引用本文： 喻都, 肖海軍, 薛鋒, 潘明芒, 鞠金勇, 唐果. 低氧誘導因子1α在大鼠跟腱創傷后異位骨化模型中的表達及意義. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(9): 1098-1103. doi: 10.7507/1002-1892.20160224 復制
異位骨化是指軟組織中出現成熟骨組織的病理現象，根據其成因分為遺傳性和獲得性異位骨化；前者以進行性肌肉骨化癥多見，后者包括嚴重創傷、燒傷及神經系統損傷等，其中以創傷后異位骨化多見[1]。目前，異位骨化的發病率逐年增高，其并發癥有慢性疼痛、關節活動受限等，有效治療方法是手術切除異位骨化的骨組織，但會給患者造成二次損傷。為進一步降低異位骨化發生率，其發病機制及早期預防的研究具有重要意義[2]。有研究表明，異位骨化是通過軟骨內骨化途徑形成，其中血管形成及骨形成過程必不可少[3-4]。低氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor lα，HIF-lα）是一種主要在低氧條件下表達的轉錄因子，能調控多種基因的表達，如促紅細胞生成素、VEGF及葡萄糖轉運因子1等，廣泛參與哺乳動物的生長及發育[5]。近年來，有研究表明HIF-lα在促進血管再生、調控MSCs向軟骨細胞分化等方面起重要作用[6-8]。本研究通過檢測HIF-lα在大鼠跟腱創傷后異位骨化模型中早期表達情況，探討局部低氧微環境及HIF-lα在創傷后異位骨化發病機制中的作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
8～10周齡雄性SD大鼠140只，體質量（210.1±10.6）?g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供；SPF級環境飼養（華東師范大學生命醫學研究所實驗動物中心）。
Trizol（Invitrogen公司，美國）；氯仿、異丙醇（國藥集團化學試劑有限公司）；Total RNA逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒（Biotool公司，美國）；組織蛋白裂解液（上海酶聯生物研究所）；HIF-lα抗體（Abcam公司，英國）。NanoDrop2000分光光度計（Thermo公司，美國）；Bx60/PM30顯微鏡（Olympus公司，日本）；X線機（Kodak公司，美國）。
1.2 動物模型制備及分組
140只大鼠適應性飼養1周后，按隨機數字表法分為實驗組和對照組，每組70只。兩組大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.2～0.3 mL/100 g）麻醉后，實驗組于大鼠右后肢后外側入路暴露跟腱，用血管鉗在跟腱中點處鉗夾10次，造成一定程度創傷，然后在中點處將跟腱完全切斷，關閉切口。對照組僅同實驗組方法暴露跟腱，不作其他處理，直接關閉切口。
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
術后觀察兩組大鼠成活、切口愈合及右后肢活動情況。術后2、3、4、5、6、7、8、10、12、14 d，兩組各取6只大鼠，同上法麻醉后斷頸處死，按照原切口入路，觀察跟腱形態。
1.3.2 組織學及免疫組織化學染色觀察
各時間點大體觀察后，切取兩組跟腱及周圍組織，取部分標本置于10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，3～4 μm厚連續切片。取部分切片常規HE染色，光鏡觀察兩組跟腱及周圍組織的組織學改變。
取部分切片脫蠟水化，3%H2O2室溫孵育10?min，10%山羊血清室溫孵育1 h，加入一抗兔抗大鼠單克隆HIF-lα抗體（1:200），4℃過夜，加入二抗山羊抗兔抗體（1:200）室溫孵育1 h，DAB顯色，蘇木精復染，依次脫水、封片、光鏡下觀察，細胞質呈淡黃色至棕褐色者為陽性細胞。
