAR-γ表達的下降，可能使α-平滑肌肌動蛋白的數量增加，加速肝纖維化的形成，提示提高PPAR-γ表達可能改善肝纖維化程度[10]。NO在纖維化的發生過程中起重要作用，采用PPAR-γ激動劑干預人肝星狀細胞，能降低誘導性一氧化氮合酶的表達及活性，從而降低NO的合成，減少肝星狀細胞活化和增殖引起的炎性介質釋放，最終達到抗肝纖維化的作用[11]。PPAR-γ的合成激動劑羅格列酮能通過減少肝星狀細胞的增殖和增加其凋亡來抑制肝纖維化的發生、發展[12-13]。羅格列酮還能治療大鼠以纖維化為特征的腎損傷[14]。血管緊張素1～7能使糖尿病大鼠TGF-β、α-平滑肌肌動蛋白mRNA及蛋白水平上調、PPAR-γ mRNA及蛋白水平表達下調，從而顯著抑制腎小管纖維化，間接表明PPAR-γ表達上調可能有抑制腎小管纖維化的作用[15]。PPAR-γ激動劑吡格列酮能通過刺激5-AMP激活性蛋白激酶和抑制炎性反應及氧化應激，修復足細胞損傷，改善腎組織纖維化[16]。增殖性玻璃體視網膜病變以纖維性細胞膜性組織在玻璃體和視網膜周圍廣泛增生為特征，是眼科常見致盲疾病之一。色素上皮細胞向間質細胞轉變是該病發病機制，其中TGF-β在此轉變過程中起重要作用，而研究證明PPAR-γ激動劑能降低TGF-β的表達，提示PPAR-γ能改善以纖維化為特征的增殖性玻璃體視網膜病變[17]。PPAR-γ通路激活可抑制糖尿病心肌纖維化的發生、發展，在病程早期即可改善心臟功能[18]。PPAR-γ配體15-脫氧前列腺素J2及其激動劑曲格列酮和齊格列酮均能減少TGF-β1誘導的合成，表明PPAR-γ通過抑制TGF-β1誘導的瘢痕成纖維細胞細胞外基質的合成，發揮抗瘢痕成纖維細胞纖維化的作用[19]。
有研究證實，PPAR-γ在增生性瘢痕成纖維細胞中表達下降，提示其表達的下降可能參與了增生性瘢痕的形成過程[20]。而瘢痕疙瘩與增生性瘢痕均是機體對皮膚創傷后的過度反應，發病機制、臨床表現及治療方法均類似，提示PPAR-γ在瘢痕疙瘩中可能存在相似的表達情況。但瘢痕疙瘩與增生性瘢痕也存在諸多不同，如瘢痕疙瘩常超出原始創傷的邊界生長，各種治療方法均有較高復發率，其組織成分也與增生性瘢痕不同。因此，研究PPAR-γ在瘢痕疙瘩組織中的表達及作用有重要意義。
本實驗免疫組織化學染色結果表明，PPAR-γ在瘢痕疙瘩中的表達較正常皮膚低，提示PPAR-γ可能在瘢痕疙瘩形成中發揮重要的調節作用，其作用可能是通過抑制TGF-β1誘導的成纖維細胞轉分化效應、降低細胞外基質合成等機制實現的，PPAR-γ激動劑有望用于治療瘢痕疙瘩，但有待進一步研究明確。
瘢痕疙瘩是皮膚損傷愈合過程中，膠原合成代謝機能失去正常約束控制，持續處于亢進狀態，導致膠原纖維過度增生的結果。其主要表現為隆出正常皮膚、形狀不一、色紅質硬的良性腫塊。與增生性瘢痕不同的是，瘢痕疙瘩常超過原始損傷界限，治療后復發率較高。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPAR-γ）是一種由配體激活的核轉錄因子，其在多種器官的細胞中表達[1]，是核受體超家族成員之一[2]。目前，有關PPAR-γ與瘢痕疙瘩關系的研究報道較少。本實驗旨在通過觀察PPAR-γ在瘢痕疙瘩和正常皮膚組織中的表達差異，探討其與瘢痕疙瘩形成之間的關系。
