引用本文： 張克忠, 劉光源, 田發明, 張柳. 辛伐他汀經p38MAPK信號通路調控BMSCs中晚期成骨分化的研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(8): 1038-1043. doi: 10.7507/1002-1892.20160208 復制
A研究表明，他汀類藥物具有促進骨形成作用，其作用機制大致可以分為4個方面：促進成骨細胞分化、抑制成骨細胞凋亡、抑制破骨細胞形成以及與維生素D聯合作用。1994年，Han等[1]首次發現了絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）家族的重要組成部分——p38MAPK信號通路，Lee等[2]發現p38MAPK信號通路激活后，成骨細胞的特異性因子Cbfa1表達增加。Yi等[3]在金納米顆粒（gold nanoparticles，AuNPs）的相關研究中，發現AuNPs通過活化p38MAPK信號通路，促進了MSCs向成骨細胞分化，并抑制了MSCs向脂肪細胞分化。國內研究發現，三七皂苷經ERK、p38MAPK信號通路促進BMSCs成骨分化[4]。本實驗采用體外給藥方式，在成骨誘導條件下，應用辛伐他汀誘導BMSCs向成骨細胞分化，探討辛伐他汀對BMSCs成骨誘導分化中晚期作用的最佳起效時間。用p38MAPK信號通路阻斷劑SB203580預處理，觀察其對辛伐他汀成骨誘導作用的影響，進一步探究辛伐他汀活化p38MAPK信號通路后，促進BMSCs向成骨細胞分化的作用機制。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4周齡SPF級雌性SD大鼠20只，體質量（75±10）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。辛伐他汀（Merck公司，德國），加入DMEM配制成終濃度為1×10-4 mol/L的濃縮液，過濾除菌后備用，實驗前調整為實驗濃度1×10-7 mol/L。p38MAPK信號通路阻斷劑SB203580（上海皓元生物醫藥科技有限公司）。大鼠ALP ELISA試劑盒（上海鑫樂生物科技有限公司）；逆轉錄試劑盒（大連寶生物工程有限公司）。iMark酶標儀、凝膠圖像分析儀（Bio-Rad公司，美國）；Rotor-Gene 3000 PCR儀（凱杰公司，德國）。
1.2 實驗方法
1.2.1 BMSCs分離培養及傳代
取20只大鼠采用脫頸法處死，無菌條件下取雙側股骨、脛骨骨髓，采用全骨髓培養法分離培養BMSCs，待細胞鋪滿培養瓶底80%～90%后傳代，取第2代細胞進行實驗。
1.2.2 實驗分組
根據培養方法不同，實驗分為5組。對照組（CM組）：完全培養基培養；辛伐他汀組（SIM組）：含終濃度為1×10-7 mol/L辛伐他汀的完全培養基培養；成骨誘導培養基組（OM組）：含10 mmol/ Lβ甘油磷酸鈉和50 μg/mL抗壞血酸的成骨誘導培養基培養，作為陽性對照；辛伐他汀和成骨誘導培養基組（OM+SIM組）：含終濃度為1×10-7 mol/L辛伐他汀成骨誘導培養基培養；阻斷劑組（OM+SIM+SB組）：先用p38MAPK信號通路阻斷劑SB203580干預30 min后，再采用含終濃度為1×10-7 mol/L辛伐他汀成骨誘導培養基培養。
1.3 觀測指標
1.3.1 MTT檢測
取BMSCs按照1×104個/孔濃度接種至96孔板，分為CM組及SIM組，每組8復孔。兩組給予對應培養基培養，分別于培養后2、3、4、5、6 d檢測細胞活性。每孔加入MTT工作液，置于37℃、5%CO2孵育箱，培養4 h后棄培養基，加入DMSO，酶標儀于波長490 nm處測量吸光度（A）值。
1.3.2 ELISA檢測
取BMSCs接種至細胞培養瓶中，分為OM組及OM+SIM組，對應加入培養液后，置于37℃、5%CO2孵育箱。于培養后7、14 d收集細胞，PBS對細胞懸液進行稀釋，使細胞濃度達約1×107個/mL；反復凍融，以離心半徑9 cm，2 500 r/ min離心20 min，收集上清。按照大鼠ALP ELISA試劑盒說明書操作，測量ALP含量。
1.3.3 實時定量PCR檢測
取BMSCs接種至細胞培養瓶中，分為OM組和OM+SIM組，分別于傳代后第21、28天更換為對應成骨誘導培養基。培養后1、12、24 h取細胞采用Trizol一步法提取總RNA。按照逆轉錄試劑盒合成cDNA第1鏈。相關引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應條件：95℃、30 s；95℃、5 s，60℃、30 s，40個循環。以標本擴增的Ct值和標準曲線得出該標本所檢測骨鈣素（osteocalcin，OCN）mRNA相對拷貝數，取其與內參基因GAPDH的比值作為相對表達量。實驗重復3次。見表 1。
表1
實時定量PCR引物序列以及大小
Table1.
