引用本文： 陳渝, 鄧忠良, 翁政, 陳詩謀, 童偉. NGF/MAG雙基因共表達腺病毒修復大鼠周圍神經損傷的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(8): 1026-1033. doi: 10.7507/1002-1892.20160206 復制
髓磷脂相關糖蛋白（myelin associated glycoprotein，MAG）是髓磷脂的重要組成部分，是神經軸突再生的強力抑制因子。研究顯示，在慢性壓縮性神經損傷誘發的神經軸突萌芽中MAG表達下降[1]。體外實驗發現，MAG不僅抑制神經軸突生長，也能有效降低周圍神經損傷后軸突異常分支形成[2]。NGF可有效促進神經生長，但新生神經組織結構紊亂，神經功能恢復差[3-4]。能否通過NGF與MAG二者協同作用，達到既促進受損神經組織修復，又抑制神經軸突異常增生，從而促進神經組織結構修復和功能重建，目前尚罕見相關報道。本研究擬構建NGF/MAG雙基因共表達腺病毒（adenovirus exp res sing NGF and MAG，Ad-NGF-MAG），探討其在大鼠坐骨神經損傷修復與再生中的作用。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
雄性SD大鼠37只，體質量180～200 g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供。人HEK293細胞株由重慶醫科大學病理生理研究室提供。
5型腺病毒穿梭質粒pCA13、骨架質粒pBHGE3（Microbix Biosystems公司，加拿大）；核酸限制性內切酶XbaⅠ、NheⅠ、BamHⅠ、SalⅠ、EcoRⅠ、ClaⅠ以及T4 DNA連接酶（TaKaRa公司，日本）；溶菌酶、氯化銫（Sigma公司，美國）；Taq DNA聚合酶（Promega公司，美國）；丙烯酰胺、N’N’-亞甲基雙丙烯酰胺、Tris-base、甘氨酸、SDS（Amresco公司，美國）；瓊脂糖凝膠（BIOWEST公司，法國）；Trizol、脂質體LTX and Plus（LIPOFECTAMINETM LTX and Plus Reagent）RNase A、M-MLV Reverse Transcriptase、Ribonuclerase Inhibitor、Lipofectamine2000轉染試劑（Invitrogen公司，美國）；TritonX-100（Fluka公司，美國）；Anti-MAG（ab89780）、Anti-NGF（ab6199）一抗（Abcam公司，英國）；anti-β-GAPDH一抗（ProteinTech公司，美國）；DL2000、DL15000、MarkerⅢ、質粒小量提取試劑盒和大量提取試劑盒、DNA快速純化回收試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]；山羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）；EasyPfu DNA Polymerase（北京全式金生物技術有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒[威格拉斯生物技術（北京）有限公司]。
冷凍臺式離心機（Hettich公司，德國）；MJ PTC-100型PCR儀（東勝創新生物科技有限公司）；CO2培養箱、Nanodrop 1000型分光光度計（Thermo Scientific公司，美國）；—80℃冰箱（Sanyo公司，日本）；TE2000-U顯微鏡（Nikon公司，日本）；BX51顯微鏡（Olympus公司，日本）；JEM1230透射電鏡（JEOL公司，日本）；MYTO肌電圖儀（Esaote公司，意大利）；HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖像分析系統（武漢長海科技有限責任公司）；電泳儀（北京市六一儀器廠）。引物合成、測序均由上海生工生物工程有限公司完成。
1.2 構建Ad-NGF-EGFP和Ad-NGF-MAG-EGFP質粒
1.2.1 pCA13-SV40 promoter-EGFP質粒構建
通過PCR擴增分別得到XbaⅠ-SV40 promoter-NheⅠ和NheⅠ-EGFP-BamHⅠ，用XbaⅠ和NheⅠ雙酶切SV40 promoter，用NheⅠ和BamHⅠ雙酶切EGFP，并用XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切pCA13。將SV40 promoter和EGFP同時連接至pCA13，得到pCA13-SV40 promoter-EGFP質粒，并酶切鑒定。
1.2.2 pCA13-NGF-EGFP質粒構建
通過PCR擴增得到SalⅠ-NGF-EcoRⅠ，用SalⅠ和EcoRⅠ雙酶切NGF。用SalⅠ和EcoRⅠ雙酶切pCA13-SV40 promoter-EGFP質粒。將NGF連接至pCA13-SV40 promoter-EGFP，得到pCA13-NGF-EGFP質粒，并酶切鑒定。
1.2.3 大鼠MAG基因擴增
取5只SD大鼠坐骨神經，提取mRNA，逆轉錄為cDNA，使用高保真Taq酶擴增MAG基因；l%瓊脂糖凝膠電泳及基因測序觀察。
1.2.4 pCA13-NGF-MAG-EGFP質粒構建
通過PCR擴增分別得到EcoRⅠ-IRES-ClaⅠ和ClaⅠ-MAG-XbaⅠ，用EcoRⅠ和ClaⅠ雙酶切IRES，用ClaⅠ和XbaⅠ雙酶切MAG。用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切pCA13-NGF-EGFP質粒。將IRES和MAG同時連接至pCA13-NGF-EGFP后，得到pCA13-NGF-MAG-EGFP質粒，并酶切鑒定。
1.2.5 Ad-NGF及Ad-NGF-MAG包裝、鑒定、純化及滴度測定
將pCA13-NGF-EGFP、pCA13-NGF-MAG-EGFP質粒及骨架質粒pBHGE3用Lipofectamine 2000共轉染HEK293細胞株擴增，分離獲得Ad-NGF及Ad-NGF-MAG，提取病毒DNA，并以其為模板，加入鑒定引物行PCR擴增，將PCR產物于1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像分析儀上觀察。