1.3.3 實時熒光定量PCR檢測HIF-lα基因表達
取各時間點兩組跟腱及周圍組織標本，按照Trizol說明書方法提取組織總RNA，NanoDrop2000分光光度計檢測總RNA純度及含量。按照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄，合成cDNA置于-20℃保存。依據實時熒光定量PCR試劑盒說明書進行反應，反應總體系20 μL，反應條件：95℃、5 min，95℃、15 s，60℃、60 s，40個循環。以GAPDH作為內參。基因擴增引物序列如下：HIF-1α，上游5'-GCTCCATTCCATCCTGTTCA-3'，下游5'-CTCCCTTTTTCAAGCAGCAG-3'。GAPDH，上游5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，下游5'-TGTAGA-CCATGTAGTTGAGGTCA-3'。采用2-ΔΔCt方法計算HIF-lα基因相對表達量。
1.3.4 Western blot檢測HIF-lα蛋白含量
取術后3、5、8、14 d兩組跟腱及周圍組織各20 mg（置于冰上），加入200 μL蛋白裂解液，4 ℃，以離心半徑6?cm，12 000 r/min，離心30 min，提取組織總蛋白。BCA法測定總蛋白濃度，蛋白變性后取20 μg等量樣本行SDS-PAGE電泳，轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入抗HIF-lα抗體，內參抗體為GAPDH，4℃孵育過夜，1×PBS洗膜10 min×3次，加入二抗，室溫孵育1 h，1×PBS洗膜10min×3次，加入ECL化學發光液，曝光后將膠片顯影。釆用Image J軟件測量目的條帶的吸光度（A）值，以GAPDH條帶為內參進行蛋白上樣量校正，重復測量3次，取其均值；以目的條帶與GAPDH條帶A值的比值作為HIF-1α蛋白相對表達量。
1.3.5 異位骨化形成觀察
術后10周取兩組剩余10只大鼠，同上法麻醉后行異位骨化形成觀察。①攝右后肢側位X線片，觀察跟腱部位有無新骨形成；②按照原切口入路，大體觀察跟腱形態；③切取跟腱及周圍組織，同上法切片行HE染色，光鏡下觀察兩組跟腱及周圍組織的組織學改變情況。
1.4 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；組內不同時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；若經Levene檢驗方差不齊，則采用近似F檢驗Welch法，兩兩比較采用Tamhane’s T2法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
術后3 d實驗組1只大鼠死亡（原因不明），其余大鼠均存活至實驗完成，切口無感染，愈合良好。實驗組大鼠術后右后肢活動減少，約1周后恢復正常；對照組大鼠右后肢活動均正常。
對照組各時間點大鼠跟腱無明顯變化，呈白色，寬3～4 mm，厚1.0～1.5 mm。實驗組術后2～5?d大鼠跟腱斷端萎縮，呈白色，周圍組織有壞死；6、7 d時跟腱斷端呈白色，可觸及硬結，跟腱斷端間有淡黃色纖維結締組織相連；8～14 d跟腱斷端硬結變大，質地稍軟。見圖 1。
圖1
術后兩組跟腱組織大體觀察 ? 對照組5 d ? 實驗組3?d ? 實驗組5 d ? 實驗組8 d ? 實驗組14 d??圖 2??術后兩組跟腱組織組織學觀察（HE×200）? 對照組5 d ? 實驗組3 d ? 實驗組5 d ? 實驗組8 d ? 實驗組14 d??圖 3??術后兩組跟腱組織免疫組織化學染色觀察（×400) ? 對照組5?d ? 實驗組3 d ? 實驗組5 d ? 實驗組8 d ? 實驗組14?d??圖 4??術后各時間點兩組跟腱組織HIF-lα基因相對表達量
Figure1.