Primer sequence and product size for real-time quantitative PCR
1.3.4 Western blot檢測
取BMSCs接種至細胞培養瓶中，分為OM組和OM+SIM組，分別于傳代后第21、28天更換為對應成骨誘導培養基，培養后1、12、24 h取細胞提取總蛋白，應用BCA法測定蛋白濃度，以GAPDH作為內參，轉膜，顯色，使用Image J圖像分析軟件掃描并測定圖像灰度值，以OCN蛋白與內參蛋白灰度值比值作為其相對表達量。實驗重復3次。
根據實時定量PCR及Western blot檢測結果，確定辛伐他汀誘導成骨干預的最佳起效時間。取BMSCs接種至細胞培養瓶中，分為OM組、OM+SIM組、OM+SIM+SB組，分別于傳代后第21、28天更換為對應成骨誘導培養基，OM+SIM+SB組更換培養基前采用SB203580干預30 min。培養至最佳起效時間后，取細胞同上法檢測磷酸化p38（phospho-p38，p-p38）和p38蛋白相對表達量，并計算p-p38與p38比值（p-p38/p38）進行組間比較。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時兩兩比較采用LSD法，方差不齊時采用Tamhane’s T2法；兩組間比較采用t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 MTT檢測
各時間點，SIM組A值與CM組比較差異均無統計學意義（P > 0.05），提示辛伐他汀對BMSCs活性和增殖能力無明顯影響。見圖 1。
圖1
MTT檢測SIM組與CM組細胞增殖活性??圖 2?實時定量PCR檢測OM組及OM+SIM組第21、28天開始成骨誘導培養后各時間點OCN mRNA表達???第21天第28天??圖 3? Western blot檢測OM組及OM+SIM組第21、28天開始成骨誘導培養后各時間點OCN蛋白表達1：OM組1 h 2：OM組12 h 3：OM組24 h 4：OM+SIM組1 h 5：OM+SIM組12 h 6：OM+SIM組24 h???第21天???第28天??圖 4?OM組及OM+SIM組第21、28天開始成骨誘導培養后各時間點OCN蛋白相對表達量比較???第21天???第28天??圖 5?Western blot檢測OM組、OM+SIM組及OM+SIM+SB組第21、28天開始成骨誘導培養后12 h p-p38和p38蛋白表達1：OM組2：OM+SIM組3：OM+SIM+SB組???第21天???第28天??圖 6?OM組、OM+SIM組及OM+SIM+SB組第21、28天開始成骨誘導培養后12 h p-p38/p38比較
Figure1.