病毒包裝后48 h，倒置熒光顯微鏡下觀察HEK293細胞。然后，收集細胞，提取HEK293細胞mRNA，并以將其逆轉錄為cDNA，RT-PCR檢測NGF和MAG mRNA表達；Western blot檢測NGF和MAG蛋白表達。氯化銫密度梯度離心法純化濃縮重組腺病毒Ad-NGF和Ad-NGF-MAG，經4℃，60 000×g高速離心6 h后，按Karbers公式計算病毒滴度。
1.3 動物模型建立及分組
取32只SD大鼠，隨機分成4組（n=8）：對照組、空病毒組（Ad組）、單獨表達NGF組（Ad-NGF組）和共表達NGF和MAG組（Ad-NGF-MAG組）。
Ad組、Ad-NGF組及Ad-NGF-MAG組參考文獻[4-5]方法制備大鼠坐骨神經損傷模型。大鼠腹腔注射5%戊巴比妥（40 mg/kg）麻醉，俯臥固定。無菌條件下于右后肢作長約2 cm斜切口，鈍性分離皮下，沿股后外側肌間隙鈍性分離至腘上緣，顯露右側坐骨神經約2 cm。距梨狀肌下緣0.8 cm處切斷坐骨神經，在l0倍手術顯微鏡下以11-0無創尼龍針線縫合，關閉切口。對照組大鼠麻醉后暴露右側坐骨神經，不作其他處理。
術后對照組于術側腓腸肌注射生理鹽水（100 μL），Ad組、Ad-NGF組和Ad-NGF-MAG組分別注射空腺病毒、Ad-NGF及Ad-NGF-MAG，劑量為1×108 PFU；隔天1次，共注射3次。所有大鼠均正常喂養。
1.4 觀測指標
1.4.1 一般情況
術后觀察大鼠步態、足趾潰瘍發生情況及切口愈合時間。
1.4.2 坐骨神經功能指數（sciatic nerve function index，SFI）檢測
1.4.3 神經電生理檢測
術后31 d，參照文獻[7]方法進行神經電生理檢測。分離各組大鼠坐骨神經、腓總神經及脛前肌，于損傷處近端置入3個相距5 mm的刺激電極，由近到遠分別標記為S1、S2、S3，刺激時使正極在神經干近端，于脛前肌肌腹中插入2個引導電極和1個接地電極。先在S1、S2處應用不同強度的電流刺激神經，記錄刺激脈沖開始時到肌肉動作電位產生所需時間（刺激神經干誘發出動作電位的潛伏期）。同樣再在S2、S3進行刺激和測定。按以下公式計算神經傳導速度（nerve conductive ve loc ity，NCV），NCV=近端刺激點與遠端刺激點的距離/（近端點刺激時誘發電位的潛伏期－遠端點刺激時誘發電位的潛伏期）。同時記錄誘發電位波幅。
1.4.4 RT-PCR檢測NGF和MAG mRNA表達
以上檢測完成后，各組大鼠以3.5%水合氯醛（1 mL/100 g）腹腔注射麻醉，固定于解剖臺，剪開腹腔、胸腔和右心耳，左心室插管，脈沖灌注泵快速灌入生理鹽水，待肝臟變白后用含3%中性甲醛、2%戊二醛的PBS灌注液（pH7.3）200 mL固定，無菌條件下切取坐骨神經吻合處及其遠端1 cm組織。采用Trizol提取坐骨神經總RNA，逆轉錄為cDNA。設計NGF和MAG的擴增引物。引物序列：NGF上游引物：5’-TGTCCCTGAAGCCCACTG-3’，下游引物：5’-TCCTTGCCCTTGATGTCC-3’，擴增片段大小為375 bp；MAG上游引物：5’-GTGGCAGGAACGGAAGTA-3’，下游引物：5’-CATCCCGCATCCAAGTCA-3’，擴增片段大小為382 bp。PCR產物在1%瓊脂糖凝膠電泳，90 V電壓電泳，EB染色，凝膠數字掃描成像系統照相并測定條帶積分吸光度（IA）值。
1.4.5 Western blot檢測NGF和MAG蛋白表達
取1.4.4獲得的各組部分神經標本，按照100 mg神經組織：1 mL細胞裂解液的比例，4℃冰浴勻漿，提取總蛋白，進行蛋白定量。每孔加入40 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，將分離后的蛋白條帶轉至硝酸纖維膜上，封閉液室溫封閉2 h，按1：200分別加入兔抗鼠NGF多克隆抗體、兔抗鼠MAG多克隆抗體和兔抗鼠GAPDH多克隆抗體，37℃孵育2 h，PBST洗膜，按1：400加入二抗，37℃孵育2 h，化學發光試劑反應2 min，發光成像儀成像并測定條帶灰度值。
1.4.6 組織學觀測
取1.4.4獲得的各組部分神經標本置于10%甲醛固定，常規石蠟包埋，縱行連續切片，片厚5 μm。常規HE染色，于鏡下觀察神經纖維層次、斷端神經纖維再生及局部神經纖維髓鞘再生情況，非神經細胞、無髓和有髓神經軸突再生情況。采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖像分析系統，測量神經橫切面軸突直徑、髓鞘厚度，并行神經纖維計數。
1.5 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 重組質粒及腺病毒鑒定
2.1.1 pCA13-SV40 promoter-EGFP鑒定
通過XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切pCA13-SV40 promoter-EGFP質粒得到大小為6 926 bp和1 110 bp的產物SV40 promoter與EGFP；通過NheⅠ和BamHⅠ雙酶切pCA13-SV40 promoter-EGFP質粒得到大小為7 310 bp和726 bp的產物EGFP；通過XbaⅠ和NheⅠ雙酶切pCA13-SV40 promoter-EGFP質粒得到大小為7 652 bp和384 bp的產物SV40 promoter；酶切結果顯示SV40 promoter和EGFP正確構建至pCA13載體。見圖 1a。
圖1
各質粒酶切鑒定結果???pCA13-SV40 promoter-EGFP質粒酶切鑒定M：Marker 1：XbaⅠ、BamHⅠ雙酶切pCA13-SV40 promoter-EGFP質粒產物2：NheⅠ、BamHⅠ雙酶切pCA13-SV40 promoter-EGFP質粒產物3：XbaⅠ、NheⅠ雙酶切pCA13-SV40 promoter-EGFP質粒產物??? pCA13-NGF-EGFP質粒酶切鑒定M：Marker 1、2：SalⅠ、EcoRⅠ雙酶切pCA13-NGF-EGFP質粒產物???PCR擴增大鼠神經組織內MAG基因M：Marker???大鼠神經組織內MAG基因測序鑒定??? pCA13-NGF-MAG-EGFP質粒酶切鑒定M：Marker 1：ClaⅠ、XbaⅠ雙酶切pCA13-NGF-MAG-EGFP質粒產物??2：SalⅠ、ClaⅠ雙酶切pCA13-NGF-MAG-EGFP質粒產物??3：HindⅢ、ClaⅠ雙酶切pCA13-NGF-MAG-EGFP質粒產物??圖 2? HEK293細胞表達綠色熒光（倒置熒光顯微鏡×100）???Ad-NGF???Ad-NGF-MAG
Figure1.
