引用本文： 吳軍, 湯慧芹, 劉群, 干定云, 周曼. α硫辛酸抑制miR-29b表達抗氧化應激促進小鼠糖尿病足愈合的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(8): 1034-1037. doi: 10.7507/1002-1892.20160207 復制
糖尿病足是糖尿病嚴重慢性并發癥之一，不僅導致患者生活質量嚴重下降，而且治療困難，是糖尿病患者非外傷性截肢、致死的首要原因[1-2]。探索糖尿病足發生發展的分子機制對于防治這一并發癥具有重要意義。研究表明，創面組織中氧化應激增強可能促進糖尿病足的發展，是導致糖尿病足創面難愈的原因之一[3]。改善氧化應激狀態有望成為防治糖尿病慢性并發癥的有效措施。α硫辛酸是一種高效天然抗氧化劑，可清除活性氧和自由基，螯合金屬離子，再生谷胱甘肽、維生素C、維生素E等抗氧化劑，從而減弱氧化應激[4]。目前臨床研究表明，α硫辛酸可促進糖尿病足治療效果[5-6]，但具體分子機制還不完全清楚。
miRNA是近年發現的一組由19～25個核苷酸組成的功能性非編碼小RNA，具有保守性、組織特異性和階段特異性[7]。miRNA表達異常與2型糖尿病的發生發展密切相關[8]。研究證實，has-miR-29b在糖尿病發病過程中發揮重要作用[9]。α硫辛酸是否可以通過抑制miR-29b表達改善糖尿病足創面組織的氧化應激，從而促進其愈合尚不清楚。為此，本研究通過觀察α硫辛酸對糖尿病足模型小鼠創面愈合和氧化應激的影響，探討其具體作用機制，為臨床用藥提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
普通級近交系雄性C57BL/6J小鼠60只，體質量200～300 g，購自常州卡文斯實驗動物有限公司。鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ；Sigma公司，美國）；慢病毒包裝的miR-29b mimic及其陰性對照（上海吉瑪制藥技術有限公司）；TRIzol試劑（Invitrogen公司，美國）。Image Pro-Plus軟件（Media Cybernetics公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
將60只小鼠隨機分為4組，每組15只；分別為糖尿病足組（對照組）、α硫辛酸組、miR-29b mimic組及miR-29b mimic陰性對照組（NC組）。各組小鼠每天腹腔注射STZ緩沖液（40 mg/kg），連續注射5 d。4周后測定小鼠尾尖血糖，隨機血糖超過11.1 mmol/L提示2型糖尿病模型制備成功。然后，小鼠腹腔注射0.4%水合氯醛（40 mL/kg）麻醉，下肢脫毛，在后背近腿部皮膚制備大小為5 mm×2 mm的全層創面，建立糖尿病足創面模型。術后對照組給予高脂高糖飲食（含12.0%熟豬油、20.0%蔗糖、2.0%膽固醇、1.0%膽酸鹽、65%常規飼料）喂養。α硫辛酸組在高脂高糖飲食基礎上，于創面制備當天（第0天）開始，每日尾靜脈注射α硫辛酸（100 mg/ kg），連續14 d。miR-29b mimic組及NC組在給予高脂高糖飲食以及注射α硫辛酸基礎上，于第0天尾靜脈分別注射慢病毒包裝后的miR-29b mimic及其陰性對照，病毒注射量為2×107 TU。
1.3 觀測指標
1.3.1 創面愈合觀測
模型制備后觀察各組小鼠存活以及創面愈合情況。第7、14天各組創面照相，采用Image Pro-Plus軟件測量創面面積，并按照公式計算相對創面面積，公式為：第n天創面面積/原始創面面積×100%。
1.3.2 實時熒光定量PCR檢測
第0、7、14天，對照組及α硫辛酸組各取5只小鼠脊椎脫臼法處死，切取創面全層組織。PBS洗滌后置于1.5 mL EP管中，加入1 mL TRIzol試劑，按TRIzol試劑說明書提取總RNA并測定RNA濃度。然后進行逆轉錄反應。首先加入RT-PCR反應體系試劑并進行變性退火：RT-PCR引物2 μL，加dd H2O至19 μL；放入PCR儀70℃ 10 min進行變性退火反應。然后繼續加入反應體系：緩沖液（Buffer）10 μL，2.5 nmol/L dNTP 2 μL，Prime Script RTase 200 U/ μL 2.5 μL，加dd H2O至50 μL。按30 ℃ 10 min，42℃ 60 min，70 ℃ 15 min的反應條件進行逆轉錄反應。