Cell proliferation activity in SIM group and CM group by MTT assay ?Fig.2 OCN mRNA expression in OM group and OM+SIM group after 1, 12, and 24 hours of osteogenic induction at 21 and 28 days by real-time quantitative PCR???At 21 days???At 28 days ?Fig.3 OCN protein expression in OM group and OM+SIM group after 1, 12, and 24 hours of osteogenic induction at 21 and 28 days by Western blot 1: OM group at 1 hour 2: OM group at 12 hours 3: OM group at 24 hours 4: OM+SIM group at 1 hour 5: OM+SIM group at 12 hours 6: OM+SIM group at 24 hours???At 21 days???At 28 days ?Fig.4 Comparison of OCN protein expression between OM group and OM+SIM group after 1, 12, and 24 hours of osteogenic induction at 21 and 28 days???At 21 days???At 28 days ?Fig.5 The protein expression of p-p38 and p38 in OM group, OM+SIM group, and OM+SIM+SB group after 1, 12, and 24 hours of osteogenic induction at 21 and 28 days by Western blot 1: OM group 2: OM+SIM group 3: OM+SIM+SB group???At 21 days???At 28 days ?Fig.6 Comparison of p-p38/p38 among OM group, OM+SIM group, and OM+SIM+SB group after 12 hours of osteogenic induction at 21 and 28 days
2.2 ELISA檢測
OM組7、14 d時ALP含量分別為28.071±2.985、17.537±1.952，OM+SIM組分別為39.976±3.999、23.330±2.245。兩時間點OM+SIM組ALP含量均較OM組明顯增高，比較差異有統計學意義（t=5.834，P=0.001；t=5.737，P=0.002）。OM組和OM+SIM組7 d時ALP含量均高于同一組14 d時，比較差異有統計學意義（t=4.582，P=0.002；t=4.763，P=0.001）。
2.3 實時定量PCR檢測
2.3.1 組內比較
OM組：第21天開始成骨誘導培養后，12 h時OCN mRNA表達顯著高于1 h，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；亦高于24 h時，但差異無統計學意義（P > 0.05）。第28天行成骨誘導培養后，12 h時OCN mRNA表達顯著高于1、24 h，且比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。OM+SIM組：第21、28天開始成骨誘導培養后，12 h時OCN mRNA表達顯著高于1、24 h，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。第21天開始成骨誘導培養后，兩組培養12 h時OCN mRNA表達與對應第28天開始誘導培養12 h時比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖 2。
2.3.2 組間比較
第21、28天開始成骨誘導培養后，12、24 h時OM+SIM組OCN mRNA表達均顯著高于OM組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；1 h時差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖 2。
2.4 Western blot檢測
2.4.1 組內比較
兩組第21、28天開始成骨誘導培養12 h時OCN蛋白相對表達量與1、24 h比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。第21天開始成骨誘導培養后，兩組培養12 h時OCN蛋白表達與對應第28天開始誘導培養12 h時比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖 3、4。
2.4.2 組間比較
第21、28天開始成骨誘導培養后，各時間點OM+SIM組OCN蛋白表達量均顯著高于OM組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖 3、4。