The identification of plasmid by enzyme digestion???The identification of pCA13-SV40 promoter-EGFP plasmid by enzyme digestion M: Marker 1: The production of pCA13-SV40 promoter-EGFP plasmid by Xba Ⅰ and BamH Ⅰ 2: The production of pCA13-SV40 promoter-EGFP plasmid by Nhe Ⅰ and BamH Ⅰ 3: The production of pCA13-SV40 promoter-EGFP plasmid by Xba Ⅰ and Nhe Ⅰ??? The identification of pCA13-NGF-EGFP plasmid by enzyme digestion M: Marker 1, 2: The production of pCA13-NGF-EGFP plasmid by Sal Ⅰ and EcoR Ⅰ???The amplification of MAG gene in rat nerve tissue by PCR M: Marker???DNA sequence identification of MAG gene???The identification of pCA13-NGF-MAG-EGFP plasmid by enzyme digestion M: Marker 1: The production of pCA13-NGF-MAG-EGFP plasmid by Cla Ⅰ and Xba Ⅰ 2: The production of pCA13-NGF-MAG-EGFP plasmid by Sal Ⅰ and Cla Ⅰ 3: The production of pCA13-NGF-MAG-EGFP plasmid by Hind Ⅲ and Cla Ⅰ ?Fig. 2 The expression of EGFP in HEK293 cells (Inverted fluorescence microscope×100)???Ad-NGF???Ad-NGF-MAG
2.1.2 pCA13-NGF-EGFP質粒鑒定
通過SalⅠ和EcoRⅠ雙酶切pCA13-NGF-EGFP質粒得到大小為8 030 bp和726 bp的產物NGF；酶切結果顯示NGF正確構建至pCA13-SV40 promoter-EGFP載體（圖 1b）。
2.1.3 大鼠MAG基因鑒定
通過PCR從大鼠神經組織內擴增MAG基因。電泳結果顯示得到大小為1 881 bp的條帶（圖 1c）。將PCR產物回收后進行測序，測序結果表明其為大鼠MAG基因（圖 1d）。
2.1.4 pCA13-NGF-MAG-EGFP質粒鑒定
通過ClaⅠ和XbaⅠ雙酶切pCA13-NGF-MAG-EGFP質粒得到大小為9 359 bp和1 881 bp的產物MAG；通過SalⅠ和ClaⅠ雙酶切pCA13-NGF-MAG-EGFP質粒得到大小為9 910 bp和1 335 bp的產物NGF和IRES；通過HindⅢ和ClaⅠ雙酶切pCA13-NGF-MAG-EGFP質粒得到產物大小為10 893 bp和352 bp的部分IRES（圖 1e）；酶切結果顯示IRES和MAG正確構建至pCA13-NGF-EGFP載體。
2.1.5 Ad-NGF和Ad-NGF-MAG包裝、鑒定、純化及滴度測定
病毒包裝后48 h，倒置熒光顯微鏡下可見大量綠色熒光，HEK293細胞變圓腫脹、透亮和成團漂浮（圖 2）。
RT-PCR及Western blot檢測示，Ad-NGF-MAG病毒感染的細胞內檢測出MAG mRNA及蛋白表達；Ad-NGF和Ad-NGF-MAG病毒感染的細胞內均能檢測NGF mRNA及蛋白表達。見圖 3、4。
圖3
RT-PCR檢測Ad-NGF或Ad-NGF-MAG感染HEK293細胞后MAG和NGF mRNA表達?1：Ad組?2：Ad-NGF組?3：Ad-NGF-MAG組??圖 4? Western blot檢測Ad-NGF或Ad-NGF-MAG感染HEK293細胞后MAG和NGF蛋白表達?1：Ad組?2：Ad-NGF組?3：Ad-NGF-MAG組??圖 5? RT-PCR檢測各組NGF和MAG mRNA表達?1：對照組?2：Ad組?3：Ad-NGF組?4：Ad-NGF-MAG組??圖 6? Western blot檢測各組NGF和MAG蛋白表達1：對照組2：Ad組?3：Ad-NGF組?4：Ad-NGF-MAG組??圖 7?各組組織學觀察（HE×100）???對照組???Ad組???Ad-NGF組???Ad-NGF-MAG組
Figure3.