Gross observation of Achilles tendon tissue in 2 groups after operation ? Control group at 5 days ? Experimental group at 3?days ? Experimental group at 5 days ? Experimental group at 8 days ? Experimental group at 14 days??Fig. 2??Histological observation of Achilles tendon tissue in 2 groups after operation (HE×200) ? Control group at 5 days ? Experimental group at 3 days ? Experimental group at 5 days ? Experimental group at 8 days ? Experimental group at 14 days??Fig. 3??Immunohistochemical staining observation of Achilles tendon tissue in 2 groups after operation (×400) ? Control group at 5 days ? Experimental group at 3 days ? Experimental group at 5 days ? Experimental group at 8 days ? Experimental group at 14 days??Fig. 4??The expression of HIF-lα mRNA in 2 groups at different time points after operation
2.2 組織學及免疫組織化學染色觀察
2.2.1 HE染色
對照組各時間點跟腱組織為規則結締組織。實驗組術后2～7 d可見大量炎性細胞浸潤，伴大量成纖維細胞增生；8～14 d仍可見大量炎性細胞，大量膠原纖維轉化為纖維結締組織。見圖 2。
2.2.2 免疫組織化學染色
各時間點對照組少見或未見棕褐色顆粒，呈陰性染色。實驗組術后2 d可見少量棕褐色顆粒；3～14 d可見大量深褐色顆粒，染色較對照組明顯加深，呈強陽性。見圖 3。
2.3 實時熒光定量PCR檢測
與對照組相比，實驗組各時間點HIF-lα基因相對表達量均明顯升高，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。組內比較：與術后2 d相比，實驗組術后3～14 d HIF-lα基因相對表達量均升高并維持較高水平，術后5 d時達峰值，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）；4、6 d間比較，7、8 d與10 d間比較以及12、14 d間比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）；其余各時間點比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。對照組術后HIF-lα基因相對表達量逐漸升高，術后5?d時達峰值，之后逐漸下降并維持較低水平；8、10、12、14 d間比較，差異無統計學意義（P > 0.05）；其余各時間點比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 4。
2.4 Western blot檢測
實驗組術后3、5、8、14 d HIF-lα蛋白相對表達量分別為2.03±0.32、1.96±0.35、1.47±0.04、1.68±0.07，均明顯高于對照組的1.17±0.09、1.13±0.14、0.99±0.13、1.20±0.02，比較差異有統計學意義（t=4.441，P=0.011；t=3.847，P=0.018；t=6.010，P=0.004；t=11.817，P=0.000）。見圖 5。
圖5
Western blot檢測術后兩組跟腱組織中HIF-lα蛋白含量1～4：實驗組術后3、5、8、14?d 5～8：對照組術后3、5、8、14?d??圖 6??術后10周兩組異位骨化形成觀察 ? 實驗組X線片 ? 對照組X線片 ? 實驗組大體觀察 ? 對照組大體觀察 ? A實驗組組織學觀察（HE×200） ? 對照組組織學觀察（HE×200）
Figure5.