根據OCN蛋白及mRNA檢測結果提示，辛伐他汀誘導成骨干預的最佳起效時間為給藥后12 h。Western blot檢驗，第21、28天開始成骨誘導培養12 h時，OM+SIM+SB組p-p38/p38明顯低于其他兩組，OM組低于OM+SIM組，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 5、6。
3 討論
3.1 辛伐他汀在BMSCs成骨分化過程中的作用
1999年，Mundy等[5]首次發現他汀類藥物能夠誘導骨細胞中BMP-2 mRNA表達水平上調，而BMP-2是公認的促成骨細胞轉化因子[6]。近年，Montazerolghaem等[7]研究發現，辛伐他汀與鋅協同作用可以增強成骨細胞活性，并降低炎性細胞急性應答。此后大量研究開始關注辛伐他汀的成骨作用，結果發現通過不同干預方式，辛伐他汀促進骨形成的作用效果差異顯著[8-9]。同時，Pullisaar等[10]研究證實辛伐他汀可以促進人脂肪來源MSCs向成骨細胞分化。因此，眾多學者對辛伐他汀促進骨形成作用的探索重心轉向局部和體外研究，其對BMSCs成骨分化的影響成為重點關注內容之一。
在成骨細胞分泌的基質中，Ⅰ型膠原具有重要作用，細胞增殖主要依靠Ⅰ型膠原[11]。OCN是一種非膠原骨基質蛋白，由分化成熟的成骨細胞分泌，在Ⅰ型膠原合成后，OCN mRNA表達上調，并在基質礦化期開始分泌，是BMSCs成骨分化晚期的特異性標致基因之一，其表達水平的變化可以作為藥物干預對BMSCs成骨分化能力影響的參考指標[12-13]。Walter等[14]研究證實辛伐他汀可以在體外培養環境中促進成骨細胞分化，并上調OCN的表達。本研究發現第21、28天開始成骨誘導后，OM組和OM+SIM組培養12 h時OCN蛋白及mRNA表達均最高，第21、28天間對應時間點無明顯差異；且OM+SIM組OCN表達明顯高于OM組。說明辛伐他汀在成骨分化過程中能促進OCN的表達。有研究發現，濃度為1×10-7 mol/L的辛伐他汀對誘導劑引起的OCN mRNA表達具有促進作用[15]。本研究發現，辛伐他汀聯合成骨誘導劑能夠上調OCN表達水平，誘導BMSCs向成骨細胞分化，而辛伐他汀給藥干預后的最佳起效時間為12 h。
3.2 p38MAPK信號通路對辛伐他汀誘導BMSCs成骨分化的調節作用
辛伐他汀可以通過作用于p38MAPK信號通路影響腸癌細胞、巨噬細胞的凋亡[16-17]。p38MAPK信號通路存在于所有的哺乳動物體內，參與并調節多種生物學反應。大鼠體內p38MAPK為骨骼正常發育提供保障，任何一種MAPK信號轉導途徑中的編碼基因缺失，如MKK3、MKK6、p38a或p38b，都會導致骨量減少和成骨細胞分化缺陷。在成骨細胞中，TGF-β激活的蛋白激酶1是激活p38上游的關鍵位點，缺乏蛋白激酶1會導致鎖骨發育不全和融合、表型相似性鎖骨顱骨發育和不全囟門延遲閉合等疾病的發生，提示p38MAPK信號通路在骨形成的過程中發揮重要作用[18]。Hu等[19]研究表明，miR-205可以通過p38MAPK信號通路影響BMSCs的成骨分化過程。Liao等[20]研究表明，金雀異黃素可以通過p38 MAPK通路促進BMSCs向成骨細胞分化。以往研究多注重于BMSCs成骨分化早中期信號轉導變化，而辛伐他汀通過活化p38MAPK信號通路誘導BMSCs向成骨細胞分化的中晚期細胞因子變化特點未見報道。本研究中，選擇p38MAPK信號通路特異性阻斷劑SB203580干預后，明顯抑制了BMSCs成骨分化中、晚期p-p38蛋白的表達，說明p38MAPK信號通路在辛伐他汀誘導BMSCs中晚期成骨分化過程中起到重要調節作用。
A研究表明，他汀類藥物具有促進骨形成作用，其作用機制大致可以分為4個方面：促進成骨細胞分化、抑制成骨細胞凋亡、抑制破骨細胞形成以及與維生素D聯合作用。1994年，Han等[1]首次發現了絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）家族的重要組成部分——p38MAPK信號通路，Lee等[2]發現p38MAPK信號通路激活后，成骨細胞的特異性因子Cbfa1表達增加。Yi等[3]在金納米顆粒（gold nanoparticles，AuNPs）的相關研究中，發現AuNPs通過活化p38MAPK信號通路，促進了MSCs向成骨細胞分化，并抑制了MSCs向脂肪細胞分化。國內研究發現，三七皂苷經ERK、p38MAPK信號通路促進BMSCs成骨分化[4]。本實驗采用體外給藥方式，在成骨誘導條件下，應用辛伐他汀誘導BMSCs向成骨細胞分化，探討辛伐他汀對BMSCs成骨誘導分化中晚期作用的最佳起效時間。用p38MAPK信號通路阻斷劑SB203580預處理，觀察其對辛伐他汀成骨誘導作用的影響，進一步探究辛伐他汀活化p38MAPK信號通路后，促進BMSCs向成骨細胞分化的作用機制。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4周齡SPF級雌性SD大鼠20只，體質量（75±10）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。辛伐他汀（Merck公司，德國），加入DMEM配制成終濃度為1×10-4 mol/L的濃縮液，過濾除菌后備用，實驗前調整為實驗濃度1×10-7 mol/L。p38MAPK信號通路阻斷劑SB203580（上海皓元生物醫藥科技有限公司）。大鼠ALP ELISA試劑盒（上海鑫樂生物科技有限公司）；逆轉錄試劑盒（大連寶生物工程有限公司）。iMark酶標儀、凝膠圖像分析儀（Bio-Rad公司，美國）；Rotor-Gene 3000 PCR儀（凱杰公司，德國）。