miR-29b上游引物：5’-CGAGTAGGACCATTAGAAATCAGTGTTA-3’，下游引物：5’-TTCAAGTAATTCAGGATAGGT-3’；U6上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物：5’-TTCAAGTAATTCAGGATAGGT-3’。引物由北京天根生物技術有限公司合成。反應體系：含SYBR的PCR預混合液10 μL，ROX染料0.4 μL，逆轉錄產物2 μL，上、下游產物各2 μL，加dd H2O至20 μL。擴增過程：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 10 s，60℃ 34 s；擴增40個循環。根據目標基因miR-29b和內參基因U6的Ct值，采用2-ΔΔCt法計算miR-29b相對表達量。
1.3.3 氧化應激觀測
第14天，miR-29b mimic組及NC組各取5只小鼠，脊椎脫臼法處死后，切取創面全層組織；對照組及α硫辛酸組取同時間點創面組織。采用黃嘌呤氧化酶法和二硫代硝基苯甲酸（5，5-dithiobis-2-nitrobenzoic acid，DTNB）染色法分別測定組織中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量。
1.4 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組內各時間點比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 α硫辛酸對創面的作用
2.1.1 創面愈合
模型制備后各組小鼠均存活至實驗完成。α硫辛酸組創面愈合快于對照組。α硫辛酸組第7、14天相對創面面積分別為40.7%±3.2%、18.2%±3.0%，顯著低于對照組的72.0%±5.9%、50.4%±5.5%，比較差異均有統計學意義（t=9.814，P=0.000；t=11.456，P=0.000）。
2.1.2 創面miR-29b表達
組內比較：對照組及α硫辛酸組創面組織第0、7、14天miR-29b相對表達量呈逐漸降低趨勢，各時間點間比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。組間比較：第0天兩組間比較差異無統計學意義（t=0.183，P=0.859）；第7、14天α硫辛酸組miR-29b相對表達量顯著低于對照組，比較差異有統計學意義（t=9.564，P=0.000；t=11.289，P=0.000）。見圖 1。
圖1
第0、7、14天對照組及α硫辛酸組創面miR-29b相對表達量
Figure1.
The relative miR-29b expression of wound tissues in control group andα-lipoic acid-treated group at the same day, 7, and 14 days after modeling
2.1.3 創面SOD和GSH活性
第14天α硫辛酸組創面組織中SOD和GSH含量分別為（56.4±3.4）U/mgprot、（15.3±1.3）mg/gprot，顯著高于對照組的（34.4±4.0）U/mgprot、（11.2±1.4）mg/gprot，比較差異有統計學意義（t=—9.450，P=0.000；t=—4.879，P=0.001）。
2.2 miR-29b mimic對α硫辛酸處理創面的作用
2.2.1 創面愈合miR-29b
mimic組第7、14天相對創面面積分別為61.4%±3.8%、43.2%±4.2%，顯著高于NC組的40.2%±2.6%、18.2%±2.2%，比較差異均有統計學意義（t=—10.345，P=0.000；t=—11.945，P=0.000）。
2.2.2 創面SOD和GSH活性
第14天，miR-29bmimic組創面組織中SOD和GSH含量分別為（40.8±3.6）U/mgprot、（12.0±1.3）mg/gprot，均顯著低于NC組的（57.4±4.7）U/mgprot、（15.6±1.1）mg/gprot，比較差異有統計學意義（t=6.274，P=0.000；t=4.790，P=0.001）。
3 討論