The expression of HIF-lα protein in 2 groups after operation 1-4: Experimental group at 3, 5, 8, and 14 days after operation 5-8: Control group at 3, 5, 8, and 14 days after operation Fig. 6 The formation of heterotopic ossification in 2 groups at 10 weeks after operation ? X-ray film of experimental group ? X-ray film of control group ? Gross observation of experimental group ? Gross observation of control group ? Histological observation of experimental group (HE × 200) ? Histological observation of control group (HE × 200)
2.5 異位骨化形成情況
術后10周，X線片示對照組10只大鼠跟腱局部均無異位骨化發生；大體觀察跟腱呈白色，寬3～4 mm，厚1.0～1.5 mm；HE染色示跟腱組織為規則結締組織。X線片示實驗組9只大鼠跟腱局部均發生異位骨化；大體觀察跟腱斷端硬結較大，質地較硬；HE染色示可見成熟骨組織，骨小梁及板層骨樣結構等。見圖 6。
3 討論
異位骨化是一個多因素參與的復雜病理性骨發生過程，其具體發病機制仍不清楚，建立良好的實驗動物模型有助于對發病機制的深入研究。本研究團隊經過數年對實驗動物模型的研究改良，認為跟腱鉗夾、剪斷法能在較短時間內成功誘導異位骨化的發生[9-10]。該造模方法不僅簡易有效、重復性好，而且其組織學發生過程與臨床創傷所致的異位骨化過程較為相似，都是通過軟骨內骨化途徑形成，均可見成熟骨組織、骨小梁及板層骨樣結構等。本研究中，實驗組術后10周均成功制備大鼠跟腱創傷后異位骨化模型。
HIF-l是調節機體對缺氧反應的核轉錄因子，由HIF-lα和HIF-lβ兩種不同亞基組成，其活性主要由HIF-lα決定。在常氧環境下，細胞內HIF-lα可通過泛素化途徑降解；在低氧環境下，其泛素化途徑被抑制，HIF-lα在細胞內不斷累積并由細胞質轉入細胞核，與HIF-lβ亞基結合形成復合體后激活并啟動下游基因的轉錄和表達[11]。HIF-lα是一種低氧依賴性的轉錄因子，對機體細胞在低氧環境調控中起重要作用，能調控近100種基因的表達[5]。研究表明，HIF-lα在干細胞增殖、分化、誘導血管形成及骨形成等方面起重要作用[6-8]。目前，學者們一致認為異位骨化是通過軟骨內成骨途徑形成，且必須滿足以下3個條件：成骨的前體細胞、多種誘導因子及相關信號通路、適宜的微環境[12-13]。軟骨內成骨的重要特征之一就是有異位骨化前體細胞的存在，而血管生成和骨生成是異位骨化發生的重要環節，涉及眾多的誘導因子及信號通路。HIF-lα是參與和調控上述環節的重要因子。因此，本研究通過檢測HIF-lα在大鼠跟腱創傷后異位骨化模型中早期表達，探討HIF-lα及低氧微環境在創傷后異位骨化發病機制中的作用及意義。
本實驗中，大體觀察及組織學染色示：實驗組大鼠術后2～5 d跟腱斷端萎縮，周圍組織缺血壞死，提示創傷早期跟腱及周圍組織處于缺血、缺氧的微環境中；實時熒光定量PCR結果示：實驗組各時間點跟腱局部組織中HIF-lα基因相對表達量明顯高于對照組，且維持較高水平；對照組各時間點HIF-lα基因含量整體維持在較低水平，提示HIF-lα在創傷后異位骨化早期起作用。Western blot和免疫組織化學染色示：與對照組相比，實驗組各時間點跟腱局部組織中HIF-lα蛋白相對表達量均明顯升高，進一步提示HIF-lα在創傷后異位骨化早期起重要作用，且跟腱局部組織處于低氧微環境中。我們認為跟腱局部低氧微環境可能與以下因素有關：實驗組模型制備中，鉗夾、剪斷跟腱損害了其周圍的血管，是低氧微環境產生的基礎；關閉切口后，局部血腫的產生及組織灌注損傷加重了缺氧；跟腱組織細胞代謝耗氧進一步降低了局部氧含量。