1.2 實驗方法
1.2.1 BMSCs分離培養及傳代
取20只大鼠采用脫頸法處死，無菌條件下取雙側股骨、脛骨骨髓，采用全骨髓培養法分離培養BMSCs，待細胞鋪滿培養瓶底80%～90%后傳代，取第2代細胞進行實驗。
1.2.2 實驗分組
根據培養方法不同，實驗分為5組。對照組（CM組）：完全培養基培養；辛伐他汀組（SIM組）：含終濃度為1×10-7 mol/L辛伐他汀的完全培養基培養；成骨誘導培養基組（OM組）：含10 mmol/ Lβ甘油磷酸鈉和50 μg/mL抗壞血酸的成骨誘導培養基培養，作為陽性對照；辛伐他汀和成骨誘導培養基組（OM+SIM組）：含終濃度為1×10-7 mol/L辛伐他汀成骨誘導培養基培養；阻斷劑組（OM+SIM+SB組）：先用p38MAPK信號通路阻斷劑SB203580干預30 min后，再采用含終濃度為1×10-7 mol/L辛伐他汀成骨誘導培養基培養。
1.3 觀測指標
1.3.1 MTT檢測
取BMSCs按照1×104個/孔濃度接種至96孔板，分為CM組及SIM組，每組8復孔。兩組給予對應培養基培養，分別于培養后2、3、4、5、6 d檢測細胞活性。每孔加入MTT工作液，置于37℃、5%CO2孵育箱，培養4 h后棄培養基，加入DMSO，酶標儀于波長490 nm處測量吸光度（A）值。
1.3.2 ELISA檢測
取BMSCs接種至細胞培養瓶中，分為OM組及OM+SIM組，對應加入培養液后，置于37℃、5%CO2孵育箱。于培養后7、14 d收集細胞，PBS對細胞懸液進行稀釋，使細胞濃度達約1×107個/mL；反復凍融，以離心半徑9 cm，2 500 r/ min離心20 min，收集上清。按照大鼠ALP ELISA試劑盒說明書操作，測量ALP含量。
1.3.3 實時定量PCR檢測
取BMSCs接種至細胞培養瓶中，分為OM組和OM+SIM組，分別于傳代后第21、28天更換為對應成骨誘導培養基。培養后1、12、24 h取細胞采用Trizol一步法提取總RNA。按照逆轉錄試劑盒合成cDNA第1鏈。相關引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應條件：95℃、30 s；95℃、5 s，60℃、30 s，40個循環。以標本擴增的Ct值和標準曲線得出該標本所檢測骨鈣素（osteocalcin，OCN）mRNA相對拷貝數，取其與內參基因GAPDH的比值作為相對表達量。實驗重復3次。見表 1。
表1
實時定量PCR引物序列以及大小
Table1.
Primer sequence and product size for real-time quantitative PCR
1.3.4 Western blot檢測
取BMSCs接種至細胞培養瓶中，分為OM組和OM+SIM組，分別于傳代后第21、28天更換為對應成骨誘導培養基，培養后1、12、24 h取細胞提取總蛋白，應用BCA法測定蛋白濃度，以GAPDH作為內參，轉膜，顯色，使用Image J圖像分析軟件掃描并測定圖像灰度值，以OCN蛋白與內參蛋白灰度值比值作為其相對表達量。實驗重復3次。
根據實時定量PCR及Western blot檢測結果，確定辛伐他汀誘導成骨干預的最佳起效時間。取BMSCs接種至細胞培養瓶中，分為OM組、OM+SIM組、OM+SIM+SB組，分別于傳代后第21、28天更換為對應成骨誘導培養基，OM+SIM+SB組更換培養基前采用SB203580干預30 min。培養至最佳起效時間后，取細胞同上法檢測磷酸化p38（phospho-p38，p-p38）和p38蛋白相對表達量，并計算p-p38與p38比值（p-p38/p38）進行組間比較。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時兩兩比較采用LSD法，方差不齊時采用Tamhane’s T2法；兩組間比較采用t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 MTT檢測
各時間點，SIM組A值與CM組比較差異均無統計學意義（P > 0.05），提示辛伐他汀對BMSCs活性和增殖能力無明顯影響。見圖 1。
圖1
MTT檢測SIM組與CM組細胞增殖活性??圖 2?實時定量PCR檢測OM組及OM+SIM組第21、28天開始成骨誘導培養后各時間點OCN mRNA表達???第21天第28天??圖 3? Western blot檢測OM組及OM+SIM組第21、28天開始成骨誘導培養后各時間點OCN蛋白表達1：OM組1 h 2：OM組12 h 3：OM組24 h 4：OM+SIM組1 h 5：OM+SIM組12 h 6：OM+SIM組24 h???第21天???第28天??圖 4?OM組及OM+SIM組第21、28天開始成骨誘導培養后各時間點OCN蛋白相對表達量比較???第21天???第28天??圖 5?Western blot檢測OM組、OM+SIM組及OM+SIM+SB組第21、28天開始成骨誘導培養后12 h p-p38和p38蛋白表達1：OM組2：OM+SIM組3：OM+SIM+SB組???第21天???第28天??圖 6?OM組、OM+SIM組及OM+SIM+SB組第21、28天開始成骨誘導培養后12 h p-p38/p38比較
Figure1.