The mRNA expressions of NGF and MAG in HEK293 cells transfected with Ad-NGF or Ad-NGF-MAG by RT-PCR 1: Ad group 2: Ad-NGF group 3: Ad-NGF-MAG group ?Fig.4 The protein expressions of NGF and MAG in HEK293 cells transfected with Ad-NGF or Ad-NGF-MAG by Western blot 1: Ad group 2: Ad-NGF group 3: Ad-NGF-MAG group ?Fig.5 The mRNA expressions of NGF and MAG in each group by RT-PCR 1: Control group 2: Ad group 3: Ad-NGF group 4: Ad-NGF-MAG group ?Fig.6 The protein expressions of NGF and MAG in each group by Western blot 1: Control group 2: Ad group 3: Ad-NGF group 4: Ad-NGF-MAG group ?Fig.7 The histological observation of sciatic nerve in each group (HE×100)???Control group???Ad group???Ad-NGF group???Ad-NGF-MAG group
氯化銫密度梯度離心法純化濃縮重組腺病毒Ad-NGF和Ad-NGF-MAG，離心后可見白色病毒層。按Karbers公式計算病毒滴度，Ad-NGF為7.3× 108 PFU/mL，Ad-NGF-MAG為8.56×108 PFU/ mL。
2.2 一般情況
32只大鼠術后均成活，切口Ⅰ期愈合，無感染發生。模型制備后，Ad組、Ad-NGF組和Ad-NGF-MAG組大鼠即出現術側后肢跛行、腳趾并攏；術后3周開始出現足部皮膚紅腫、足跟潰瘍等失神經支配表現，損傷神經支配區域肌肉萎縮明顯；術后4周Ad-NGF-MAG組大鼠足部皮膚紅腫消失，感覺障礙、肌肉萎縮程度較Ad組和Ad-NGF組輕。
2.3 SFI檢測
對照組、Ad組、Ad-NGF組、Ad-NGF-MAG組的SFI分別為—9.62±1.86、—49.26±2.93、—34.99±2.15、—28.66±1.91。Ad-NGF-MAG組明顯優于Ad組和Ad-NGF組，但未達對照組水平，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。
2.4 神經電生理檢測
神經電生理檢測顯示Ad-NGF-MAG組NCV、誘發電位波幅、潛伏期均明顯優于Ad-NGF組和Ad組，但未達對照組水平，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表 1。
表1
各組神經電生理檢測結果（n=8，2.5 RT-PCR檢測NGF與MAG mRNA表達
RT-PCR檢測顯示，對照組、Ad組、Ad-NGF組、Ad-NGF-MAG組MAG mRNA相對表達量分別為22.02±0.20、18.23±0.12、20.62±0.08、72.82±0.41；NGF mRNA相對表達量分別為19.46±0.16、17.41±0.09、71.32±0.11、74.53±0.53。Ad-NGF-MAG組MAG mRNA相對表達量最高，對照組高于Ad組和Ad-NGF組；Ad-NGF組和Ad-NGF-MAG組NGF mRNA相對表達量均高于對照組和Ad組；組間MAG及NGF mRNA相對表達量比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 5。
2.6 Western blot檢測NGF與MAG蛋白表達
Weatern blot檢測顯示，對照組、Ad組、Ad-NGF組、Ad-NGF-MAG組MAG蛋白相對表達量分別為51.31±0.88、23.25±1.35、25.61±1.10、68.74±1.89；NGF蛋白相對表達量分別為24.57±1.52、22.86±1.44、51.48±1.36、54.15±2.59。Ad-NGF-MAG組MAG蛋白表達最高，對照組高于Ad組和Ad-NGF組；Ad-NGF組和Ad-NGF-MAG組NGF蛋白表達均高于對照組和Ad組；組間MAG及NGF蛋白相對表達量比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 6。
2.7 組織學觀測
組織學觀察顯示，對照組神經連續性好；Ad組神經纖維層次混亂，斷端神經纖維再生差，斷端神經纖維基本無聯系，且局部可見較多炎性細胞浸潤，局部神經纖維髓鞘再生不明顯；Ad-NGF組神經纖維層次結構清晰，局部斷端再生良好，部分神經纖維已經形成聯系，神經纖維髓鞘再生良好，未見明顯炎性細胞浸潤，但神經纖維結構紊亂；Ad-NGF-MAG組神經纖維生長有序，神經直徑較Ad-NGF組粗，神經纖維結構良好。見圖 7。
Ad-NGF-MAG組神經纖維數、軸突直徑、髓鞘厚度均優于Ad組和Ad-NGF組，但尚未達對照組正常水平，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表 2。
表2
各組神經纖維計數及軸突直徑、髓鞘厚度比較（n=8，3 討論
周圍神經發生截斷性損傷后，在損傷遠端雪旺細胞釋放的多種神經因子誘導下，神經損傷部位會生長出大量神經軸突分支以促進神經纖維再生。由于新生神經軸突分支缺乏正確識別遠端雪旺細胞的能力，會向不同的雪旺細胞延伸，導致神經過度支配、神經錯誤連接，影響神經生理功能恢復。因此，神經軸突分支能否與遠端雪旺細胞正確連接，對于神經生理功能恢復至關重要。
MAG選擇性定位于雪旺細胞和少突膠質細胞膜，屬于免疫球蛋白超家族成員，包括5個細胞外免疫球蛋白樣區域、1個胞內區域和1個跨膜區域，其抑制作用的位點是在Ig5區[7]。既往報道主要關注于MAG的體外軸突抑制作用，但DeBellard等[8]認為MAG對不同神經元有不同作用，并且在雪旺細胞與軸突的相互作用以及維持軸突、髓鞘等方面起重要作用。在周圍神經系統中，MAG作為一種黏附分子能促進神經細胞遷移，介導膠質細胞、軸突間的交流，在早期主要參與調控軸突生長導向，促進軸突生長，后期則表現為抑制軸突過度生長[9]。MAG通過與神經元及軸突胞膜上表達的NgR受體復合體結合啟動抑制信號的跨膜轉導[10]，并通過Rho/Rho激酶通路發揮作用[11]，對軸突生長表現為雙向調節作用[12]。研究發現，MAG可促進軸突成熟、存活及髓鞘能力[13]，也可抑制軸突過度生長。Tomita等[2]在切斷大鼠坐骨神經后局部應用MAG，結果顯示其能促進神經功能恢復，而且抑制了軸突的異常分支生長，并非單純使軸突生長錐塌陷抑制軸突生長。