有文獻報道在局部低氧微環境中，HIF-lα表達升高，能誘導、募集異位骨化前體細胞[6, 14]，同時能調控VEGF的表達。VEGF具有很強促血管生成的能力，能促進內皮細胞增殖與分化，誘導新生血管形成[15]。有研究指出HIF-lα可參與血管內皮細胞中2%以上基因的調控，其中包括血管生成素2、bFGF、胎盤生長因子等，這些因子與VEGF共同作用促進形成完整的新血管[16-17]。Dilling等[18]的研究發現，在異位骨化形成過程中，新生血管的形成出現在軟骨之前。所以，有學者指出，眾多血管刺激因子的高表達是異位骨化形成的必要條件[4, 19]。Lin等[4, 20]認為在低氧微環境中，HIF-lα的高表達能直接促進SOX-9的表達，誘導異位骨化前體細胞向軟骨細胞分化；通過BMP/SMAD信號通路調控Runx-2的表達，促進成骨細胞的分化，并認為VEGF能放大BMP/SMAD信號通路，最終導致異位骨化的發生。如果在創傷早期（48 h內）采用HIF-lα抑制劑干擾HIF-lα，VEGF、SOX-9、Runx-2的表達量均明顯下降，且異位骨化的發生率明顯降低。Agarwal等[14]研究認為，HIF-lα高表達可通過BMP/SMAD信號通路調控SOX-9的表達，SOX-9基因表達與HIF-lα具有同步變化關系。采用PX-478抑制HIF-lα后發現，異位骨化前體細胞減少，SOX-9的表達量下降，異位骨化骨體積明顯減小；而選擇性敲除HIF-lα基因后，無異位骨化前體細胞聚集，無軟骨形成。
綜上述，在局部低氧微環境中，HIF-lα高表達，參與或調控了異位骨化前體細胞的聚集、血管形成及骨形成等過程，表明局部低氧微環境及HIF-lα在創傷后異位骨化發病機制中起重要作用，其發病機制可能為：局部低氧微環境促使HIF-lα高表達，HIF-lα不僅能誘導、募集異位骨化前體細胞，促進多種血管生成因子的分泌，誘導新生血管形成，還能通過BMP/SMAD信號通路調控SOX-9、Runx-2的表達，最終誘導異位骨化發生。由于與HIF-lα相關的信號通路眾多，本研究未能全部檢測，因此該機制有待進一步研究探索。
異位骨化是指軟組織中出現成熟骨組織的病理現象，根據其成因分為遺傳性和獲得性異位骨化；前者以進行性肌肉骨化癥多見，后者包括嚴重創傷、燒傷及神經系統損傷等，其中以創傷后異位骨化多見[1]。目前，異位骨化的發病率逐年增高，其并發癥有慢性疼痛、關節活動受限等，有效治療方法是手術切除異位骨化的骨組織，但會給患者造成二次損傷。為進一步降低異位骨化發生率，其發病機制及早期預防的研究具有重要意義[2]。有研究表明，異位骨化是通過軟骨內骨化途徑形成，其中血管形成及骨形成過程必不可少[3-4]。低氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor lα，HIF-lα）是一種主要在低氧條件下表達的轉錄因子，能調控多種基因的表達，如促紅細胞生成素、VEGF及葡萄糖轉運因子1等，廣泛參與哺乳動物的生長及發育[5]。近年來，有研究表明HIF-lα在促進血管再生、調控MSCs向軟骨細胞分化等方面起重要作用[6-8]。本研究通過檢測HIF-lα在大鼠跟腱創傷后異位骨化模型中早期表達情況，探討局部低氧微環境及HIF-lα在創傷后異位骨化發病機制中的作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
8～10周齡雄性SD大鼠140只，體質量（210.1±10.6）?g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供；SPF級環境飼養（華東師范大學生命醫學研究所實驗動物中心）。
Trizol（Invitrogen公司，美國）；氯仿、異丙醇（國藥集團化學試劑有限公司）；Total RNA逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒（Biotool公司，美國）；組織蛋白裂解液（上海酶聯生物研究所）；HIF-lα抗體（Abcam公司，英國）。NanoDrop2000分光光度計（Thermo公司，美國）；Bx60/PM30顯微鏡（Olympus公司，日本）；X線機（Kodak公司，美國）。
1.2 動物模型制備及分組
140只大鼠適應性飼養1周后，按隨機數字表法分為實驗組和對照組，每組70只。兩組大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.2～0.3 mL/100 g）麻醉后，實驗組于大鼠右后肢后外側入路暴露跟腱，用血管鉗在跟腱中點處鉗夾10次，造成一定程度創傷，然后在中點處將跟腱完全切斷，關閉切口。對照組僅同實驗組方法暴露跟腱，不作其他處理，直接關閉切口。
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
術后觀察兩組大鼠成活、切口愈合及右后肢活動情況。術后2、3、4、5、6、7、8、10、12、14 d，兩組各取6只大鼠，同上法麻醉后斷頸處死，按照原切口入路，觀察跟腱形態。