Cell proliferation activity in SIM group and CM group by MTT assay ?Fig.2 OCN mRNA expression in OM group and OM+SIM group after 1, 12, and 24 hours of osteogenic induction at 21 and 28 days by real-time quantitative PCR???At 21 days???At 28 days ?Fig.3 OCN protein expression in OM group and OM+SIM group after 1, 12, and 24 hours of osteogenic induction at 21 and 28 days by Western blot 1: OM group at 1 hour 2: OM group at 12 hours 3: OM group at 24 hours 4: OM+SIM group at 1 hour 5: OM+SIM group at 12 hours 6: OM+SIM group at 24 hours???At 21 days???At 28 days ?Fig.4 Comparison of OCN protein expression between OM group and OM+SIM group after 1, 12, and 24 hours of osteogenic induction at 21 and 28 days???At 21 days???At 28 days ?Fig.5 The protein expression of p-p38 and p38 in OM group, OM+SIM group, and OM+SIM+SB group after 1, 12, and 24 hours of osteogenic induction at 21 and 28 days by Western blot 1: OM group 2: OM+SIM group 3: OM+SIM+SB group???At 21 days???At 28 days ?Fig.6 Comparison of p-p38/p38 among OM group, OM+SIM group, and OM+SIM+SB group after 12 hours of osteogenic induction at 21 and 28 days
2.2 ELISA檢測
OM組7、14 d時ALP含量分別為28.071±2.985、17.537±1.952，OM+SIM組分別為39.976±3.999、23.330±2.245。兩時間點OM+SIM組ALP含量均較OM組明顯增高，比較差異有統計學意義（t=5.834，P=0.001；t=5.737，P=0.002）。OM組和OM+SIM組7 d時ALP含量均高于同一組14 d時，比較差異有統計學意義（t=4.582，P=0.002；t=4.763，P=0.001）。
2.3 實時定量PCR檢測
2.3.1 組內比較
OM組：第21天開始成骨誘導培養后，12 h時OCN mRNA表達顯著高于1 h，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；亦高于24 h時，但差異無統計學意義（P > 0.05）。第28天行成骨誘導培養后，12 h時OCN mRNA表達顯著高于1、24 h，且比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。OM+SIM組：第21、28天開始成骨誘導培養后，12 h時OCN mRNA表達顯著高于1、24 h，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。第21天開始成骨誘導培養后，兩組培養12 h時OCN mRNA表達與對應第28天開始誘導培養12 h時比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖 2。
2.3.2 組間比較
第21、28天開始成骨誘導培養后，12、24 h時OM+SIM組OCN mRNA表達均顯著高于OM組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；1 h時差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖 2。