NGF是神經系統最重要的活性物質之一，對神經系統的發育及促進再生等具有重要作用[14]。NGF可促進神經損傷后再生，但同時也存在新生神經纖維排列紊亂，分支較多，纖維細小，神經生理功能恢復差等問題[15-17]。由此可見，單獨使用NGF雖可促進神經纖維組織損傷后再生，但神經纖維功能卻恢復不佳；MAG具有雙向調節神經生長功能，有利于神經功能恢復[18]。據此本實驗探討了以腺病毒為載體，將NGF和MAG通過腺病毒載體共同導入損傷部位，觀察NGF和MAG持續性共同表達在神經損傷修復中的效果。結果顯示，與Ad組相比，Ad-NGF組和Ad-NGF-MAG組神經纖維再生明顯，但Ad-NGF組新生神經纖維排列紊亂，Ad-NGF-MAG組新生神經纖維排列整齊；神經電生理檢測顯示Ad-NGF-MAG組NCV和誘發電位波幅均優于Ad-NGF組，表明Ad-NGF-MAG組神經電生理功能恢復優于Ad-NGF組；同時Ad-NGF-MAG組SFI顯著優于Ad-NGF組，提示Ad-NGF-MAG組坐骨神經生理功能優于Ad-NGF組。
綜上述，在坐骨神經損傷后修復再生過程中，腺病毒介導NGF與MAG共表達，既可促進神經纖維生長，又可抑制神經異常分支形成，共同促進神經結構與功能的恢復，為進一步探討周圍神經損傷后修復奠定了實驗基礎。
髓磷脂相關糖蛋白（myelin associated glycoprotein，MAG）是髓磷脂的重要組成部分，是神經軸突再生的強力抑制因子。研究顯示，在慢性壓縮性神經損傷誘發的神經軸突萌芽中MAG表達下降[1]。體外實驗發現，MAG不僅抑制神經軸突生長，也能有效降低周圍神經損傷后軸突異常分支形成[2]。NGF可有效促進神經生長，但新生神經組織結構紊亂，神經功能恢復差[3-4]。能否通過NGF與MAG二者協同作用，達到既促進受損神經組織修復，又抑制神經軸突異常增生，從而促進神經組織結構修復和功能重建，目前尚罕見相關報道。本研究擬構建NGF/MAG雙基因共表達腺病毒（adenovirus exp res sing NGF and MAG，Ad-NGF-MAG），探討其在大鼠坐骨神經損傷修復與再生中的作用。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
雄性SD大鼠37只，體質量180～200 g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供。人HEK293細胞株由重慶醫科大學病理生理研究室提供。
5型腺病毒穿梭質粒pCA13、骨架質粒pBHGE3（Microbix Biosystems公司，加拿大）；核酸限制性內切酶XbaⅠ、NheⅠ、BamHⅠ、SalⅠ、EcoRⅠ、ClaⅠ以及T4 DNA連接酶（TaKaRa公司，日本）；溶菌酶、氯化銫（Sigma公司，美國）；Taq DNA聚合酶（Promega公司，美國）；丙烯酰胺、N’N’-亞甲基雙丙烯酰胺、Tris-base、甘氨酸、SDS（Amresco公司，美國）；瓊脂糖凝膠（BIOWEST公司，法國）；Trizol、脂質體LTX and Plus（LIPOFECTAMINETM LTX and Plus Reagent）RNase A、M-MLV Reverse Transcriptase、Ribonuclerase Inhibitor、Lipofectamine2000轉染試劑（Invitrogen公司，美國）；TritonX-100（Fluka公司，美國）；Anti-MAG（ab89780）、Anti-NGF（ab6199）一抗（Abcam公司，英國）；anti-β-GAPDH一抗（ProteinTech公司，美國）；DL2000、DL15000、MarkerⅢ、質粒小量提取試劑盒和大量提取試劑盒、DNA快速純化回收試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]；山羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）；EasyPfu DNA Polymerase（北京全式金生物技術有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒[威格拉斯生物技術（北京）有限公司]。
冷凍臺式離心機（Hettich公司，德國）；MJ PTC-100型PCR儀（東勝創新生物科技有限公司）；CO2培養箱、Nanodrop 1000型分光光度計（Thermo Scientific公司，美國）；—80℃冰箱（Sanyo公司，日本）；TE2000-U顯微鏡（Nikon公司，日本）；BX51顯微鏡（Olympus公司，日本）；JEM1230透射電鏡（JEOL公司，日本）；MYTO肌電圖儀（Esaote公司，意大利）；HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖像分析系統（武漢長海科技有限責任公司）；電泳儀（北京市六一儀器廠）。引物合成、測序均由上海生工生物工程有限公司完成。
1.2 構建Ad-NGF-EGFP和Ad-NGF-MAG-EGFP質粒
1.2.1 pCA13-SV40 promoter-EGFP質粒構建
通過PCR擴增分別得到XbaⅠ-SV40 promoter-NheⅠ和NheⅠ-EGFP-BamHⅠ，用XbaⅠ和NheⅠ雙酶切SV40 promoter，用NheⅠ和BamHⅠ雙酶切EGFP，并用XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切pCA13。將SV40 promoter和EGFP同時連接至pCA13，得到pCA13-SV40 promoter-EGFP質粒，并酶切鑒定。
1.2.2 pCA13-NGF-EGFP質粒構建
通過PCR擴增得到SalⅠ-NGF-EcoRⅠ，用SalⅠ和EcoRⅠ雙酶切NGF。用SalⅠ和EcoRⅠ雙酶切pCA13-SV40 promoter-EGFP質粒。將NGF連接至pCA13-SV40 promoter-EGFP，得到pCA13-NGF-EGFP質粒，并酶切鑒定。
1.2.3 大鼠MAG基因擴增
取5只SD大鼠坐骨神經，提取mRNA，逆轉錄為cDNA，使用高保真Taq酶擴增MAG基因；l%瓊脂糖凝膠電泳及基因測序觀察。
1.2.4 pCA13-NGF-MAG-EGFP質粒構建
通過PCR擴增分別得到EcoRⅠ-IRES-ClaⅠ和ClaⅠ-MAG-XbaⅠ，用EcoRⅠ和ClaⅠ雙酶切IRES，用ClaⅠ和XbaⅠ雙酶切MAG。用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切pCA13-NGF-EGFP質粒。將IRES和MAG同時連接至pCA13-NGF-EGFP后，得到pCA13-NGF-MAG-EGFP質粒，并酶切鑒定。
1.2.5 Ad-NGF及Ad-NGF-MAG包裝、鑒定、純化及滴度測定