研究發現，糖尿病患者的皮膚局部組織長期處于高糖狀態，使得氧化產物蓄積，導致氧化應激亢進和抗氧化能力下降，進而促進皮膚組織細胞凋亡，引起神經和微血管損傷，皮膚組織學的改變會加重糖尿病足進程，造成創面難以愈合[3]。因此，降低機體和糖尿病足創面處氧化應激是促進糖尿病足創面愈合的重要方法。α硫辛酸是一種強力抗氧化劑，具有較好的抗氧化應激和減輕炎性反應作用，它在多酶復合體中作為輔酶起作用[10]，可以通過清除自由基和鰲合體內鐵、銅等金屬離子，減少OH-的形成，抑制神經內氧化應激狀態，增加神經營養血管的血流量，加快神經傳導速度，提高神經Na+-K+-ATP酶活性，因此在糖尿病及其并發癥的治療中具有廣泛的應用前景。目前α硫辛酸已用于糖尿病神經病變的治療，并發現有顯著療效[11]。已有研究表明，α硫辛酸可通過清除氧自由基，改善氧化應激狀態來調整糖尿病小鼠的血糖水平，促進創面愈合[12-13]。α硫辛酸注射液可促進Wagner 1～3級的糖尿病足潰瘍愈合，具有較好療效[5]。本研究中，我們同樣發現α硫辛酸可顯著促進糖尿病足小鼠創面的愈合，此外還可提高創面組織中抗氧化指標SOD和GSH水平，與既往研究結果一致[12]。然而，關于α硫辛酸提高機體和創面組織抗氧化能力并促進創面愈合的具體分子機制，目前尚不完全清楚。
miRNA主要通過與靶mRNA的3’端非編碼區完全或不完全的堿基互補結合，參與近1/3基因表達的調控[7]。大量研究證實miRNA參與了細胞多種生命過程，也是各類疾病發生發展的重要分子機制[13-14]。此外，miRNA被認為可以作為糖尿病發病機制的研究靶點和診斷標志，并有可能用于靶向治療[15]。近期有研究應用定量PCR檢測技術，發現2型糖尿病患者外周血清中miR-29b表達高于正常對照組[16-17]，且炎性細胞因子通過上調miR-29b表達調節抗凋亡蛋白水平誘導胰島β細胞凋亡，從而促進1型糖尿病的發生[18]，提示miR-29b在糖尿病及其并發癥中可能發揮重要作用。目前關于miR-29b對糖尿病足創面愈合的影響及其可能機制罕見報道。本研究中，我們發現α硫辛酸會降低創面組織中miR-29b表達水平；對經α硫辛酸處理的糖尿病模型小鼠分別注射慢病毒包裝的miR-29b mimic及其陰性對照后，發現與NC組相比，miR-29b mimic能顯著抑制小鼠創面愈合。進一步研究發現，miR-29b mimic同樣可抑制α硫辛酸處理糖尿病足模型小鼠SOD和GSH的水平，表明miR-29b可能通過調節氧化應激水平參與糖尿病足的創面愈合。
綜上述，α硫辛酸可降低糖尿病足創面組織miR-29b的表達，并通過抑制miR-29b的表達降低創面氧化應激水平，從而促進糖尿病足的創面愈合。本研究結果為明確α硫辛酸保護和治療糖尿病足機制提供了實驗依據，也為miR-29b作為預防和治療糖尿病及其并發癥的分子靶點提供了思路。
糖尿病足是糖尿病嚴重慢性并發癥之一，不僅導致患者生活質量嚴重下降，而且治療困難，是糖尿病患者非外傷性截肢、致死的首要原因[1-2]。探索糖尿病足發生發展的分子機制對于防治這一并發癥具有重要意義。研究表明，創面組織中氧化應激增強可能促進糖尿病足的發展，是導致糖尿病足創面難愈的原因之一[3]。改善氧化應激狀態有望成為防治糖尿病慢性并發癥的有效措施。α硫辛酸是一種高效天然抗氧化劑，可清除活性氧和自由基，螯合金屬離子，再生谷胱甘肽、維生素C、維生素E等抗氧化劑，從而減弱氧化應激[4]。目前臨床研究表明，α硫辛酸可促進糖尿病足治療效果[5-6]，但具體分子機制還不完全清楚。
miRNA是近年發現的一組由19～25個核苷酸組成的功能性非編碼小RNA，具有保守性、組織特異性和階段特異性[7]。miRNA表達異常與2型糖尿病的發生發展密切相關[8]。研究證實，has-miR-29b在糖尿病發病過程中發揮重要作用[9]。α硫辛酸是否可以通過抑制miR-29b表達改善糖尿病足創面組織的氧化應激，從而促進其愈合尚不清楚。為此，本研究通過觀察α硫辛酸對糖尿病足模型小鼠創面愈合和氧化應激的影響，探討其具體作用機制，為臨床用藥提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
普通級近交系雄性C57BL/6J小鼠60只，體質量200～300 g，購自常州卡文斯實驗動物有限公司。鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ；Sigma公司，美國）；慢病毒包裝的miR-29b mimic及其陰性對照（上海吉瑪制藥技術有限公司）；TRIzol試劑（Invitrogen公司，美國）。Image Pro-Plus軟件（Media Cybernetics公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