1 材料與方法
1.1 實驗標本
實驗標本由2012年12月-2014年8月四川大學華西醫院燒傷整形科收治的23例瘢痕疙瘩患者自愿捐贈。男11例，女12例；年齡22～61歲，中位年齡48歲。瘢痕疙瘩形成時間2～30年，平均13.8年。瘢痕疙瘩部位：肩部5例，胸部13例，腹部2例，臍部1例，會陰2例。患者均未進行抗瘢痕性藥物治療，無傳染、免疫、遺傳和皮膚等疾病。所有瘢痕疙瘩標本均經四川大學華西醫院病理科確診。同時以取皮修剪后的剩余正常皮片作為正常對照。取材部位均無感染和潰瘍。標本采集后均經10%甲醛固定，常規石蠟包埋待用。
1.2 主要試劑
兔抗人PPAR-γ多克隆抗體（Abcam公司，英國）；SP試劑盒、DAB試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。
1.3 免疫組織化學檢測PPAR-γ的表達
取標本石蠟塊，切片，片厚4 μm，參照SP試劑盒說明書進行免疫組織化學染色，PPAR-γ抗體稀釋度為1:100，DAB顯色，待顯色后自來水沖洗3 min，蘇木素復染，中性樹膠封片。參照Shimizu免疫組織化學評分標準[3]進行半定量分析：在高倍鏡（×400）下，無著色為0分，染色面積 < 1/3 1分，1/3～2/3為2分， > 2/3為3分；染色強度：淺著色（黃色或淡棕色）為1分，中度著色（棕黃色或褐色）為2分，深度著色（棕褐色）為3分；兩者相加得分為綜合評分。由3名研究員分別閱片評分，取均值作為最終評分。總分0～2分判為PPAR-γ染色陰性，3～6分判為陽性，并計算標本陽性率，公式為：陽性標本數/總標本數×100%。于高倍鏡（×400）下隨機選取5個視野，觀察視野里所有細胞，以細胞質或細胞核出現棕黃色顆粒者記為陽性細胞，記錄陽性細胞數，并計算陽性細胞率，公式為：陽性細胞數/總細胞數×100%。
1.4 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
鏡下見，PPAR-γ蛋白主要位于細胞質內，呈棕黃色顆粒，在瘢痕疙瘩和正常皮膚中均有表達。在瘢痕疙瘩中，其位于表皮的棘細胞層、顆粒層以及真皮血管，染色較淺；在正常皮膚中，位于表皮的基底層以及真皮血管壁、汗腺、皮脂腺，染色較深。見圖 1。
圖1
兩組標本PPAR-γ免疫組織化學染色觀察（×100）
ⓐ 瘢痕疙瘩組 ⓑ 正常對照組
Figure1. Immunohistochemistry staining of PPAR-γ in 2 groups (×100)ⓐ Keloid group ⓑ Control group
瘢痕疙瘩組免疫組織化學染色評分為（2.65±0.78）分，低于正常對照組的（3.65±1.19）分，比較差異有統計學意義（t=5.030，P=0.000）；標本陽性率為52.17%（12/23），顯著低于正常對照組的82.61%（19/23），差異有統計學意義（χ2=4.847，P=0.028）；陽性細胞率為46.04%±8.61%，顯著低于正常對照組的59.39%±11.26%，差異有統計學意義（t=5.974，P=0.000）。
3 討論