將pCA13-NGF-EGFP、pCA13-NGF-MAG-EGFP質粒及骨架質粒pBHGE3用Lipofectamine 2000共轉染HEK293細胞株擴增，分離獲得Ad-NGF及Ad-NGF-MAG，提取病毒DNA，并以其為模板，加入鑒定引物行PCR擴增，將PCR產物于1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像分析儀上觀察。
病毒包裝后48 h，倒置熒光顯微鏡下觀察HEK293細胞。然后，收集細胞，提取HEK293細胞mRNA，并以將其逆轉錄為cDNA，RT-PCR檢測NGF和MAG mRNA表達；Western blot檢測NGF和MAG蛋白表達。氯化銫密度梯度離心法純化濃縮重組腺病毒Ad-NGF和Ad-NGF-MAG，經4℃，60 000×g高速離心6 h后，按Karbers公式計算病毒滴度。
1.3 動物模型建立及分組
取32只SD大鼠，隨機分成4組（n=8）：對照組、空病毒組（Ad組）、單獨表達NGF組（Ad-NGF組）和共表達NGF和MAG組（Ad-NGF-MAG組）。
Ad組、Ad-NGF組及Ad-NGF-MAG組參考文獻[4-5]方法制備大鼠坐骨神經損傷模型。大鼠腹腔注射5%戊巴比妥（40 mg/kg）麻醉，俯臥固定。無菌條件下于右后肢作長約2 cm斜切口，鈍性分離皮下，沿股后外側肌間隙鈍性分離至腘上緣，顯露右側坐骨神經約2 cm。距梨狀肌下緣0.8 cm處切斷坐骨神經，在l0倍手術顯微鏡下以11-0無創尼龍針線縫合，關閉切口。對照組大鼠麻醉后暴露右側坐骨神經，不作其他處理。
術后對照組于術側腓腸肌注射生理鹽水（100 μL），Ad組、Ad-NGF組和Ad-NGF-MAG組分別注射空腺病毒、Ad-NGF及Ad-NGF-MAG，劑量為1×108 PFU；隔天1次，共注射3次。所有大鼠均正常喂養。
1.4 觀測指標
1.4.1 一般情況
術后觀察大鼠步態、足趾潰瘍發生情況及切口愈合時間。
1.4.2 坐骨神經功能指數（sciatic nerve function index，SFI）檢測
1.4.3 神經電生理檢測
術后31 d，參照文獻[7]方法進行神經電生理檢測。分離各組大鼠坐骨神經、腓總神經及脛前肌，于損傷處近端置入3個相距5 mm的刺激電極，由近到遠分別標記為S1、S2、S3，刺激時使正極在神經干近端，于脛前肌肌腹中插入2個引導電極和1個接地電極。先在S1、S2處應用不同強度的電流刺激神經，記錄刺激脈沖開始時到肌肉動作電位產生所需時間（刺激神經干誘發出動作電位的潛伏期）。同樣再在S2、S3進行刺激和測定。按以下公式計算神經傳導速度（nerve conductive ve loc ity，NCV），NCV=近端刺激點與遠端刺激點的距離/（近端點刺激時誘發電位的潛伏期－遠端點刺激時誘發電位的潛伏期）。同時記錄誘發電位波幅。
1.4.4 RT-PCR檢測NGF和MAG mRNA表達
以上檢測完成后，各組大鼠以3.5%水合氯醛（1 mL/100 g）腹腔注射麻醉，固定于解剖臺，剪開腹腔、胸腔和右心耳，左心室插管，脈沖灌注泵快速灌入生理鹽水，待肝臟變白后用含3%中性甲醛、2%戊二醛的PBS灌注液（pH7.3）200 mL固定，無菌條件下切取坐骨神經吻合處及其遠端1 cm組織。采用Trizol提取坐骨神經總RNA，逆轉錄為cDNA。設計NGF和MAG的擴增引物。引物序列：NGF上游引物：5’-TGTCCCTGAAGCCCACTG-3’，下游引物：5’-TCCTTGCCCTTGATGTCC-3’，擴增片段大小為375 bp；MAG上游引物：5’-GTGGCAGGAACGGAAGTA-3’，下游引物：5’-CATCCCGCATCCAAGTCA-3’，擴增片段大小為382 bp。PCR產物在1%瓊脂糖凝膠電泳，90 V電壓電泳，EB染色，凝膠數字掃描成像系統照相并測定條帶積分吸光度（IA）值。
1.4.5 Western blot檢測NGF和MAG蛋白表達
取1.4.4獲得的各組部分神經標本，按照100 mg神經組織：1 mL細胞裂解液的比例，4℃冰浴勻漿，提取總蛋白，進行蛋白定量。每孔加入40 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，將分離后的蛋白條帶轉至硝酸纖維膜上，封閉液室溫封閉2 h，按1：200分別加入兔抗鼠NGF多克隆抗體、兔抗鼠MAG多克隆抗體和兔抗鼠GAPDH多克隆抗體，37℃孵育2 h，PBST洗膜，按1：400加入二抗，37℃孵育2 h，化學發光試劑反應2 min，發光成像儀成像并測定條帶灰度值。
1.4.6 組織學觀測
取1.4.4獲得的各組部分神經標本置于10%甲醛固定，常規石蠟包埋，縱行連續切片，片厚5 μm。常規HE染色，于鏡下觀察神經纖維層次、斷端神經纖維再生及局部神經纖維髓鞘再生情況，非神經細胞、無髓和有髓神經軸突再生情況。采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖像分析系統，測量神經橫切面軸突直徑、髓鞘厚度，并行神經纖維計數。
1.5 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 重組質粒及腺病毒鑒定
2.1.1 pCA13-SV40 promoter-EGFP鑒定
通過XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切pCA13-SV40 promoter-EGFP質粒得到大小為6 926 bp和1 110 bp的產物SV40 promoter與EGFP；通過NheⅠ和BamHⅠ雙酶切pCA13-SV40 promoter-EGFP質粒得到大小為7 310 bp和726 bp的產物EGFP；通過XbaⅠ和NheⅠ雙酶切pCA13-SV40 promoter-EGFP質粒得到大小為7 652 bp和384 bp的產物SV40 promoter；酶切結果顯示SV40 promoter和EGFP正確構建至pCA13載體。見圖 1a。
圖1
各質粒酶切鑒定結果???pCA13-SV40 promoter-EGFP質粒酶切鑒定M：Marker 1：XbaⅠ、BamHⅠ雙酶切pCA13-SV40 promoter-EGFP質粒產物2：NheⅠ、BamHⅠ雙酶切pCA13-SV40 promoter-EGFP質粒產物3：XbaⅠ、NheⅠ雙酶切pCA13-SV40 promoter-EGFP質粒產物??? pCA13-NGF-EGFP質粒酶切鑒定M：Marker 1、2：SalⅠ、EcoRⅠ雙酶切pCA13-NGF-EGFP質粒產物???PCR擴增大鼠神經組織內MAG基因M：Marker???大鼠神經組織內MAG基因測序鑒定??? pCA13-NGF-MAG-EGFP質粒酶切鑒定M：Marker 1：ClaⅠ、XbaⅠ雙酶切pCA13-NGF-MAG-EGFP質粒產物??2：SalⅠ、ClaⅠ雙酶切pCA13-NGF-MAG-EGFP質粒產物??3：HindⅢ、ClaⅠ雙酶切pCA13-NGF-MAG-EGFP質粒產物??圖 2? HEK293細胞表達綠色熒光（倒置熒光顯微鏡×100）???Ad-NGF???Ad-NGF-MAG
Figure1.