1.3.2 組織學及免疫組織化學染色觀察
各時間點大體觀察后，切取兩組跟腱及周圍組織，取部分標本置于10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，3～4 μm厚連續切片。取部分切片常規HE染色，光鏡觀察兩組跟腱及周圍組織的組織學改變。
取部分切片脫蠟水化，3%H2O2室溫孵育10?min，10%山羊血清室溫孵育1 h，加入一抗兔抗大鼠單克隆HIF-lα抗體（1:200），4℃過夜，加入二抗山羊抗兔抗體（1:200）室溫孵育1 h，DAB顯色，蘇木精復染，依次脫水、封片、光鏡下觀察，細胞質呈淡黃色至棕褐色者為陽性細胞。
1.3.3 實時熒光定量PCR檢測HIF-lα基因表達
取各時間點兩組跟腱及周圍組織標本，按照Trizol說明書方法提取組織總RNA，NanoDrop2000分光光度計檢測總RNA純度及含量。按照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄，合成cDNA置于-20℃保存。依據實時熒光定量PCR試劑盒說明書進行反應，反應總體系20 μL，反應條件：95℃、5 min，95℃、15 s，60℃、60 s，40個循環。以GAPDH作為內參。基因擴增引物序列如下：HIF-1α，上游5'-GCTCCATTCCATCCTGTTCA-3'，下游5'-CTCCCTTTTTCAAGCAGCAG-3'。GAPDH，上游5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，下游5'-TGTAGA-CCATGTAGTTGAGGTCA-3'。采用2-ΔΔCt方法計算HIF-lα基因相對表達量。
1.3.4 Western blot檢測HIF-lα蛋白含量
取術后3、5、8、14 d兩組跟腱及周圍組織各20 mg（置于冰上），加入200 μL蛋白裂解液，4 ℃，以離心半徑6?cm，12 000 r/min，離心30 min，提取組織總蛋白。BCA法測定總蛋白濃度，蛋白變性后取20 μg等量樣本行SDS-PAGE電泳，轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入抗HIF-lα抗體，內參抗體為GAPDH，4℃孵育過夜，1×PBS洗膜10 min×3次，加入二抗，室溫孵育1 h，1×PBS洗膜10min×3次，加入ECL化學發光液，曝光后將膠片顯影。釆用Image J軟件測量目的條帶的吸光度（A）值，以GAPDH條帶為內參進行蛋白上樣量校正，重復測量3次，取其均值；以目的條帶與GAPDH條帶A值的比值作為HIF-1α蛋白相對表達量。
1.3.5 異位骨化形成觀察
術后10周取兩組剩余10只大鼠，同上法麻醉后行異位骨化形成觀察。①攝右后肢側位X線片，觀察跟腱部位有無新骨形成；②按照原切口入路，大體觀察跟腱形態；③切取跟腱及周圍組織，同上法切片行HE染色，光鏡下觀察兩組跟腱及周圍組織的組織學改變情況。
1.4 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；組內不同時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；若經Levene檢驗方差不齊，則采用近似F檢驗Welch法，兩兩比較采用Tamhane’s T2法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
術后3 d實驗組1只大鼠死亡（原因不明），其余大鼠均存活至實驗完成，切口無感染，愈合良好。實驗組大鼠術后右后肢活動減少，約1周后恢復正常；對照組大鼠右后肢活動均正常。
對照組各時間點大鼠跟腱無明顯變化，呈白色，寬3～4 mm，厚1.0～1.5 mm。實驗組術后2～5?d大鼠跟腱斷端萎縮，呈白色，周圍組織有壞死；6、7 d時跟腱斷端呈白色，可觸及硬結，跟腱斷端間有淡黃色纖維結締組織相連；8～14 d跟腱斷端硬結變大，質地稍軟。見圖 1。
圖1
術后兩組跟腱組織大體觀察 ? 對照組5 d ? 實驗組3?d ? 實驗組5 d ? 實驗組8 d ? 實驗組14 d??圖 2??術后兩組跟腱組織組織學觀察（HE×200）? 對照組5 d ? 實驗組3 d ? 實驗組5 d ? 實驗組8 d ? 實驗組14 d??圖 3??術后兩組跟腱組織免疫組織化學染色觀察（×400) ? 對照組5?d ? 實驗組3 d ? 實驗組5 d ? 實驗組8 d ? 實驗組14?d??圖 4??術后各時間點兩組跟腱組織HIF-lα基因相對表達量
Figure1.