將60只小鼠隨機分為4組，每組15只；分別為糖尿病足組（對照組）、α硫辛酸組、miR-29b mimic組及miR-29b mimic陰性對照組（NC組）。各組小鼠每天腹腔注射STZ緩沖液（40 mg/kg），連續注射5 d。4周后測定小鼠尾尖血糖，隨機血糖超過11.1 mmol/L提示2型糖尿病模型制備成功。然后，小鼠腹腔注射0.4%水合氯醛（40 mL/kg）麻醉，下肢脫毛，在后背近腿部皮膚制備大小為5 mm×2 mm的全層創面，建立糖尿病足創面模型。術后對照組給予高脂高糖飲食（含12.0%熟豬油、20.0%蔗糖、2.0%膽固醇、1.0%膽酸鹽、65%常規飼料）喂養。α硫辛酸組在高脂高糖飲食基礎上，于創面制備當天（第0天）開始，每日尾靜脈注射α硫辛酸（100 mg/ kg），連續14 d。miR-29b mimic組及NC組在給予高脂高糖飲食以及注射α硫辛酸基礎上，于第0天尾靜脈分別注射慢病毒包裝后的miR-29b mimic及其陰性對照，病毒注射量為2×107 TU。
1.3 觀測指標
1.3.1 創面愈合觀測
模型制備后觀察各組小鼠存活以及創面愈合情況。第7、14天各組創面照相，采用Image Pro-Plus軟件測量創面面積，并按照公式計算相對創面面積，公式為：第n天創面面積/原始創面面積×100%。
1.3.2 實時熒光定量PCR檢測
第0、7、14天，對照組及α硫辛酸組各取5只小鼠脊椎脫臼法處死，切取創面全層組織。PBS洗滌后置于1.5 mL EP管中，加入1 mL TRIzol試劑，按TRIzol試劑說明書提取總RNA并測定RNA濃度。然后進行逆轉錄反應。首先加入RT-PCR反應體系試劑并進行變性退火：RT-PCR引物2 μL，加dd H2O至19 μL；放入PCR儀70℃ 10 min進行變性退火反應。然后繼續加入反應體系：緩沖液（Buffer）10 μL，2.5 nmol/L dNTP 2 μL，Prime Script RTase 200 U/ μL 2.5 μL，加dd H2O至50 μL。按30 ℃ 10 min，42℃ 60 min，70 ℃ 15 min的反應條件進行逆轉錄反應。miR-29b上游引物：5’-CGAGTAGGACCATTAGAAATCAGTGTTA-3’，下游引物：5’-TTCAAGTAATTCAGGATAGGT-3’；U6上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物：5’-TTCAAGTAATTCAGGATAGGT-3’。引物由北京天根生物技術有限公司合成。反應體系：含SYBR的PCR預混合液10 μL，ROX染料0.4 μL，逆轉錄產物2 μL，上、下游產物各2 μL，加dd H2O至20 μL。擴增過程：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 10 s，60℃ 34 s；擴增40個循環。根據目標基因miR-29b和內參基因U6的Ct值，采用2-ΔΔCt法計算miR-29b相對表達量。
1.3.3 氧化應激觀測
第14天，miR-29b mimic組及NC組各取5只小鼠，脊椎脫臼法處死后，切取創面全層組織；對照組及α硫辛酸組取同時間點創面組織。采用黃嘌呤氧化酶法和二硫代硝基苯甲酸（5，5-dithiobis-2-nitrobenzoic acid，DTNB）染色法分別測定組織中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量。
1.4 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組內各時間點比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 α硫辛酸對創面的作用
2.1.1 創面愈合
模型制備后各組小鼠均存活至實驗完成。α硫辛酸組創面愈合快于對照組。α硫辛酸組第7、14天相對創面面積分別為40.7%±3.2%、18.2%±3.0%，顯著低于對照組的72.0%±5.9%、50.4%±5.5%，比較差異均有統計學意義（t=9.814，P=0.000；t=11.456，P=0.000）。
2.1.2 創面miR-29b表達
組內比較：對照組及α硫辛酸組創面組織第0、7、14天miR-29b相對表達量呈逐漸降低趨勢，各時間點間比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。組間比較：第0天兩組間比較差異無統計學意義（t=0.183，P=0.859）；第7、14天α硫辛酸組miR-29b相對表達量顯著低于對照組，比較差異有統計學意義（t=9.564，P=0.000；t=11.289，P=0.000）。見圖 1。
圖1
第0、7、14天對照組及α硫辛酸組創面miR-29b相對表達量
Figure1.