目前，學者們對于PPAR-γ抗纖維化作用機制進行了大量研究。研究發現，PPAR-γ參與了多種組織器官纖維化的病理生理過程，通過拮抗TGF-β1的促纖維化、調控TGF/Smad通路等效應發揮抗纖維化作用[4-6]。PPAR-γ配體通過與Smad3競爭性結合P300，抑制TGF-β1誘導的肺成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，發揮抗肺纖維化作用[7]。PPAR-γ活化可以抑制細胞外基質mRNA表達，使細胞外基質合成減少，從而發揮抗肝纖維化作用[8]。纖維化細胞因子α-平滑肌肌動蛋白、Ⅰ型膠原蛋白和羥脯氨酸水平可被肝星狀細胞中過量表達的PPAR-γ降低，達到抑制肝纖維化的目的[9]。肝纖維化程度越嚴重，PPAR-γ mRNA表達越少，而α-平滑肌肌動蛋白表達越高，從而表明PPAR-γ表達的下降，可能使α-平滑肌肌動蛋白的數量增加，加速肝纖維化的形成，提示提高PPAR-γ表達可能改善肝纖維化程度[10]。NO在纖維化的發生過程中起重要作用，采用PPAR-γ激動劑干預人肝星狀細胞，能降低誘導性一氧化氮合酶的表達及活性，從而降低NO的合成，減少肝星狀細胞活化和增殖引起的炎性介質釋放，最終達到抗肝纖維化的作用[11]。PPAR-γ的合成激動劑羅格列酮能通過減少肝星狀細胞的增殖和增加其凋亡來抑制肝纖維化的發生、發展[12-13]。羅格列酮還能治療大鼠以纖維化為特征的腎損傷[14]。血管緊張素1～7能使糖尿病大鼠TGF-β、α-平滑肌肌動蛋白mRNA及蛋白水平上調、PPAR-γ mRNA及蛋白水平表達下調，從而顯著抑制腎小管纖維化，間接表明PPAR-γ表達上調可能有抑制腎小管纖維化的作用[15]。PPAR-γ激動劑吡格列酮能通過刺激5-AMP激活性蛋白激酶和抑制炎性反應及氧化應激，修復足細胞損傷，改善腎組織纖維化[16]。增殖性玻璃體視網膜病變以纖維性細胞膜性組織在玻璃體和視網膜周圍廣泛增生為特征，是眼科常見致盲疾病之一。色素上皮細胞向間質細胞轉變是該病發病機制，其中TGF-β在此轉變過程中起重要作用，而研究證明PPAR-γ激動劑能降低TGF-β的表達，提示PPAR-γ能改善以纖維化為特征的增殖性玻璃體視網膜病變[17]。PPAR-γ通路激活可抑制糖尿病心肌纖維化的發生、發展，在病程早期即可改善心臟功能[18]。PPAR-γ配體15-脫氧前列腺素J2及其激動劑曲格列酮和齊格列酮均能減少TGF-β1誘導的合成，表明PPAR-γ通過抑制TGF-β1誘導的瘢痕成纖維細胞細胞外基質的合成，發揮抗瘢痕成纖維細胞纖維化的作用[19]。
有研究證實，PPAR-γ在增生性瘢痕成纖維細胞中表達下降，提示其表達的下降可能參與了增生性瘢痕的形成過程[20]。而瘢痕疙瘩與增生性瘢痕均是機體對皮膚創傷后的過度反應，發病機制、臨床表現及治療方法均類似，提示PPAR-γ在瘢痕疙瘩中可能存在相似的表達情況。但瘢痕疙瘩與增生性瘢痕也存在諸多不同，如瘢痕疙瘩常超出原始創傷的邊界生長，各種治療方法均有較高復發率，其組織成分也與增生性瘢痕不同。因此，研究PPAR-γ在瘢痕疙瘩組織中的表達及作用有重要意義。
本實驗免疫組織化學染色結果表明，PPAR-γ在瘢痕疙瘩中的表達較正常皮膚低，提示PPAR-γ可能在瘢痕疙瘩形成中發揮重要的調節作用，其作用可能是通過抑制TGF-β1誘導的成纖維細胞轉分化效應、降低細胞外基質合成等機制實現的，PPAR-γ激動劑有望用于治療瘢痕疙瘩，但有待進一步研究明確。