Gross observation of Achilles tendon tissue in 2 groups after operation ? Control group at 5 days ? Experimental group at 3?days ? Experimental group at 5 days ? Experimental group at 8 days ? Experimental group at 14 days??Fig. 2??Histological observation of Achilles tendon tissue in 2 groups after operation (HE×200) ? Control group at 5 days ? Experimental group at 3 days ? Experimental group at 5 days ? Experimental group at 8 days ? Experimental group at 14 days??Fig. 3??Immunohistochemical staining observation of Achilles tendon tissue in 2 groups after operation (×400) ? Control group at 5 days ? Experimental group at 3 days ? Experimental group at 5 days ? Experimental group at 8 days ? Experimental group at 14 days??Fig. 4??The expression of HIF-lα mRNA in 2 groups at different time points after operation
2.2 組織學及免疫組織化學染色觀察
2.2.1 HE染色
對照組各時間點跟腱組織為規則結締組織。實驗組術后2～7 d可見大量炎性細胞浸潤，伴大量成纖維細胞增生；8～14 d仍可見大量炎性細胞，大量膠原纖維轉化為纖維結締組織。見圖 2。
2.2.2 免疫組織化學染色
各時間點對照組少見或未見棕褐色顆粒，呈陰性染色。實驗組術后2 d可見少量棕褐色顆粒；3～14 d可見大量深褐色顆粒，染色較對照組明顯加深，呈強陽性。見圖 3。
2.3 實時熒光定量PCR檢測
與對照組相比，實驗組各時間點HIF-lα基因相對表達量均明顯升高，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。組內比較：與術后2 d相比，實驗組術后3～14 d HIF-lα基因相對表達量均升高并維持較高水平，術后5 d時達峰值，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）；4、6 d間比較，7、8 d與10 d間比較以及12、14 d間比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）；其余各時間點比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。對照組術后HIF-lα基因相對表達量逐漸升高，術后5?d時達峰值，之后逐漸下降并維持較低水平；8、10、12、14 d間比較，差異無統計學意義（P > 0.05）；其余各時間點比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 4。
2.4 Western blot檢測
實驗組術后3、5、8、14 d HIF-lα蛋白相對表達量分別為2.03±0.32、1.96±0.35、1.47±0.04、1.68±0.07，均明顯高于對照組的1.17±0.09、1.13±0.14、0.99±0.13、1.20±0.02，比較差異有統計學意義（t=4.441，P=0.011；t=3.847，P=0.018；t=6.010，P=0.004；t=11.817，P=0.000）。見圖 5。
圖5
Western blot檢測術后兩組跟腱組織中HIF-lα蛋白含量1～4：實驗組術后3、5、8、14?d 5～8：對照組術后3、5、8、14?d??圖 6??術后10周兩組異位骨化形成觀察 ? 實驗組X線片 ? 對照組X線片 ? 實驗組大體觀察 ? 對照組大體觀察 ? A實驗組組織學觀察（HE×200） ? 對照組組織學觀察（HE×200）
Figure5.
The expression of HIF-lα protein in 2 groups after operation 1-4: Experimental group at 3, 5, 8, and 14 days after operation 5-8: Control group at 3, 5, 8, and 14 days after operation Fig. 6 The formation of heterotopic ossification in 2 groups at 10 weeks after operation ? X-ray film of experimental group ? X-ray film of control group ? Gross observation of experimental group ? Gross observation of control group ? Histological observation of experimental group (HE × 200) ? Histological observation of control group (HE × 200)