The identification of plasmid by enzyme digestion???The identification of pCA13-SV40 promoter-EGFP plasmid by enzyme digestion M: Marker 1: The production of pCA13-SV40 promoter-EGFP plasmid by Xba Ⅰ and BamH Ⅰ 2: The production of pCA13-SV40 promoter-EGFP plasmid by Nhe Ⅰ and BamH Ⅰ 3: The production of pCA13-SV40 promoter-EGFP plasmid by Xba Ⅰ and Nhe Ⅰ??? The identification of pCA13-NGF-EGFP plasmid by enzyme digestion M: Marker 1, 2: The production of pCA13-NGF-EGFP plasmid by Sal Ⅰ and EcoR Ⅰ???The amplification of MAG gene in rat nerve tissue by PCR M: Marker???DNA sequence identification of MAG gene???The identification of pCA13-NGF-MAG-EGFP plasmid by enzyme digestion M: Marker 1: The production of pCA13-NGF-MAG-EGFP plasmid by Cla Ⅰ and Xba Ⅰ 2: The production of pCA13-NGF-MAG-EGFP plasmid by Sal Ⅰ and Cla Ⅰ 3: The production of pCA13-NGF-MAG-EGFP plasmid by Hind Ⅲ and Cla Ⅰ ?Fig. 2 The expression of EGFP in HEK293 cells (Inverted fluorescence microscope×100)???Ad-NGF???Ad-NGF-MAG
2.1.2 pCA13-NGF-EGFP質粒鑒定
通過SalⅠ和EcoRⅠ雙酶切pCA13-NGF-EGFP質粒得到大小為8 030 bp和726 bp的產物NGF；酶切結果顯示NGF正確構建至pCA13-SV40 promoter-EGFP載體（圖 1b）。
2.1.3 大鼠MAG基因鑒定
通過PCR從大鼠神經組織內擴增MAG基因。電泳結果顯示得到大小為1 881 bp的條帶（圖 1c）。將PCR產物回收后進行測序，測序結果表明其為大鼠MAG基因（圖 1d）。
2.1.4 pCA13-NGF-MAG-EGFP質粒鑒定
通過ClaⅠ和XbaⅠ雙酶切pCA13-NGF-MAG-EGFP質粒得到大小為9 359 bp和1 881 bp的產物MAG；通過SalⅠ和ClaⅠ雙酶切pCA13-NGF-MAG-EGFP質粒得到大小為9 910 bp和1 335 bp的產物NGF和IRES；通過HindⅢ和ClaⅠ雙酶切pCA13-NGF-MAG-EGFP質粒得到產物大小為10 893 bp和352 bp的部分IRES（圖 1e）；酶切結果顯示IRES和MAG正確構建至pCA13-NGF-EGFP載體。
2.1.5 Ad-NGF和Ad-NGF-MAG包裝、鑒定、純化及滴度測定
病毒包裝后48 h，倒置熒光顯微鏡下可見大量綠色熒光，HEK293細胞變圓腫脹、透亮和成團漂浮（圖 2）。
RT-PCR及Western blot檢測示，Ad-NGF-MAG病毒感染的細胞內檢測出MAG mRNA及蛋白表達；Ad-NGF和Ad-NGF-MAG病毒感染的細胞內均能檢測NGF mRNA及蛋白表達。見圖 3、4。
圖3
RT-PCR檢測Ad-NGF或Ad-NGF-MAG感染HEK293細胞后MAG和NGF mRNA表達?1：Ad組?2：Ad-NGF組?3：Ad-NGF-MAG組??圖 4? Western blot檢測Ad-NGF或Ad-NGF-MAG感染HEK293細胞后MAG和NGF蛋白表達?1：Ad組?2：Ad-NGF組?3：Ad-NGF-MAG組??圖 5? RT-PCR檢測各組NGF和MAG mRNA表達?1：對照組?2：Ad組?3：Ad-NGF組?4：Ad-NGF-MAG組??圖 6? Western blot檢測各組NGF和MAG蛋白表達1：對照組2：Ad組?3：Ad-NGF組?4：Ad-NGF-MAG組??圖 7?各組組織學觀察（HE×100）???對照組???Ad組???Ad-NGF組???Ad-NGF-MAG組
Figure3.