2.4 Western blot檢測
2.4.1 組內比較
兩組第21、28天開始成骨誘導培養12 h時OCN蛋白相對表達量與1、24 h比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。第21天開始成骨誘導培養后，兩組培養12 h時OCN蛋白表達與對應第28天開始誘導培養12 h時比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖 3、4。
2.4.2 組間比較
第21、28天開始成骨誘導培養后，各時間點OM+SIM組OCN蛋白表達量均顯著高于OM組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖 3、4。
根據OCN蛋白及mRNA檢測結果提示，辛伐他汀誘導成骨干預的最佳起效時間為給藥后12 h。Western blot檢驗，第21、28天開始成骨誘導培養12 h時，OM+SIM+SB組p-p38/p38明顯低于其他兩組，OM組低于OM+SIM組，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 5、6。
3 討論
3.1 辛伐他汀在BMSCs成骨分化過程中的作用
1999年，Mundy等[5]首次發現他汀類藥物能夠誘導骨細胞中BMP-2 mRNA表達水平上調，而BMP-2是公認的促成骨細胞轉化因子[6]。近年，Montazerolghaem等[7]研究發現，辛伐他汀與鋅協同作用可以增強成骨細胞活性，并降低炎性細胞急性應答。此后大量研究開始關注辛伐他汀的成骨作用，結果發現通過不同干預方式，辛伐他汀促進骨形成的作用效果差異顯著[8-9]。同時，Pullisaar等[10]研究證實辛伐他汀可以促進人脂肪來源MSCs向成骨細胞分化。因此，眾多學者對辛伐他汀促進骨形成作用的探索重心轉向局部和體外研究，其對BMSCs成骨分化的影響成為重點關注內容之一。
在成骨細胞分泌的基質中，Ⅰ型膠原具有重要作用，細胞增殖主要依靠Ⅰ型膠原[11]。OCN是一種非膠原骨基質蛋白，由分化成熟的成骨細胞分泌，在Ⅰ型膠原合成后，OCN mRNA表達上調，并在基質礦化期開始分泌，是BMSCs成骨分化晚期的特異性標致基因之一，其表達水平的變化可以作為藥物干預對BMSCs成骨分化能力影響的參考指標[12-13]。Walter等[14]研究證實辛伐他汀可以在體外培養環境中促進成骨細胞分化，并上調OCN的表達。本研究發現第21、28天開始成骨誘導后，OM組和OM+SIM組培養12 h時OCN蛋白及mRNA表達均最高，第21、28天間對應時間點無明顯差異；且OM+SIM組OCN表達明顯高于OM組。說明辛伐他汀在成骨分化過程中能促進OCN的表達。有研究發現，濃度為1×10-7 mol/L的辛伐他汀對誘導劑引起的OCN mRNA表達具有促進作用[15]。本研究發現，辛伐他汀聯合成骨誘導劑能夠上調OCN表達水平，誘導BMSCs向成骨細胞分化，而辛伐他汀給藥干預后的最佳起效時間為12 h。
3.2 p38MAPK信號通路對辛伐他汀誘導BMSCs成骨分化的調節作用
辛伐他汀可以通過作用于p38MAPK信號通路影響腸癌細胞、巨噬細胞的凋亡[16-17]。p38MAPK信號通路存在于所有的哺乳動物體內，參與并調節多種生物學反應。大鼠體內p38MAPK為骨骼正常發育提供保障，任何一種MAPK信號轉導途徑中的編碼基因缺失，如MKK3、MKK6、p38a或p38b，都會導致骨量減少和成骨細胞分化缺陷。在成骨細胞中，TGF-β激活的蛋白激酶1是激活p38上游的關鍵位點，缺乏蛋白激酶1會導致鎖骨發育不全和融合、表型相似性鎖骨顱骨發育和不全囟門延遲閉合等疾病的發生，提示p38MAPK信號通路在骨形成的過程中發揮重要作用[18]。Hu等[19]研究表明，miR-205可以通過p38MAPK信號通路影響BMSCs的成骨分化過程。Liao等[20]研究表明，金雀異黃素可以通過p38 MAPK通路促進BMSCs向成骨細胞分化。以往研究多注重于BMSCs成骨分化早中期信號轉導變化，而辛伐他汀通過活化p38MAPK信號通路誘導BMSCs向成骨細胞分化的中晚期細胞因子變化特點未見報道。本研究中，選擇p38MAPK信號通路特異性阻斷劑SB203580干預后，明顯抑制了BMSCs成骨分化中、晚期p-p38蛋白的表達，說明p38MAPK信號通路在辛伐他汀誘導BMSCs中晚期成骨分化過程中起到重要調節作用。