2.5 異位骨化形成情況
術后10周，X線片示對照組10只大鼠跟腱局部均無異位骨化發生；大體觀察跟腱呈白色，寬3～4 mm，厚1.0～1.5 mm；HE染色示跟腱組織為規則結締組織。X線片示實驗組9只大鼠跟腱局部均發生異位骨化；大體觀察跟腱斷端硬結較大，質地較硬；HE染色示可見成熟骨組織，骨小梁及板層骨樣結構等。見圖 6。
3 討論
異位骨化是一個多因素參與的復雜病理性骨發生過程，其具體發病機制仍不清楚，建立良好的實驗動物模型有助于對發病機制的深入研究。本研究團隊經過數年對實驗動物模型的研究改良，認為跟腱鉗夾、剪斷法能在較短時間內成功誘導異位骨化的發生[9-10]。該造模方法不僅簡易有效、重復性好，而且其組織學發生過程與臨床創傷所致的異位骨化過程較為相似，都是通過軟骨內骨化途徑形成，均可見成熟骨組織、骨小梁及板層骨樣結構等。本研究中，實驗組術后10周均成功制備大鼠跟腱創傷后異位骨化模型。
HIF-l是調節機體對缺氧反應的核轉錄因子，由HIF-lα和HIF-lβ兩種不同亞基組成，其活性主要由HIF-lα決定。在常氧環境下，細胞內HIF-lα可通過泛素化途徑降解；在低氧環境下，其泛素化途徑被抑制，HIF-lα在細胞內不斷累積并由細胞質轉入細胞核，與HIF-lβ亞基結合形成復合體后激活并啟動下游基因的轉錄和表達[11]。HIF-lα是一種低氧依賴性的轉錄因子，對機體細胞在低氧環境調控中起重要作用，能調控近100種基因的表達[5]。研究表明，HIF-lα在干細胞增殖、分化、誘導血管形成及骨形成等方面起重要作用[6-8]。目前，學者們一致認為異位骨化是通過軟骨內成骨途徑形成，且必須滿足以下3個條件：成骨的前體細胞、多種誘導因子及相關信號通路、適宜的微環境[12-13]。軟骨內成骨的重要特征之一就是有異位骨化前體細胞的存在，而血管生成和骨生成是異位骨化發生的重要環節，涉及眾多的誘導因子及信號通路。HIF-lα是參與和調控上述環節的重要因子。因此，本研究通過檢測HIF-lα在大鼠跟腱創傷后異位骨化模型中早期表達，探討HIF-lα及低氧微環境在創傷后異位骨化發病機制中的作用及意義。
本實驗中，大體觀察及組織學染色示：實驗組大鼠術后2～5 d跟腱斷端萎縮，周圍組織缺血壞死，提示創傷早期跟腱及周圍組織處于缺血、缺氧的微環境中；實時熒光定量PCR結果示：實驗組各時間點跟腱局部組織中HIF-lα基因相對表達量明顯高于對照組，且維持較高水平；對照組各時間點HIF-lα基因含量整體維持在較低水平，提示HIF-lα在創傷后異位骨化早期起作用。Western blot和免疫組織化學染色示：與對照組相比，實驗組各時間點跟腱局部組織中HIF-lα蛋白相對表達量均明顯升高，進一步提示HIF-lα在創傷后異位骨化早期起重要作用，且跟腱局部組織處于低氧微環境中。我們認為跟腱局部低氧微環境可能與以下因素有關：實驗組模型制備中，鉗夾、剪斷跟腱損害了其周圍的血管，是低氧微環境產生的基礎；關閉切口后，局部血腫的產生及組織灌注損傷加重了缺氧；跟腱組織細胞代謝耗氧進一步降低了局部氧含量。
有文獻報道在局部低氧微環境中，HIF-lα表達升高，能誘導、募集異位骨化前體細胞[6, 14]，同時能調控VEGF的表達。VEGF具有很強促血管生成的能力，能促進內皮細胞增殖與分化，誘導新生血管形成[15]。有研究指出HIF-lα可參與血管內皮細胞中2%以上基因的調控，其中包括血管生成素2、bFGF、胎盤生長因子等，這些因子與VEGF共同作用促進形成完整的新血管[16-17]。Dilling等[18]的研究發現，在異位骨化形成過程中，新生血管的形成出現在軟骨之前。所以，有學者指出，眾多血管刺激因子的高表達是異位骨化形成的必要條件[4, 19]。Lin等[4, 20]認為在低氧微環境中，HIF-lα的高表達能直接促進SOX-9的表達，誘導異位骨化前體細胞向軟骨細胞分化；通過BMP/SMAD信號通路調控Runx-2的表達，促進成骨細胞的分化，并認為VEGF能放大BMP/SMAD信號通路，最終導致異位骨化的發生。如果在創傷早期（48 h內）采用HIF-lα抑制劑干擾HIF-lα，VEGF、SOX-9、Runx-2的表達量均明顯下降，且異位骨化的發生率明顯降低。Agarwal等[14]研究認為，HIF-lα高表達可通過BMP/SMAD信號通路調控SOX-9的表達，SOX-9基因表達與HIF-lα具有同步變化關系。采用PX-478抑制HIF-lα后發現，異位骨化前體細胞減少，SOX-9的表達量下降，異位骨化骨體積明顯減小；而選擇性敲除HIF-lα基因后，無異位骨化前體細胞聚集，無軟骨形成。
綜上述，在局部低氧微環境中，HIF-lα高表達，參與或調控了異位骨化前體細胞的聚集、血管形成及骨形成等過程，表明局部低氧微環境及HIF-lα在創傷后異位骨化發病機制中起重要作用，其發病機制可能為：局部低氧微環境促使HIF-lα高表達，HIF-lα不僅能誘導、募集異位骨化前體細胞，促進多種血管生成因子的分泌，誘導新生血管形成，還能通過BMP/SMAD信號通路調控SOX-9、Runx-2的表達，最終誘導異位骨化發生。由于與HIF-lα相關的信號通路眾多，本研究未能全部檢測，因此該機制有待進一步研究探索。