The mRNA expressions of NGF and MAG in HEK293 cells transfected with Ad-NGF or Ad-NGF-MAG by RT-PCR 1: Ad group 2: Ad-NGF group 3: Ad-NGF-MAG group ?Fig.4 The protein expressions of NGF and MAG in HEK293 cells transfected with Ad-NGF or Ad-NGF-MAG by Western blot 1: Ad group 2: Ad-NGF group 3: Ad-NGF-MAG group ?Fig.5 The mRNA expressions of NGF and MAG in each group by RT-PCR 1: Control group 2: Ad group 3: Ad-NGF group 4: Ad-NGF-MAG group ?Fig.6 The protein expressions of NGF and MAG in each group by Western blot 1: Control group 2: Ad group 3: Ad-NGF group 4: Ad-NGF-MAG group ?Fig.7 The histological observation of sciatic nerve in each group (HE×100)???Control group???Ad group???Ad-NGF group???Ad-NGF-MAG group
氯化銫密度梯度離心法純化濃縮重組腺病毒Ad-NGF和Ad-NGF-MAG，離心后可見白色病毒層。按Karbers公式計算病毒滴度，Ad-NGF為7.3× 108 PFU/mL，Ad-NGF-MAG為8.56×108 PFU/ mL。
2.2 一般情況
32只大鼠術后均成活，切口Ⅰ期愈合，無感染發生。模型制備后，Ad組、Ad-NGF組和Ad-NGF-MAG組大鼠即出現術側后肢跛行、腳趾并攏；術后3周開始出現足部皮膚紅腫、足跟潰瘍等失神經支配表現，損傷神經支配區域肌肉萎縮明顯；術后4周Ad-NGF-MAG組大鼠足部皮膚紅腫消失，感覺障礙、肌肉萎縮程度較Ad組和Ad-NGF組輕。
2.3 SFI檢測
對照組、Ad組、Ad-NGF組、Ad-NGF-MAG組的SFI分別為—9.62±1.86、—49.26±2.93、—34.99±2.15、—28.66±1.91。Ad-NGF-MAG組明顯優于Ad組和Ad-NGF組，但未達對照組水平，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。
2.4 神經電生理檢測
神經電生理檢測顯示Ad-NGF-MAG組NCV、誘發電位波幅、潛伏期均明顯優于Ad-NGF組和Ad組，但未達對照組水平，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表 1。
表1
各組神經電生理檢測結果（n=8，2.5 RT-PCR檢測NGF與MAG mRNA表達
RT-PCR檢測顯示，對照組、Ad組、Ad-NGF組、Ad-NGF-MAG組MAG mRNA相對表達量分別為22.02±0.20、18.23±0.12、20.62±0.08、72.82±0.41；NGF mRNA相對表達量分別為19.46±0.16、17.41±0.09、71.32±0.11、74.53±0.53。Ad-NGF-MAG組MAG mRNA相對表達量最高，對照組高于Ad組和Ad-NGF組；Ad-NGF組和Ad-NGF-MAG組NGF mRNA相對表達量均高于對照組和Ad組；組間MAG及NGF mRNA相對表達量比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 5。
2.6 Western blot檢測NGF與MAG蛋白表達
Weatern blot檢測顯示，對照組、Ad組、Ad-NGF組、Ad-NGF-MAG組MAG蛋白相對表達量分別為51.31±0.88、23.25±1.35、25.61±1.10、68.74±1.89；NGF蛋白相對表達量分別為24.57±1.52、22.86±1.44、51.48±1.36、54.15±2.59。Ad-NGF-MAG組MAG蛋白表達最高，對照組高于Ad組和Ad-NGF組；Ad-NGF組和Ad-NGF-MAG組NGF蛋白表達均高于對照組和Ad組；組間MAG及NGF蛋白相對表達量比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 6。
2.7 組織學觀測
組織學觀察顯示，對照組神經連續性好；Ad組神經纖維層次混亂，斷端神經纖維再生差，斷端神經纖維基本無聯系，且局部可見較多炎性細胞浸潤，局部神經纖維髓鞘再生不明顯；Ad-NGF組神經纖維層次結構清晰，局部斷端再生良好，部分神經纖維已經形成聯系，神經纖維髓鞘再生良好，未見明顯炎性細胞浸潤，但神經纖維結構紊亂；Ad-NGF-MAG組神經纖維生長有序，神經直徑較Ad-NGF組粗，神經纖維結構良好。見圖 7。
Ad-NGF-MAG組神經纖維數、軸突直徑、髓鞘厚度均優于Ad組和Ad-NGF組，但尚未達對照組正常水平，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表 2。
表2
各組神經纖維計數及軸突直徑、髓鞘厚度比較（n=8，3 討論
周圍神經發生截斷性損傷后，在損傷遠端雪旺細胞釋放的多種神經因子誘導下，神經損傷部位會生長出大量神經軸突分支以促進神經纖維再生。由于新生神經軸突分支缺乏正確識別遠端雪旺細胞的能力，會向不同的雪旺細胞延伸，導致神經過度支配、神經錯誤連接，影響神經生理功能恢復。因此，神經軸突分支能否與遠端雪旺細胞正確連接，對于神經生理功能恢復至關重要。
MAG選擇性定位于雪旺細胞和少突膠質細胞膜，屬于免疫球蛋白超家族成員，包括5個細胞外免疫球蛋白樣區域、1個胞內區域和1個跨膜區域，其抑制作用的位點是在Ig5區[7]。既往報道主要關注于MAG的體外軸突抑制作用，但DeBellard等[8]認為MAG對不同神經元有不同作用，并且在雪旺細胞與軸突的相互作用以及維持軸突、髓鞘等方面起重要作用。在周圍神經系統中，MAG作為一種黏附分子能促進神經細胞遷移，介導膠質細胞、軸突間的交流，在早期主要參與調控軸突生長導向，促進軸突生長，后期則表現為抑制軸突過度生長[9]。MAG通過與神經元及軸突胞膜上表達的NgR受體復合體結合啟動抑制信號的跨膜轉導[10]，并通過Rho/Rho激酶通路發揮作用[11]，對軸突生長表現為雙向調節作用[12]。研究發現，MAG可促進軸突成熟、存活及髓鞘能力[13]，也可抑制軸突過度生長。Tomita等[2]在切斷大鼠坐骨神經后局部應用MAG，結果顯示其能促進神經功能恢復，而且抑制了軸突的異常分支生長，并非單純使軸突生長錐塌陷抑制軸突生長。
NGF是神經系統最重要的活性物質之一，對神經系統的發育及促進再生等具有重要作用[14]。NGF可促進神經損傷后再生，但同時也存在新生神經纖維排列紊亂，分支較多，纖維細小，神經生理功能恢復差等問題[15-17]。由此可見，單獨使用NGF雖可促進神經纖維組織損傷后再生，但神經纖維功能卻恢復不佳；MAG具有雙向調節神經生長功能，有利于神經功能恢復[18]。據此本實驗探討了以腺病毒為載體，將NGF和MAG通過腺病毒載體共同導入損傷部位，觀察NGF和MAG持續性共同表達在神經損傷修復中的效果。結果顯示，與Ad組相比，Ad-NGF組和Ad-NGF-MAG組神經纖維再生明顯，但Ad-NGF組新生神經纖維排列紊亂，Ad-NGF-MAG組新生神經纖維排列整齊；神經電生理檢測顯示Ad-NGF-MAG組NCV和誘發電位波幅均優于Ad-NGF組，表明Ad-NGF-MAG組神經電生理功能恢復優于Ad-NGF組；同時Ad-NGF-MAG組SFI顯著優于Ad-NGF組，提示Ad-NGF-MAG組坐骨神經生理功能優于Ad-NGF組。
綜上述，在坐骨神經損傷后修復再生過程中，腺病毒介導NGF與MAG共表達，既可促進神經纖維生長，又可抑制神經異常分支形成，共同促進神經結構與功能的恢復，為進一步探討周圍神經損傷后修復奠定了實驗基礎。