The relative miR-29b expression of wound tissues in control group andα-lipoic acid-treated group at the same day, 7, and 14 days after modeling
2.1.3 創面SOD和GSH活性
第14天α硫辛酸組創面組織中SOD和GSH含量分別為（56.4±3.4）U/mgprot、（15.3±1.3）mg/gprot，顯著高于對照組的（34.4±4.0）U/mgprot、（11.2±1.4）mg/gprot，比較差異有統計學意義（t=—9.450，P=0.000；t=—4.879，P=0.001）。
2.2 miR-29b mimic對α硫辛酸處理創面的作用
2.2.1 創面愈合miR-29b
mimic組第7、14天相對創面面積分別為61.4%±3.8%、43.2%±4.2%，顯著高于NC組的40.2%±2.6%、18.2%±2.2%，比較差異均有統計學意義（t=—10.345，P=0.000；t=—11.945，P=0.000）。
2.2.2 創面SOD和GSH活性
第14天，miR-29bmimic組創面組織中SOD和GSH含量分別為（40.8±3.6）U/mgprot、（12.0±1.3）mg/gprot，均顯著低于NC組的（57.4±4.7）U/mgprot、（15.6±1.1）mg/gprot，比較差異有統計學意義（t=6.274，P=0.000；t=4.790，P=0.001）。
3 討論
研究發現，糖尿病患者的皮膚局部組織長期處于高糖狀態，使得氧化產物蓄積，導致氧化應激亢進和抗氧化能力下降，進而促進皮膚組織細胞凋亡，引起神經和微血管損傷，皮膚組織學的改變會加重糖尿病足進程，造成創面難以愈合[3]。因此，降低機體和糖尿病足創面處氧化應激是促進糖尿病足創面愈合的重要方法。α硫辛酸是一種強力抗氧化劑，具有較好的抗氧化應激和減輕炎性反應作用，它在多酶復合體中作為輔酶起作用[10]，可以通過清除自由基和鰲合體內鐵、銅等金屬離子，減少OH-的形成，抑制神經內氧化應激狀態，增加神經營養血管的血流量，加快神經傳導速度，提高神經Na+-K+-ATP酶活性，因此在糖尿病及其并發癥的治療中具有廣泛的應用前景。目前α硫辛酸已用于糖尿病神經病變的治療，并發現有顯著療效[11]。已有研究表明，α硫辛酸可通過清除氧自由基，改善氧化應激狀態來調整糖尿病小鼠的血糖水平，促進創面愈合[12-13]。α硫辛酸注射液可促進Wagner 1～3級的糖尿病足潰瘍愈合，具有較好療效[5]。本研究中，我們同樣發現α硫辛酸可顯著促進糖尿病足小鼠創面的愈合，此外還可提高創面組織中抗氧化指標SOD和GSH水平，與既往研究結果一致[12]。然而，關于α硫辛酸提高機體和創面組織抗氧化能力并促進創面愈合的具體分子機制，目前尚不完全清楚。
miRNA主要通過與靶mRNA的3’端非編碼區完全或不完全的堿基互補結合，參與近1/3基因表達的調控[7]。大量研究證實miRNA參與了細胞多種生命過程，也是各類疾病發生發展的重要分子機制[13-14]。此外，miRNA被認為可以作為糖尿病發病機制的研究靶點和診斷標志，并有可能用于靶向治療[15]。近期有研究應用定量PCR檢測技術，發現2型糖尿病患者外周血清中miR-29b表達高于正常對照組[16-17]，且炎性細胞因子通過上調miR-29b表達調節抗凋亡蛋白水平誘導胰島β細胞凋亡，從而促進1型糖尿病的發生[18]，提示miR-29b在糖尿病及其并發癥中可能發揮重要作用。目前關于miR-29b對糖尿病足創面愈合的影響及其可能機制罕見報道。本研究中，我們發現α硫辛酸會降低創面組織中miR-29b表達水平；對經α硫辛酸處理的糖尿病模型小鼠分別注射慢病毒包裝的miR-29b mimic及其陰性對照后，發現與NC組相比，miR-29b mimic能顯著抑制小鼠創面愈合。進一步研究發現，miR-29b mimic同樣可抑制α硫辛酸處理糖尿病足模型小鼠SOD和GSH的水平，表明miR-29b可能通過調節氧化應激水平參與糖尿病足的創面愈合。
綜上述，α硫辛酸可降低糖尿病足創面組織miR-29b的表達，并通過抑制miR-29b的表達降低創面氧化應激水平，從而促進糖尿病足的創面愈合。本研究結果為明確α硫辛酸保護和治療糖尿病足機制提供了實驗依據，也為miR-29b作為預防和治療糖尿病及其并發癥的分子靶點提供了思路。
